全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 11 期 2014 年 6 月 ·1591·

水苏碱对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织蛋白激酶 R 样内质网激酶表达的影响
张 翠，芦 莹，周亚洁，佟倩倩，王淑静，梁 伟
哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076
摘 要：目的 探讨水苏碱对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织蛋白激酶 R 样内质网激酶（PERK）表达的影响。方法 建立单侧
输尿管梗阻诱导大鼠肾间质纤维化的动物模型；将大鼠随机分为假手术组，模型组，依那普利组，水苏碱高、中、低剂量组；
于术后第 14 天处死大鼠收集血清测定血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）；采用 HE 染色观察肾脏的病理改变及评定肾小管损伤
指数；Masson 染色观察肾间质胶原沉积的面积，判断肾间质纤维化程度；采用免疫组织化学方法检测肾组织中 PERK、激
活转录因子 4（ATF4）、C/EBP 同源蛋白（CHOP）的表达。结果 各治疗组与模型组比较，BUN、Scr 均明显降低，肾小
管损伤程度明显减轻，肾间质胶原相对面积和 PERK、ATF4、CHOP 的表达显著降低（P＜0.05、0.01）。与依那普利组比较，
水苏碱高剂量组的抗肾间质纤维化作用更为显著（P＜0.05）。结论 水苏碱能够抑制 PERK 信号通路介导 ATF4 蛋白表达水
平升高及 ATF4 激活 CHOP 的蛋白表达，阻止细胞凋亡，从而减缓了肾间质纤维化的发生和发展。
关键词：水苏碱；单侧输尿管梗阻；蛋白激酶 R 样内质网激酶；激活转录因子 4；C/EBP 同源蛋白
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)11 - 1591 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.11.017
Effect of stachydrine on expression of PERK of endoplasmic reticulum in renal
tissue of rats with unilateral ureteral obstruction
ZHANG Cui, LU Ying, ZHOU Ya-jie, TONG Qian-qian, WANG Shu-jing, LIANG Wei
College of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China
Abstract: Objective To investigate the effect of stachydrine on the expression of protein kinase R-like endoplasmic reticulum
kinase (PERK) in renal tissue of rats with unilateral ureteral obstruction (UUO). Methods To establish the animal model of renal
interstitial fibrosis induced by UUO. The rats were randomly divided into the Sham, model Enalapril, high-, mid-, and low-dose
stachydrine groups. Rats were sacrificed to collect serum for determining the serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN)
after day 14 of surgery. HE staining was used for observation of kidney pathological changes and the assessment of renal tubular
damage indexes. Masson staining was applied to the semi-quantitative analysis of relative area of renal interstitial fibrosis (RIF) and
degree of RIF. The expression of PERK, activiting transcription factor 4 (ATF4), and C/EBP homologous protein (CHOP) was detected
by immunohistochemical methods. Results Compared with the model group, the levels of Bun, Scr, the tubular injury, the relative
area of renal interstitial collagen, and the expression of PERK, ATF4, and CHOP was significantly reduced in the treatment groups (P <
0.05, 0.01). The high stachydrine was more effective than Enalapril in inhibiting RIF (P < 0.05). Conclusion The stachydrine could
inhibit the increasing expressions of ATF4 induced by PERK signaling pathway and CHOP activated by ATF4. The apoptosis are
blocked to slow down the occurrence and development of RIF.
Key words: stachydrine; unilateral ureteral obstruction; protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase; activiting transcription
factor 4; C/EBP homologous protein

肾间质纤维化是各种原因所致肾病发展至终末
期肾功能衰竭的共同病理特征[1]，随着研究的深入，
内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）与
慢性肾病的密切关系逐渐被人们所认识，已被证实
其广泛参与到各种原因（缺血、缺氧等）引起的肾
脏疾病中[2]。ERS 发生在细胞应激早期，是线粒体

