全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2015年 第40卷 第07期生物工程
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神秘果素(Miraculin)是存在于神秘果果实中
的一种特异糖蛋白，能使酸信号变为甜信号，从
而使人类食用酸性物质而产生甜味的感觉，被誉
为“味觉魔术师”[1-3]。有研究表明，神秘果素能
显著降低实验动物的血糖，认为其能改善动物对
胰岛素敏感性功能，有可能成为治疗糖尿病的新
一代药物[1-2]。目前神秘果素是从神秘果果实中提
取，由于神秘果核大浆少，提取工艺复杂，再加
上神秘果素易失活，导致其提取率及产量都非常
收稿日期：2015-02-08 *通讯作者
基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目(GCZX-B1103)。
作者简介：谭才邓(1980—)，男，广东台山人，硕士，高级实验师，研究方向为食品与生物技术。
低。另外神秘果产量低，价格昂贵，目前主要用
于研究，基本不见于市售。
本研究旨在克隆Miraculin基因并进行原核可
溶表达研究，目的是分离纯化出有活性的目标产
物，为研制新型的调味品或保健品提供有价值的
参考。
1 材料与方法
1.1 材料
谭才邓，朱美娟，廖延智，邓毛程*
(广东轻工职业技术学院，广东高校特色调味品工程技术开发中心，广州 510300)
摘要：以神秘果果实为实验材料，以改良CTAB法提取并获得高质量的总果实RNA，经过RT-
PCR获得Miraculin基因，构建原核表达载体pQE30-MIR并进行原核表达。经过大量的实验，表
明Miraculin蛋白可溶表达的最佳条件为：28 ℃，120 r/min，IPTG使用浓度为1.5 mmol/L，诱导
表达5 h。
关键词：神秘果素；变味蛋白；可溶表达
中图分类号：TS 255.1 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2015)07-0036-04
Cloning and study on prokaryotic soluble expression of miraculin
TAN Cai-deng, ZHU Mei-juan, LIAO Yan-zhi, DENG Mao-cheng*
(Guangdong Industry Technical College, Centre of Guangdong Higher Education for
Engineering and Technological Development of Speciality Condiments, Guangzhou 510300)
Abstract: Hight quality total RNA was obtain from miracle fruits using CTAB improved method, and
the miraculin gene was cloned through RT-PCR. The prokaryotic expression vector pQE30-MIR was
constructed and studied on the conditions of soluble expression. Lots of experiments showed that the best
conditions for soluble expression of miraculin was: 28 ℃, 120 r/min, IPTG 1.5 mmol/L, induced for 5 hours.
Key words: miraculin; taste-modifying protein; soluble expression
神秘果素Miraculin基因的克隆及
原核可溶表达研究
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.07.008
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FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2015年 第40卷 第07期 生物工程
1.1.1 质粒与菌种 质粒为pQE30，克隆菌株为E.
coli DH5α，表达菌株为E. coli BL21(DE3)。
1.1.2 植物材料 神秘果(Richadella dulcifica)成熟
果实，采收后液氨速冻，于-70 ℃贮藏备用。
1.2 方法
1.2.1 神秘果果实总RNA的提取[4] 采用改良CTAB
提取法，所得总RNA用DEPC水溶解，-70 ℃保存
备用。
1.2.2 逆转录获得cDNA第一链 采用TaKaRa公
司的Reverse Transcriptase XL(AMV)逆转录酶，
反应体系为：1 μg神秘果果实总RNA，4 μL
5×buffer，2 μL dNTP mix(10 mmol/L)，20 U
RNase Inhibitor，50 pmol Oligo(dT)18 Primer，10 U
AMV Reverse Transcriptase，补DEPC水至20 μL。
逆转录反应条件：室温放置10 min后移入42 ℃恒
温槽中保温60 min，冰浴5 min，所得的cDNA第一
链用于PCR反应。
1.2.3 Miraculin基因的克隆[5] 根据神秘果素序列
(GenBank accession number AB512278)与质粒pQE30
的多克隆位点设计引物：上游引物PrimerF：5-
CGCGGATCCGATTCGGCACCCAATCCGGTTCTT-
3’(酶切位点：Bam HI)，下游引物Primer R：5-
CCCAAGCTTTAGAAGTATACGGTTTTGTTGAAC-
3’(酶切位点：Hind III)。
PCR反应体系：5×PrimeSTAR缓冲液10
μL，dNTP mix(10 mmol/L)2 μL，上下游引物各1
μL，DNA模板1 μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶
(2.5 U/μL)0.5 μL，补水至50 μL。
PCR反应程序：96 ℃预变性4 min；96 ℃变
