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January，2009
第 34卷第 1期
2009年 1月
川芎嗪对肾间质纤维化模型大鼠 Smad7和
SnoN蛋白表达的影响
陆 敏，周 娟，王 飞，刘煜敏，张 悦*
（上海中医药大学 科技实验中心，上海 201203）
[摘要] 目的：探讨川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)所致大鼠肾
间质纤维化的作用及机制。方法：雄性 SD大鼠 18只，随机分为 3组：假手术组、模型组以及 TMP组，每组 6只。采用单
侧输尿管结扎建立大鼠肾间质纤维化模型。川芎嗪(40 mg·kg-1·d-1)治疗 3周后取梗阻侧肾组织，分别进行 HE和Masson染色，
观察肾组织病理改变和胶原沉积的变化；采用放射免疫分析法检测 III型前胶原含量；应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测肾组
织中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)水平；采用Western blotting检测肾组织中 Smad7和 Smad转录
共抑制因子 SnoN蛋白表达水平的变化。结果：与假手术组比较，镜下可见模型组大鼠肾小管萎缩，管腔扩张，肾间质中大
量胶原纤维沉积，肾间质明显增宽；III型前胶原、TGF-β1含量显著增加；Smad7，SnoN蛋白表达水平显著下调。TMP组
与模型组比较，肾组织病理改变明显改善，III型前胶原、TGF-β1含量明显降低，Smad7，SnoN蛋白表达水平明显上调。结
论：川芎嗪具有显著抗肾间质纤维化的作用，其机制与降低肾组织中促纤维化细胞因子 TGF-β1含量，同时恢复 Smad逆向
调控因子 Smad7和 SnoN蛋白表达水平有关。
[关键词] 川芎嗪；单侧输尿管梗阻；肾间质纤维化；Smad7；SnoN
12肾间质纤维化是临床各种肾脏疾病后期的共
同病理表现之一，是影响肾功能衰竭进程的重要环
节，积极防治肾间质纤维化，对慢性肾脏疾病的转
归具有重要意义。因此，肾间质纤维化发病机制及
其防治措施的研究已成为近年来国际肾脏病学研
究的热点之一。目前，肾间质纤维化的发病机制尚
未完全阐明，已有的研究表明，各种致纤维化的细
胞因子和生长因子在其中具有重要作用，而
TGF-β1 是目前公认且已知作用最强的促纤维化因
子。随着研究的不断深入，人们发现，TGF-β1 的
活性受到多个水平调控机制的紧密调控，其中抑制
型 Smad，Smad7以及 Smad转录共抑制因子 SnoN
是其在自身细胞内的 2个重要的逆向调控因子，对
TGF-β1起到负反馈调节作用[1]。
川芎嗪是从活血祛瘀中药川芎的根茎中提取
分离的生物碱单体，化学结构为四甲基吡嗪(TMP)，

[收稿日期] 2008-06-05
[基金项目] 上海教育委员会科研项目(06cz015)；上海市教育委员会
重点学科建设项目( J50301)
[通信作者] *张悦，Tel：（021）51322391，E-mail：yuezhang_shanghai@
yahoo. com.cn
临床与药理试验均显示川芎嗪具有良好的抗纤维
化作用[2-3]，然而对于其作用机制尚未进行深入研
究。本实验应用川芎嗪对 UUO 所致肾间质纤维化
大鼠进行干预，观察其对肾间质纤维化的影响，并
以 TGF-β1 的逆向调控因子为靶点，初步探讨其作
用机制。
1 材料
1.1 药物
盐酸川芎嗪注射液(TMP,上海现代哈森药业有
限公司,批号 07010811)，用生理盐水配制成 4 g·L-1。
1.2 动物
雄性 SD大鼠 18只，SPF级，体重(170±10) g，
由中国科学院上海实验动物中心提供，合格证号
SCXK(沪)2002-0002。
1.3 试剂
III 型前胶原放免试剂盒(北京北方生物技术研
究所)；大鼠 TGF-β1 ELISA检测试剂盒(美国 ADL
公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Pierce公司)；
小鼠抗大鼠 Smad7 单克隆抗体(美国 R&D 公司)，
兔抗大鼠 SnoN多克隆抗体(美国 Santa Cruz公司)，
辣根过氧化物酶偶联的小鼠抗兔 GAPDH单克隆抗


