全 文 ：反相高效液相色谱法测定青海不同地区麻花艽中落干酸的含量
娜　英
(青海民族学院 化学系 ,青海 西宁　810007)
摘　要:目的　建立了麻花艽中落干酸含量的反相高效液相色谱分析方法.色谱柱:ZORBAXSB-C18(250mm×4.6mm , 5μm),
色谱条件:检测波长 238nm ,柱温 30℃,流速 1.0mL·min-1 ,流动相:甲醇:水(25∶75);利用正交试验确定了超声提取的最佳条
件.结果　选定条件下落干酸与其它组份达到了基线分离 , 落干酸的线性范围为 0.050～ 0.625μg , γ=0.9999 , 回收率为
99.5%(RSD:3.5%).测定了青海 12个不同产地麻花艽中落干酸的含量.结论　分析方法快速 、简便 ,结果准确.
关键词:麻花艽;落干酸;反相高效液相色谱
中图分类号:O656　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1001-7542(2007)03-0061-04
麻花艽(Gentiana straminea Maxim.)藏医称“解吉嘎保” ,属龙胆科秦艽组多年生草本植物 ,藏医用麻
花艽全草入药 ,治疗治关节炎 、肺病发烧 、黄疸及二便不通[ 1 ,2] .现代药理学研究表明 ,落干酸具有较好
的抗炎活性 ,是麻花艽中主要药效成分之一[ 3] .本文优化了落干酸(Loganic acid)的 HPLC 分析方法 ,缩短
了分析时间 ,提高了测定的灵敏度 ,并通过单因素比较和正交试验研究了落干酸的最佳提取方法 ,测定
了青海省 12个不同地区麻花艽样品中上述有效成分的含量 ,发现其含量有显著差异.
1　仪器 、试剂及样品采集
1.1　仪器　Agilent1100高效液相色谱仪(配置:手动进样器 、在线脱气机 、高压二元梯度泵 、恒温柱温
箱 、DAD检测器 、Agilent1100色谱工作站);ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm , 5μm)色谱柱;KQ3200超声
波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂).
1.2　试剂　甲醇:色谱纯(山东禹王实业有限公司禹城化工厂);水:自制三重蒸馏水;磷酸:AR级(北京
红星化工厂).
落干酸对照品由本院药学系林鹏程教授提供(HPLC归一化法检测 ,纯度大于 99%).
1.3　样品采集　麻花艽 2005年 8月采于青海省境内 ,由本院药学系林鹏程教授鉴定.样品阴干粉碎后
过80目筛 ,冷藏保存.
2　实验方法
2.1　色谱条件　色谱柱:ZORBAX SB-C18(250mm ×4.6mm , 5μm)柱;流动相:MeOH:H2O(含 0.03%
H3PO4)25%等度洗脱;检测波长:240nm;流速:1mL·min-1;柱温 30℃.该色谱条件下落干酸被洗脱且与
其它组分达到基线分离 ,保留时间为8.6min.见图 1.
2.2　溶液的配制
2.2.1　对照品溶液的配制　精密称取落干酸对照品2.50mg ,置1.0mL容量瓶中 ,以甲醇溶解并定容 ,配
置成相应浓度的对照品储备液 ,使用时稀释成所需浓度.
2.2.2　样品溶液的配制　精密称取0.5g 粉碎至 80目的麻花艽样品 ,分别加入 20mL60%甲醇 ,超声提
取20min ,抽滤 ,滤渣重复处理 2次 ,合并滤液 ,浓缩后定容至 50mL容量瓶中 ,过 0.45μm 滤膜 ,在选定色
谱条件下测定峰面积.
收稿日期:2007-03-10
作者简介:娜　英(1963-),女(蒙古族),上海人 ,青海民族学院讲师.
2007年
第3期 　　　 　　　　　
青海师范大学学报(自然科学版)
Journal of Qinghai Normal University(Natural Science)　　 　　　　　　
2007
No.3
DOI :10.16229/j.cnki.issn1001-7542.2007.03.017
图 1　色谱图(a-对照品;b-样品;1-落干酸;)
Fig.1　Chromatograms of assay(a-standard;b-sample;1-Loganic acid)
3　结果
3.1　提取方法的确定
3.1.1　不同提取方法对测定结果的影响　精密称取同一麻花艽样品 9份 ,每份 0.5g ,以甲醇为溶剂 ,测
定超声(45min)和热回流(2h)对分析结果的影响(平行样为 3).结果表明 ,超声法提取时间短 ,提取率最
高 ,故本试验采用超声提取法.