收稿日期：2013-10-16
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81373547）；黑龙江省自然科学基金项目（D201147）；黑龙江省教育厅基金项目（11531451）
作者简介：张 翠（1958—），女，黑龙江哈尔滨人，教授，博士后，博士生导师，主要从事中医药治疗肾病研究。
Tel: (0451)84838207 E-mail: zhangcuiliulu@163.com
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应激和细胞核应激的共同通路[3]。当肾小管上皮细
胞受到炎症的刺激时，内质网便会发挥适宜的保护
机制，但过久或过强的 ERS 则会诱导细胞凋亡，无
法保持细胞的稳态，伴有细胞外基质的增多，造成
间质纤维化[4-5]。因此，深入研究肾纤维化 ERS 诱
导细胞凋亡的机制对肾间质纤维化的防治具有重
要意义。
水苏碱来源于多种中药[6]。能够减轻过氧化
氢所致肾小管上皮细胞损伤[7]；显著增加大鼠尿
量[8]；改善血液流变学、降低血液黏稠度[9]。本研
究探讨水苏碱对蛋白激酶 R 样内质网激酶
（PERK）信号通路介导激活转录因子 4（ATF4）
蛋白表达水平、ATF4 激活内质网应激特异转录因
子 C/EBP 同源蛋白（CHOP）表达水平及细胞凋
亡通路的影响，以期阐明水苏碱抗肾间质纤维化
的作用机制。
1 材料
1.1 实验动物
清洁级健康雄性 Wistar 大鼠，体质量（200±
20）g，购自吉林大学实验动物中心，合格证号
SCXK-（吉）-2011-0004。
1.2 主要试剂及仪器
水苏碱（质量分数为 98.7%，购自四川天然活性
成分研究所），依那普利（批号 120201，上海现代制
药股份有限公司）。血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）
试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司），一抗兔
抗鼠 PERK、CHOP、ATF4 多克隆抗体（北京博奥
森生物技术有限公司），山羊抗兔 IgG 抗体-HRP 多
聚体（北京中山生物技术有限公司），医学病理图像
分析系统 Image Pro Plus 6.0 分析软件（哈尔滨医科
大学提供）。
2 方法
2.1 动物分组、单侧输尿管梗阻大鼠模型制备及给药
60 只大鼠适应性喂养 1 周后，随机分为 6 组：
假手术组，模型组，依那普利（0.45 mg/kg）组，
水苏碱高、中、低剂量（92.88、46.44、23.22 mg/kg）
组，每组 10 只。采用单侧输尿管结扎法建立肾间
质纤维化大鼠模型。大鼠禁食 24 h，ip 10%水合氯
醛 0.3 mL/100 g 麻醉，无菌条件下从大鼠左肋脊角
下方剪开皮肤及肌层至腹膜后，游离左侧输尿管，
在肾盏处和肾下极处分别结扎并从中间剪断输尿
管。假手术组分离输尿管（但不结扎和剪断输尿管）
后即缝合腹腔。手术前 1 d 各给药组开始 ig 相应
剂量药物，假手术组和模型组给予同体积生理盐
水。每天给药 1 次，共 14 d。
2.2 Scr 和 BUN 检测
于术后第 14 天采用摘眼球取血法取血，约 3
mL，不抗凝，血液收集后经 2 500 r/min 离心 10
min 分离出血清，将血清保存于−20 ℃冰箱，利
用 Glamour 2000 型全自动生化分析仪进行肾功能
检测。
2.3 肾脏病理学检测
肾组织样本经过 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，
切片，以备 HE、Masson 染色。每例 HE 切片在 400
倍光镜下随机选择 10 个不含肾小球的视野，进行
半定量分析。依据间质纤维化程度、小管萎缩、间
质浸润、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、小管
扩张、小管细胞空泡变性 8 项指标观察肾间质病理
改变。每个参数分为 4 个等级：正常为 0 分，轻度
受损为 1 分，中度受损为 2 分，重度为 3 分，每个
样本小管间质损伤总评分为 0～24 分。行 Masson
染色切片后，每张切片在高倍镜 400 倍下随机选取
20 个视野，测定间质纤维化面积占同视野小管间质
总面积的百分比。取平均值为每例切片的肾间质相
对面积，作为衡量肾小管损伤的指标。应用 Image
Pro plus-6.0 多媒体彩色病理图像分析软件进行半
定量分析。
2.4 肾组织 PERK、ATF4、CHOP 蛋白表达的检测
采用免疫组织化学 SP 法检测蛋白的表达。采
用计算机 Image.pro 多媒体彩色病理图像分析软件
进行免疫组织化学半定量分析。光镜下阳性反应部
位为棕黄色，细胞核为淡蓝色。方法：每份样本随
机选择 5 个视野，每个视野内选 3～5 处阳性染色
区域，得出阳性染色区域的积分吸光度值，进行组
间比较。
2.5 统计学处理
数据结果以 ±x s 表示，组间均数比较采用单因
素方差分析（One-way ANOVA），组内比较采用 t
检验，采用 SPSS 16.0 统计软件进行分析。
3 结果
3.1 肾功能 Scr 和 BUN 水平
模型组与假手术组比较，BUN 和 Scr 均明显
升高，差异显著（P＜0.01）；各治疗组与模型组比
较，BUN、Scr 均明显降低（P＜0.05、0.01）；水
苏碱高剂量组降低 BUN、Scr 作用明显优于依那普
利组（P＜0.05）。见图 1。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 11 期 2014 年 6 月 ·1593·