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体(上海康成化学生物技术公司)，辣根过氧化物酶
偶联的第二抗体(晶美生物工程有限公司)；ECL化
学发光试剂盒(美国 Pierce公司)。
2 方法
2.1 动物模型制备
大鼠腹腔注射 3%戊巴比妥钠(2 mL·kg-1)麻醉，
呈左侧卧位固定于手术板上，常规消毒，打开腹腔、
腹膜，暴露并分离左侧输尿管，4-0 缝合线在左输
尿管中、上 1/3 处 2 次结扎，止血，抗感染，3-0
缝合线连续缝合关闭腹腔，间断缝合皮肤。假手术
组不结扎输尿管，其余操作过程均相同。
2.2 分组与给药
大鼠被随机分为假手术组、模型组以及 TMP
组，每组 6只。TMP组于术后第 2天以 40 mg·kg-1·d-1
TMP灌胃，假手术组及模型组均以等量生理盐水灌
胃，疗程为 3周。
2.3 肾组织病理检查
取左侧肾组织，以 10%中性福尔马林缓冲液固
定，经常规脱水、包埋、切片后分别进行 HE染色
和 Masson 胶原染色，光学显微镜下观察肾间质
病变。
2.4 III型前胶原含量的放免测定
取适量肾组织称重，加入 1 mL生理盐水匀浆，
离心(3 500 r·min-1，15 min，4 )℃ ，取上清，严格按
“III型前胶原含量放射免疫分析试剂盒”说明书进
行操作。采用 log-logit数据处理模式计算实验结果。
2.5 肾组织中 TGF-β1含量的 ELISA测定
取适量肾组织用提取缓冲液 (20 mmol·L-1
Tris-HCl，pH 7.4；2 mol·L-1 NaCl；0.1% 山梨醇甲
酯；1 mmol·L-1 EDTA；1 mmol·L-1 PMSF)匀浆，留
取上清，以 BCA 蛋白检测试剂盒检测匀浆液蛋白
浓度。严格按照 ADL 公司提供试剂盒说明书进行
实验操作。根据 TGF-β1 标准品浓度，计算组织匀
浆上清液中 TGF-β1浓度。
2.6 肾组织中 Smad7和 SnoN蛋白表达分析
采用Western blotting法。肾组织匀浆后留取上
清，用 BCA蛋白检测试剂盒测定匀浆液蛋白浓度。
取等量组织蛋白样本经 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙
烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转移至 PVDF
膜上(美国 Pierce 公司，简称标本膜)，用含 5%脱
脂奶粉的 TBST 室温封闭 1 h，然后分别与特异性
Smad7抗体(1∶500)，SnoN抗体(1∶200) 4 ℃孵育
过夜，洗膜，再与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体
室温作用 1 h，充分洗涤后，用 ECL试剂检测标本
膜上的信号，X-片记录实验结果。以计算机成像和
图像分析仪，测定 X片上杂交条带的吸光度值，代
表蛋白的表达量。同一张标本膜曝光后以 0.5% SDS
洗脱抗体，再与 GAPDH抗体(1:5 000)孵育杂交，
作为内参照。每个实验重复 3批不同样本。
2.7 统计学处理
采用 SPSS 10.0统计软件包进行 ANOVA单因
素方差分析。所有计量资料均以 ±x s表示，P<0.05
表示有显著性差异。
3 结果
3.1 各组大鼠体重增长以及肾脏质量变化情况
造模后，模型组大鼠体重增长缓慢，至处死时，
模型组大鼠体重增长明显低于假手术组与TMP组，
TMP组大鼠体重增加与假手术组无明显差异。留取
左侧肾脏时发现，模型组及 TMP 组大鼠左侧肾脏
较右侧明显增大，颜色变浅，均有尿液潴留，肾皮
质变薄，肾盂扩张。模型组与 TMP 组左肾肾体比
及左右肾重比均显著高于假手术组(P<0.01)，TMP
组与模型组无明显差异(表 1)。
表 1 各组大鼠体重增长和肾脏变化情况( ±x s，n=6)
组别 体重增长/g 左肾/肾比/% 左右肾比/%
假手术 145.67±24.34 0.82±0.05 0.95±0.08
模型 114.50±9.521） 7.09±2.261） 6.10±1.701）
TMP 139.83±13.472） 6.54±2.291） 5.71±1.681）
注：①与假手术组相比1)P<0.01；与模型组比较2)P<0.05，3)P<0.01；
②左肾/肾体比是左肾肾脏质量×2与大鼠体重之比（表2同）。