3.1.2　不同溶剂对测定结果的影响　精密称取同一麻花艽样品 9份 ,每份 0.5g ,分别以水 、甲醇 、乙醇
为溶剂 ,超声 45min ,测定不同溶剂对分析结果的影响(平行样为 3).结果表明 ,甲醇对落干酸的提取率
均最高 ,为此 ,利用正交试验方法进一步考察不同浓度甲醇 、不同提取时间和提取次数对落干酸测定的
影响.
3.1.3　正交试验　选择甲醇浓度(%),提取时间(min),提取次数为考察因素 ,每个因素取 3个水平 ,以
落干酸的含量为评价指标 ,应用 L9(34)表安排试验 ,因素水平见表 1.
表 1　正交实验的因素和水平
Table 1　Factors and Levels of orthogonal test
水平 甲醇浓度/ % 提取时间/min 提取次数/次
A B C
1 100 10 1
2 60 20 3
3 20 30 5
表 2　L9(34)正交试验结果
Table 2　Results of L9(34)orthogonal test
实验序号 A B C D 落干酸/ %
1 1 1 1 1 0.448
2 1 2 2 2 0.626
3 1 3 3 3 0.636
4 2 1 2 3 0.621
5 2 2 3 1 0.656
6 2 3 1 2 0.540
7 3 1 3 2 0.620
8 3 2 1 3 0.384
9 3 3 2 1 0.598
K1 0.570 0.563 0.457 0.567
落 K2 0.606 0.555 0.615 0.595
干 K3 0.534 0.591 0.637 0.547
酸 R 0.072 0.036 0.18 0.048
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直观分析表明 ,影响落干酸提取率的因素依次为:提取次数>提取浓度>提取时间.
表 3　方差分析表
Table 3　Variance analysis
误差来源 SS f F 显著性
A 0.008 2 8.0 显著
落 B 0.002 2
干 C 0.058 2 58.0 非常显著
酸 误差 0.00 2
合并误差 0.002 4
由方差分析可见 ,提取时间对落干酸的影响极小 ,应与误差项合并后计算 F比(见表 3);提取次数之
F比大于临界值 F0.01(2 , 4)(18.00),对试验结果有非常显著的影响;甲醇浓度之 F比 大于临界值 F0.05(2 ,4)
(6.94),对试验结果有显著影响.
综合直观分析和方差分析结果 ,最佳提取方法应为 A2B3C3(提取浓度 60%、提取时间 30min 、提取次
数3次).考虑实际工作的方便 、快捷 ,经进一步试验 ,确定最终提取方法为:甲醇浓度 60%、提取时间
20min 、提取次数 3次.
3.2　线性关系的考察　精密量取落干酸对照品储备液 ,以甲醇配制浓度分别为 0.125 , 0.050 , 0.025 ,
0.0167 ,0.0125 ,0.010mg·mL-1的系列对照品溶液 ,每次进样 5μL ,以峰面积的积分值定量 ,测得落干酸的
回归方程为:A=619.13X+0.93 , r=0.9999.线性范围为0.050 ～ 0.625μg.
3.3　检测限　在选定的色谱条件下 ,当信噪比S/N=3时 ,对各组分最低检测限进行测定 ,结果表明 ,落
干酸的最低检测限为 1.20ng.
3.4　精密度试验　取浓度为 0.025mg.mL-1落干酸对照品溶液 ,在选定的色谱条件下测定色谱峰的峰
面积 ,计算得 RSD分别为 0.80%,表明仪器精密度良好.
3.5　重复性试验　精密称取麻花艽样品 0.5g 共6份 ,按“2.2”项下方法操作 ,在选定的色谱条件下测定
落干酸的含量 ,计算得 RSD为 2.2%(n=6),表明方法重复性良好.
3.6　稳定性试验　精密称取麻花艽样品 0.5g ,按“2.2”项下方法操作 ,分别在 0 ,2 ,4 , 6 ,8h时分别进样 ,
测定落干酸的峰面积 ,计算得 RSD分别为 1.3%.表明样品溶液在 8h内稳定.