与假手术组比较：**P＜0.01；与模型组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01；与依那普利组比较：#P＜0.05，下同
**P < 0.01 vs Sham group; △P < 0.05 △△P < 0.01 vs model group; #P < 0.05 vs Enalapril group, same as below
图 1 各组大鼠血清 Scr 和 BUN 水平 ( ± = 10x s , n )
Fig. 1 Levels of Scr and BUN in serum of rats in each group ( ± = 10x s , n )
3.2 肾小管损伤指数
HE 染色光镜下显示，假手术组 HE 染色肾脏病
理未见明显异常；模型组肾间质大量炎性细胞浸
润，皮质部分肾小管萎缩及扩张现象广泛存在，肾
小管上皮细胞坏死、脱落极为严重，间质水肿导致
肾间质宽度增加明显，间质纤维化程度比较高；依
那普利及水苏碱高、中剂量组与模型组比较，均能
减轻肾小管损伤（P＜0.05、0.01）；水苏碱高剂量
组减轻肾小管损伤作用优于依那普利组（P＜0.05）。
见图 2、3。
3.3 肾间质纤维化程度
Masson 染色假手术组未见异常；模型组肾间质
胶原染色加深，分布面积更为广泛；同样观察到间
质宽度加宽，肾小管的扩张及萎缩；依那普利及水
苏碱高、中、低剂量组与模型组比较，肾间质胶原
相对面积明显减小（P＜0.05、0.01）；与依那普利
组比较，水苏碱高剂量组降低肾间质胶原相对面积
的效果更为显著（P＜0.05）。见图 2、3。
3.4 肾组织 PERK 蛋白的表达
假手术组可见少量 PERK存在于肾小管上皮细
胞，呈现棕黄色颗粒。模型组 PERK 大量存在，与
假手术组比较表达明显升高（P＜0.01）；依那普利
及水苏碱高、中剂量组与模型组比较，PERK 的表
达明显降低（P＜0.05、0.01）；与依那普利组比较，
水苏碱高剂量组更能显著降低 PERK 的表达（P＜
0.05）。见图 4、5。



假手术 模型 依那普利 水苏碱高剂量
图 2 各组大鼠的肾小管损伤指数 (HE 染色) 和肾组织胶原相对面积 (Masson 染色)
Fig. 2 Renal tubular damage index (HE staining) and relative area of renal tissue collagen (Masson staining) of rats in each group
Sc
r /
(μ
m
ol
·L
−1
)
100
80
60
40
20
0
B
U
N
/
(m
m
ol
·L
−1
)
15
10
5
0
假手术 模型 依那普利 92.88 46.44 23.22
水苏碱 / (mg·kg−1)
假手术 模型 依那普利 92.88 46.44 23.22
水苏碱 / (mg·kg−1)
**
**
△△
△△#
△△
△
△△
△△#
△△
△△
HE 染色
Masson 染色
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a
b
cd
b

a
b
cd
c
b


图 3 各组大鼠肾小管损伤指数和肾组织胶原相对面积 ( ± = 10x s , n )
Fig. 3 Renal tubular damage index and relative area of renal tissue collagen of rats in each group ( ± = 10x s , n )
3.5 肾组织 CHOP 蛋白的表达
假手术组偶见肾小管上皮细胞胞浆中 CHOP 的
阳性表达；模型组肾小管上皮细胞胞浆中 CHOP 表
达明显增多（P＜0.01），呈不均匀颗粒状；依那普利
及水苏碱中、高剂量组与模型组比较，CHOP 表达
明显减少（P＜0.05、0.01）；水苏碱高剂量组与依那
普利组比较有差异（P＜0.05）；表明水苏碱高剂量组
能显著降低 CHOP 表达，其作用优于依那普利组。
见图 4、5。
3.6 肾组织 ATF4 蛋白的表达
模型组与假手术组比较，ATF4 的表达明显升
高（P＜0.01）；依那普利及水苏碱高、中剂量组与
模型组比较，ATF4 的表达明显降低（P＜0.05、
0.01）；与依那普利组比较，水苏碱高剂量组更能显
著降低 ATF4 的表达（P＜0.05）。见图 4、5。
4 讨论
肾间质纤维化是所有慢性肾病进行性发展的
最终结果。肾间质纤维化的程度与肾功能的减退呈