3.2 各组大鼠肾组织病理变化情况
3.2.1 HE 染色观察 镜下可见假手术组大鼠肾小
管上皮细胞排列整齐，小管与小管之间间隙紧密，
小管间质无炎细胞浸润；模型组部分肾小管萎缩，
管腔显著扩张，肾小管上皮细胞肿胀，部分坏死与
脱落，肾间质明显增宽，成纤维细胞增多，炎细胞
浸润，纤维组织增生；TMP组肾间质少量炎细胞浸
润与纤维组织增生，部分肾小管管腔轻度扩张，萎
缩的肾小管数量明显减少，肾小管上皮细胞以变性
为主，少见坏死，病变明显轻于模型组(图 1)。
3.2.2 Masson 胶原染色观察 镜下可见假手术组
胶原主要位于肾小管基底膜和小血管周围，肾间质


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A.假手术组；B.模型组；C.TMP组。
图 1 各组大鼠肾组织 HE染色结果(×200)

很少有胶原表达；模型组肾小管萎缩，管腔扩张，
肾间质中大量胶原沉积，肾间质明显增宽；TMP组
肾间质中胶原表达明显少于模型组，肾间质纤维化
程度轻于模型组(图 2)。

A.假手术组；B.模型组；C.TMP组。
图 2 各组大鼠肾组织Masson染色结果(×200)

3.3 各组大鼠肾组织 III 型前胶原和 TGF-β1 含量
比较
与假手术组比较，模型组及 TMP组 III型前胶
原含量明显增加(P<0.01)，TMP组 III型前胶原含量
较模型组显著降低(P<0.01)。
TGF-β1含量，模型组较假手术组及TMP组显
著增高(P<0.01)，TMP组与假手术组，其差异在统
计学上无意义(表 2)。
表 2 各组大鼠 III型前胶原和 TGF-β1含量
变化比较( ±x s，n=6) ng·g-1
组别 III型前胶原 TGF-β1
假手术 278.06±33.64 0.92±0.09
模型 565.26±70.751) 8.70±3.011)
TMP 387.40±47.691,3) 2.33±0.743)

3.4 各组大鼠肾组织Smad7和SnoN蛋白表达水平
比较
结果显示，与假手术组相比，模型组 Smad7 和
SnoN蛋白表达水平明显下调(P<0.01)，TMP组 Smad7
和 SnoN表达较模型组显著增加(P<0.05)(图 3)。

1.假手术组；2.模型组；3.TMP组。
图 3 各组大鼠肾组织中 Smad7和 SnoN
蛋白表达情况

4 讨论
众多研究证实，TGF-β1/Smad信号通路在肾间
质纤维化的发生、发展中具有重要作用。Smad 蛋
白是 TGF-β1 受体的胞内激酶底物，介导 TGF-β1
的胞内信号转导。Smad 蛋白根据其结构和功能不
同可分为：受体调控型 Smads，包括 Smad2 和
Smad3；Co-Smad，即 Smad4；抑制型 Smads，即
Smad6和 Smad7。Smad2和 Smad3能直接被跨膜的
TGF-β1 第一类型受体(tβRⅠ)激酶磷酸化，活化的
Smad2/Smad3与 Smad4形成复合物转移至核内，与
转录共激活剂 p300/CBP 相互作用，激活 TGF-β1
靶基因的转录。已有的研究证实，激活的
TGF-β1/Smad信号通路可参与肾间质纤维化的各个
环节，包括诱导肾实质细胞凋亡、激活肾间质成纤
维细胞、促使肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分
化 (tubular epithelial to mesenchymal transition,