3.7　回收率试验　精密称取 3份已测知含量的麻花艽样品各 0.05g ,添加各对照品溶液适量(落干酸:
0.25mg·mL-1溶液 0.80mL ,按“2.2”项下方法操作 ,测得落干酸平均回收率(n=3)为 99.5%;RSD分别为
3.5%.
3.8　样品测定　取“2.2”项下制备的样品溶液按上述色谱条件进行分析 ,经 DAD检测器检测待测组分
的峰纯度且其紫外光谱与对照品一致后 ,按外标法以峰面积积分值计算 ,得落干酸的含量(每个样品重
复进样3次 ,取平均值),结果见表 1.
表 4　青海不同产地麻花艽中落干酸的含量
Table 4　Contents of loganic acid in G.strominea come from different areas of Qinghai province
出产地 落干酸含量(%) 出产地 落干酸含量(%)
泽　库 2.468 囊　谦 1.674
察汗河 0.473 果　洛 0.743
浩　门 0.969 湟　中 1.60
大　通 0.437 海　晏 0.948
刚　察 0.712 祁　连 0.574
门　源 0.763 乐　都 0.232
63第 3期　　　　娜英:反相高效液相色谱法测定青海不同地区麻花艽中落干酸的含量　　　　　
4　讨论
4.1　检测波长的确定　利用 DAD检测器在 220 ～ 400nm扫描其吸收光谱 ,各对照品在 238nm波长处均
有较高的吸收 ,选择该波长为检测波长.
图 2　落干酸的紫外吸收光谱图
Fig.2　UV spectras of loganic acid
4.2　流动相的选择　上述有效成分色谱峰易拖尾 ,
经试验 ,当在水中加入 0.01 ～ 0.10%(v/v)磷酸时均
可改善其的峰形.最终选择甲醇和含 0.04%的磷酸
水溶液为流动相.
4.3　结果分析　由表 1结果可见 ,青海不同产地麻
花艽中有效成分的含量 ,以泽库县的含量为最高 ,达
2.468%,乐都县样品最低 ,为 0.232%.
4.4　结论　优化了HPLC法测定麻花艽中落干酸的
色谱条件 ,在保证基线分离的条件下缩短了分析时
间;利用 DAD检测器选择了更加灵敏的检测波长 ,提
高了检测灵敏度;通过单因素比较和正交试验确定
了最佳提取方法 ,保证了分析结果的准确度.利用上述提取和分析条件 ,测定了青海省不同产地麻花艽
样品中有效成分落干酸的含量 ,以青海省泽库县麻花艽中含量最高.
参考文献:
[ 1] 　中国科学院西北高原生物研究所.青海经济植物志[M] .西宁:青海人民出版社 , 1987.453.
[ 2] 　杨永昌 ,何廷农 ,卢生莲 ,等.藏药志[ M] .西宁:青海人民出版社 , 1991.10.
[ 3] 　Recio MC ,Giner RM ,Manez S , et al.Structural considerations on the iridoids as anti-inflammatory agents[ J] .Planta Med , 1994;60(3):232.
Determination of Loganic Acid in Gentiana Straminea
Come from Different Areas of Qinghai Province
NAYing
(Chemistry Department of Qinghai Nationalities Institutes , Xining 810007 ,China)
Abstract:Objective To establish a quantitative method of determination the content of loganic acid in Gentiana
straminea Maxim , one kind of Tibet drugs.Methods The sample was separated on the column of ZorbaxSB-C18
(250 mm×4.6 mm , 5μm)which eluted with methanol and water(25:75).Detected wavelength at 238 nm , flow
rate at 1.0mL·min-1 , and column temperature at 30℃.The Supersonic extraction of loganic acid was studied by
orthogonal experiments.Results Loganic acid was base-isolated.The linear ranges of loganic acid was 0.050 ～ 0.625
μg , γ=0.9999.The average recoveries was 99.5%(RSD=3.5%).The content of loganic acid in G.straminea
of 12 different habitats in Qinghai was determined.Conclusion The method is rapid and precise.
Key words:gentiana straminea maxim;loganic acid;RP-HPLC
64　　　　　　　　　　　　　　青海师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　2007年