假手术 模型 依那普利 水苏碱高剂量
图 4 各组大鼠肾组织 PERK、CHOP、ATF4 蛋白表达 (免疫组化)
Fig. 4 Expression of PERK, CHOP, and ATF4 in renal tissue of rats in each group (immunohistochemistry)
肾
小
管
损
伤
指
数

胶
原
相
对
面
积
/
%

50
40
30
20
10
0
15
10
5
0
假手术 模型 依那普利 92.88 46.44 23.22
水苏碱 / (mg·kg−1)
假手术 模型 依那普利 92.88 46.44 23.22
水苏碱 / (mg·kg−1)
**
△△
△△#
△△#
△
△
△ △
**
PERK
CHOP
ATF4
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图 5 各组大鼠肾组织 PERK、CHOP、ATF4 蛋白表达半定量分析 ( ±x s )
Fig. 5 Expression of PERK, CHOP, and ATF4 in renal tissue of rats in each group ( ±x s )
高度相关，且与慢性肾病的预后密切相关，因此减
轻肾间质纤维化的程度有利于延缓慢性肾病向肾
病终末期转化的速度。
本研究采用单侧输尿管梗阻诱导肾间质纤维
化动物模型，输尿管的梗阻引起尿路压力增高，肾
血流降低，静脉引流阻塞，并伴有炎症细胞浸润、
肌纤维母细胞的过度增殖、胞外基质沉积[10]。术后
14 d 模型组大鼠肾小管上皮细胞萎缩及扩张、炎症
细胞浸润明显加重，Masson 染色显示肾间质胶原蛋
白沉积增多，血清 Scr 和 BUN 浓度升高，这与临
床常见的输尿管梗阻导致肾间质纤维化是一致的。
水苏碱能够明显减轻肾小管的损伤、抑制胶原蛋白
的合成、改善肾功能。
内质网是真核生物细胞内最大的细胞器，负责
合成转运蛋白质、识别信号肽、糖基化修饰、钙离
子贮存等重要的生理功能。当细胞遇到缺血、缺氧、
Ca2+平衡紊乱等理化因素时，内质网功能紊乱，不
能正确合成、加工、修饰、转运蛋白质，最终引起
ERS。内质网激活通过激活未折叠蛋白反应
（unfolded protein response，UPR）减少错误折叠蛋
白、未折叠蛋白的合成、增强内质网的蛋白质折叠
诱导内质网相关降解（ endoplasmic reticulum
associated degradation，ERAD）基因的表达[11]，减
轻错误折叠蛋白和未折叠蛋白的进一步聚集，尽量
维持内质网的稳定，是一种内质网自我保护的机
制，但过强及过久的内质网应激会诱导细胞凋亡，
及时清除受损细胞，凋亡的肾小管上皮细胞不仅促
进肾小管的萎缩还能引起细胞外基质沉积在凋亡
细胞上，最后导致肾脏的结构和功能损伤[12-15]。
内质网腔内存在 3 种未折叠蛋白感受器，即跨
膜蛋白：PERK、抑制物阻抗性酯酶（ inositol
requiring enzyme l，IRE l）和激活作用转录因子
（activating transcription factor 6，ATF6）。在 ERS 早
期，PERK 作为一种内质网 I 型跨膜蛋白，能够明
显地感受到错误折叠蛋白、未折叠蛋白的积累所带
来稳态的打乱，其介导 PERK-ATF4 信号通路是由
UPR 激活[16-17]，PERK 信号通路能够对细胞起保护
作用、促进细胞的生存，适当应激，内质网的
BiP/GRP 78 与 PERK 的 N 端结构域结合，稳态打
乱时就会分离开来，激活 PERK 信号通路，通过自
身磷酸化，活化 ATF4，其介导的基因涉及到细胞
凋亡包括 CHOP，PERK-ATF4 通路是诱导 CHOP
表达的关键通路。CHOP 是内质网应激的特异性转
录因子，过度的内质网应激总会优先启动 CHOP 信
号通路来诱导细胞凋亡，CHOP 的表达增加是过度
ERS 的标志[18]。
实验结果表明：术后 14 d，模型组中 PERK、
ATF4、CHOP 的表达均明显升高，假手术组表达甚
微，说明单侧输尿管梗阻激活了 ERS 的 PERK 信号
通路，试图缓解未折叠或错误折叠蛋白的蓄积；通
过激活 ATF4 的表达来调控 CHOP 基因的转录和翻
译，最终启动了 CHOP 介导的凋亡途径，以便快速
消除功能失调的细胞，上述蛋白的表达趋势与文献
报道中 PERK 介导的 CHOP 凋亡途径相一致[19]。与
模型组相比，水苏碱各剂量组均能有效降低 PERK、
ATF4、CHOP 的表达，这表明 CHOP 介导的细胞凋
亡途径参与到了肾间质纤维化的发展，水苏碱通过
阻断前期内质网应激的 PERK信号通路以阻止肾小
管上皮细胞的过度凋亡，延缓肾间质纤维化的发展
进程。水苏碱抑制 PERK 表达介导的细胞凋亡通路
的机制有望为研发新药干预肾间质纤维化提供一
定的理论依据。
PE
R
K