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EMT)、促进细胞外基质成分的合成并抑制其降解，
导致细胞外基质过度累积，造成广泛的肾组织纤维
化[4]。UUO模型是目前国际公认的较好的肾间质纤
维化模型，本实验采用经改良的大鼠肾间质纤维化
模型[5]，造模 3 周后镜下可见梗阻侧肾组织部分肾
小管萎缩，管腔严重扩张，肾间质明显增宽，成纤
维细胞增多，炎细胞浸润，胶原纤维大量增生，肾
组织中 III型前胶原以及 TGF-β1含量显著升高，说
明 TGF-β1 信号通路已活化，肾间质纤维化模型已
制备成功。
研究发现 Smad7是 tβRⅠ激酶的拮抗蛋白，在
细胞质内 Smad7 能与 Smad2/Smad3 竞争结合活化
的 tβRⅠ，或者招募蛋白磷酸酶 1 全酶的调控和催
化亚单位 GADD34-PP1C 复合物去磷酸化 tβRⅠ，
直接或间接的减少 Smad2 和 Smad3 的活化，从而
逆向调控 TGF-β1信号[6]。SnoN是一种转录共抑制
因子，在细胞核内活化的 Smad2/3-Smad4复合物与
SnoN 相互作用，形成转录失活复合物，就能抑制
TGF-β1靶基因的转录[7]。因此，Smad7和 SnoN是
TGF-β1 信号通路中 2 个重要的逆向调控因子，它
们在组织中的表达水平最终决定了 TGF-β1的生物
效应。然而研究发现在 UUO 模型小鼠的肾组织中
Smad7 和 SnoN蛋白进行性的减少，几乎完全被激
活的 TGF-β1-Smad2/Smad3 通过泛素-蛋白酶体途
径降解 [8-9]。在本实验中，Western blotting 检测发
现，模型组大鼠 Smad7蛋白表达水平较假手术组下
降了 97%，SnoN 蛋白表达水平下降了 96%，与文
献报道相一致[10]。这些结果强烈的表明，在疾病状
态下，Smad7和 SnoN蛋白的这种缺失是放大促纤
维化的 TGF-β1 信号的重要机制，使其能不受任何
约束的转导信号，最终导致肾间质纤维化的发生。
随着对 TGF-β1/Smad信号通路的深入研究，人们发
现 Smad拮抗剂 Smad7以及 SnoN的缺失与肾纤维
化的进展有着重要联系，甚至有学者提出：Smad
拮抗剂的缺失与 TGF-β1/Smad信号的诱导、活化，
在触发肾纤维化的形成中具有相同重要的作用[11]。
国内外学者对肾间质纤维化的防治目前已取
得了一定的进展和突破，有人报道，通过转染的方
法过表达 SnoN，人近端肾小管上皮细胞就能抵御
TGF-β1诱导的EMT[12]；而采用 Smad7转基因疗法，
抑制了 Smad2和 Smad3的活化，降低了Ⅰ，III型
胶原mRNA的表达，改善了 UUO大鼠的肾间质纤
维化程度[13]。国内的临床资料显示，静滴盐酸川芎
嗪注射液可降低肾小管功能损害患者尿液中 β2-微
球蛋白、N-乙酰 β-氨基葡萄糖苷酶以及溶菌酶含
量，改善患者的肾小管功能[14]。本实验采用盐酸川
芎嗪注射液灌胃干预造模大鼠 3周后，梗阻侧肾组
织中 Smad7和 SnoN蛋白表达水平较模型组明显上
调，TGF-β1，III 型前胶原含量明显减少，HE 和
Masson染色显示肾组织病理改变明显轻于模型组，
表明川芎嗪能有效防治肾小管损伤,阻断肾间质纤
维化的发生与发展。
通过上述实验得出如下结论：川芎嗪具有良好
的抗肾间质纤维化作用，其作用机制表现在 2个方
面：第一，降低了肾组织中促纤维化细胞因子
TGF-β1含量；第二，恢复了由于降解减少的 Smad7
以及 SnoN 蛋白表达水平。川芎嗪的这种作用，是
由于其阻断了 Smad7和 SnoN蛋白的降解，还是由
于其直接增加了 Smad7和 SnoN蛋白的表达，有待
今后进一步的实验加以证实。
[参考文献]
[1] Itoh S，ten Dijke P.Negative regulation of TGF-beta receptor/Smad
signal transduction[J].Curr Opin Cell Biol，2007，19(2)：176.
[2] 贾怀玉，胡韬韬，曹 阳，等. 川芎嗪对肾小管功能损害保护作
用的临床观察[J]. 中国实用现代中医杂志，2006，23(19)：2858.
[3] 曹 灵，孙兴旺，于国华，等. 川芎嗪对人肾间质成纤维细胞增
殖和形态的影响[J]. 现代预防医学，2006，33(10)：1936.
[4] Böttinger E P，Bitzer M.TGF-beta signaling in renal disease[J].J Am
Soc Nephrol，2002，13(10)：2600.
[5] 刘克剑，张 悦，李 靖，等.单侧输尿管梗阻法制作大鼠肾间质
纤维化模型的改进[J].中国实验动物学报， 2007，15(6)：410.
[6] Huang Y，Border W A，Noble N A.Perspectives on blockade of
TGF-β overexpression[J].Kidney Int，2006，69(10)：1713.
[7] He J，Tegen S B，Krawitz A R，et al. The transforming activity of
Ski and SnoN is dependent on their ability to repress the activity of
Smad protein[J].J Biol Chem，2003，278(33)：30540.
[8] Fukasawa H，Yamamoto T，Togawa A，et al. Down-regulation of
Smad7 expression by ubiquitin-dependent degradation contributes to
renal fibrosis in obstructive nephropathy in mice[J].PNAS，2004，
101(23)：8687.
[9] Tan R，Zhang J，Tan X， et al. Downregulation of SnoN expression
in obstructive nephropathy is mediated by an enhanced
ubiquitin-dependent degradation[J].J Aｍ Soc Nephrol，2006，17
(10)：2781.
[10] 王宁宁，王笑云，毛慧娟，等.小鼠肾组织中 SnoN蛋白表达水平
与肾小管上皮细胞转分化的关系[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志，
2006，15(1)：25.
[11] Liu Y H.Renal Fibrosis：new insights into the pathogenesis and
therapeutics[J].Kidney Int，2006，69：213.
[12] Yang J W，Dai C S，Liu Y H. A novel mechanism by which
hepatocyte growth factor blocks tubular epithelial to mesenchymal