C
H
O
P
AT
F4

250
200
150
100
50
0
400
300
200
100
0
250
200
150
100
50
0
假手术 模型 依那普利 92.88 46.44 23.22
水苏碱 / (mg·kg−1)
假手术 模型 依那普利 92.88 46.44 23.22
水苏碱 / (mg·kg−1)
假手术 模型 依那普利 92.88 46.44 23.22
水苏碱 / (mg·kg−1)
** ** **
△
△ △
△ △△
△△#
△△#
△△#
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参考文献
[1] Meng L Q, Tang J W, Wang Y, et al. Astragaloside IV
synergizes with ferulic acid to inhibit renal
tubulointerstitial fibrosis in rats with obstructive
nephropathy [J]. Br J Pharmacol, 2011, 162: 1805-1818.
[2] 丁 巍. 内质网应激与肾脏疾病 [J]. 国际泌尿系统杂
志, 2010, 30(6): 817-821.
[3] Tabas I, Ron D. Integrating the mechanisms of apoptosis
induced by endoplasmic reticulum stress [J]. Nat Cell
Biol, 2011, 13(3): 184-190.
[4] 刘 俊, 何娅妮. 内质网应激在肾脏疾病进展中的作
用 [J]. 生理科学进展, 2010, 41(6): 439-442.
[5] Rutkowski D T, Kaufman R J. A trip to the ER: coping
with stress [J]. Trends Cell Biol, 2004, 14(1): 20-28.
[6] 江纪武, 肖庆祥. 植物药有效成分手册 [M]. 北京: 人
民卫生出版社, 1986.
[7] 刘红燕, 王 瑞, 石 明, 等. 小剂量盐酸水苏碱对过
氧化氢所致肾小管上皮细胞凋亡的保护作用 [J]. 中
国中西医结合肾病杂志, 2008, 9(9): 760-763.
[8] 晁 志, 马丽玲, 周秀佳. 益母草中生物碱成分对大鼠
的利尿作用研究 [J]. 时珍国医国药, 2005, 16(1): 11-12.
[9] Christopher R, Martens D, Edwards G. Peripheral
vascular dysfunction in chronic kidney disease [J].
Cardiol Res Pract, 2011, doi: 10. 4061/2011/267257.
[10] 张新志, 何立群. 肾小管间质纤维化动物模型的研究
进展 [J]. 时珍国医国药, 2010, 21(4): 969-971.
[11] 李 明, 丁 健, 缪泽鸿. 未折叠蛋白反应的信号转导
[J]. 生命科学, 2008, 20(2): 246-252.
[12] 袁杨刚, 丁桂霞, 张爱华, 等. 内质网应激与肾脏损伤
[J]. 中国肾脏病杂志, 2011, 27(12): 949-952.
[13] Stefan J, Marciniak D R. Endoplasmic reticulum stress
signaling in disease [J]. Physiol Rev, 2006, 86:
1133-1149.
[14] Basseri S, Austin R C. Endoplasmic reticulum stress and
lipid metabolism: mechanisms and therapeutic potential
[J]. Biochem Res Int, 2012, doi: 10. 1155/2012/841362.
[15] 廖晓辉. 肾小管上皮细胞凋亡在肾间质纤维化中的作
用 [J]. 国际泌尿系统杂志, 2008, 28(3): 390-393.
[16] 李载权, 周爱儒, 唐朝枢. 内质网应激反应分子机理研
究进展 [J]. 中国生物化学与分子生物学报 , 2004,
20(3): 283-288.
[17] 吕振嵘, 刘秀华. 蛋白激酶 R 样内质网激酶信号通路
在内质网应激中作用的研究进展 [J]. 生理科学进展,
2011, 42(2): 154-157.
[18] Oyadomari S, Mori M. Role of CHOP/GADD153 in
endoplasmic reticulum stress [J]. Cell Death Differ, 2004,
11(4): 381-389.
[19] Chiang C K, Hsu S P, Wu C T, et al. Endoplasmic
reticulum stress implicated in the development of renal
fibrosis [J]. Mol Med, 17(11/12): 1295-1305.