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January，2009
第 34卷第 1期
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transition [J].J Am Soc Nephrol，2005，16(1)：68.
[13] Lan H Y，Mu W，Tomita N，et al.Inhibition of renal fibrosis by gene
transfer of inducible Smad7 using ultrasound-microbubble system in
rat UUO model[J].J Am Soc Nephrol，2003，14(6)：1535.
[14] 王亚平，李伯祥. 川芎嗪防治肾间质纤维化作用的实验研究[J].
中国中西医结合肾病杂志，2002，3(2)：77.


Effect of tetramethylpyrazine on expression of Smad7 and SnoN
in rats with UUO

LU Min，ZHOU Juan，WANG Fei，LIU Yumin，ZHANG Yue*
(Scientific Experimental Center of Shanghai Traditional Chinese Medicine University, Shanghai 201203 ,China)

[Abstract] Objective：To study effect and mechanisms of tetramethylpyrazine(TMP) on renal interstitial fibrosis induced by
unilateral ureteral obstruction in rats. Method: Eighteen male sprague-dawley rats were randomly divided into sham-operated group,
model group and TMP group, 6 in each group. The model of renal interstitial fibrosisi was established in rats by unilateral ureteral
obstruction. All rats were killed at the end of the 3th week after treatment. Pathological change and collagen deposition of the
kidneys in rats were observed with HE staining and Masson’s collagen staining, respectively. The contents of procollagen III
N-terminal peptide and TGF-β1 in renal tissue homogenates were tested by radioimmunoassay and ELISA, respective. Protein
expression levels of Smad 7 and the Smad transcriptional corepressors SnoN in the obstructed kidney were analyzed by Western
blotting. Result: Pathological examination of the kidneys in the model group showed renal tubule atrophied and lumens expanded,
tubular interstitium broadened, large amount of collagen interstitial deposited. The contents of procollagen III N-terminal peptide and
TGF-β1 were higher and the protein expression levels of Smad7 and SnoN were significantly lower than those in the sham-operated
group. Compared with the model group, TMP ameliorated the pathological lesion of the obstructed kidney, decreased the procollagen
III N-terminal peptide and TGF-β1 contents, significantly increased the expression levels of Smad7 and SnoN protein. Conclusion:
TMP can evidently resist renal interstitial fibrosis induced by UUO in rats, which might be related with down-regulation of the
contents of TGF-β1， which is a potent profibrosis cytokine, meanwhile up-regulation of the protein expression levels of Smad7 and
SnoN in renal tissue.
[Key words] tetramethylpyrazine(TMP)； unilateral ureteral obstruction； renal interstitial fibrosis；Smad7；SnoN
[责任编辑 古云侠]


《中国中药杂志》2009年征订启事
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