性20 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，32个循
环；72 ℃延伸5 min。
1.2.4 重组表达载体pQE30-MIR的构建 纯化后的
PCR产物和空载体pQE30分别用限制性内切酶Bam
HI和Hind III进行双酶切，酶切产物经纯化后用T4
连接酶进行连接，重组质粒经电击转化到大肠杆
菌DH5α中，提取质粒进行双酶切初步鉴定重组
体，阳性重组质粒电击转化到大肠杆菌BL21(DE3)
中，挑取阳性菌落进行摇菌并送到上海生工生物
工程公司进行测序，分析所克隆获得的Miraculin
基因序列的正确性，重组表达载体命名为pQE30-
MIR。
1.2.5 重组蛋白的诱导表达与SDS-PAGE分析 挑
阳性克隆单菌落接种至10 mL LB培养基(抗生素
Amp浓度为100 μg/mL，下同)中，37 ℃、200 r/
min振荡培养过夜，以10%的接种量接种至20 mL
新鲜LB培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养至
OD550=0.5~0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱
导时间在0、2、4 h时分别取样进行SDS-PAGE分
析重组蛋白的表达情况。
1.2.6 Miraculin蛋白可溶表达的培养条件探索 为
了探索Miraculin蛋白在大肠杆菌中能否以可溶的
形式进行表达，我们从诱导表达时间、诱导温
度、诱导物IPTG浓度、摇床转速这几方面进行单
因素优化，参数见表1。
表1 Miraculin蛋白可溶表达的培养条件参数设计表
因子 参数
诱导时间/h 1 2 3 4 5 10 15 20 24
诱导温度/℃ 24 26 28 30 32 34 36 38 40
IPTG浓度/(mmol/L) 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
摇床转速/(r/min) 80 100 120 150 180 200
经过诱导表达后，离心获得菌体，等量菌体
经超声波破碎，离心取上清液进行SDS-PAGE分
析，确定最佳可溶表达条件。
2 结果与分析
2.1 神秘果果实总RNA提取及Miraculin基因克隆
的结果分析
用CTAB法提取神秘果果实总RNA，经过逆转
录反应获得cDNA第一链，用设计合成的特异引
物和高保真DNA聚合酶进行PCR扩增以获得神
秘果编码片段。总RNA与PCR产物电泳图见图1
与图2。
图1 神秘果果实总RNA电泳图
由图1可知，提取获得的果实总RNA样品带条
明显，无DNA污染，其中28S rRNA带条亮度大约
是18S rRNA的2倍，说明总RNA完整性好，获得了
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较高质量的神秘果果实总RNA。 对，结果显示，其相似率为100%，目的片段长度
为573 bp，表明Miraculin基因克隆成功。
2.3 Miraculin蛋白的诱导表达与SDS-PAGE分析
为了初步了解重组子中Miraculin蛋白的表达
情况，本实验在37 ℃、200 r/min、IPTG浓度为1
mmol/L情况下，分别诱导表达0、2、4 h，离心取
菌体，取等量菌体进行SDS-PAGE分析，结果见
图4。
图3 重组子pQE30-MIR双酶切琼脂糖电泳图
注：1.0 h；2.2 h；3.4 h(箭头所指是目的蛋白)。
图4 重组质粒pQE30-MIR表达Miraculin蛋白
SDS-PAGE图
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图2 PCR产物琼脂糖电泳图
从图2可以看出，扩增获得的基因片段带条明
显，大小约600 bp，与预计片段大小吻合，可进
行后续实验。
2.2 pQE30-MIR重组子的筛选
经纯化后的PCR产物和空载体pQE30分别用
限制性内切酶进行双酶切，经过回收、连接，然
后电击转化到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性单菌
落进行摇菌，提取质粒后进行双酶切初步鉴定重
组子，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见
图3。
由图4可知，加入IPTG诱导后，在23 ku处是
诱导表达的蛋白(箭头处)，其分子量大小与目的蛋
白分子量大小相符，进一步表明Miraculin基因克
隆成功。在诱导2 h后目的蛋白明显已进行表达，
4 h的时候表达量已达到较高水平。
2.4 Miraculin蛋白的可溶表达与分析
为了探讨Miraculin蛋白在大肠杆菌中能否以
可溶的形式进行表达，我们从诱导表达时间、摇
床转速、诱导温度、诱导物IPTG浓度这几方面进
行单因素探索，结果如下。
2.4.1 诱导时间对Miraculin蛋白可溶表达的影响
在培养温度为37 ℃、摇床转速为200 r /
min、IPTG浓度为1 mmol/L的条件下，诱导表达
时间设定在1~24 h之间。分别取等量的菌液，离
心洗涤菌体，进行超声波破碎，经13000 r/min离
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由图3可知，重组质粒pQE30-MIR经过双酶
切后获得2条带条，其大小分别与质粒pQE30和
Miraculin基因的大小相符，可认为神秘果素编码
基因已连接到质粒pQE30上。将此重组质粒电击
转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落进行摇
菌并送到上海生工生物工程公司进行测序。对测
序结果序列与GenBank中Miraculin基因进行序列比
注：1：1 h；2：2 h；3：3 h；4：4 h；5：5 h；6：10 h；7：15 h；
8：20 h；9：24 h。
图5 诱导时间对miraculin蛋白可溶表达的影响
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心10 min后取上清液，进行SDS-PAGE分析，结
果如图5所示。
由图5可知，诱导表达的菌体经过超声波处理
后，上清液中有目的蛋白带条，说明Miraculin蛋
白在大肠杆菌中能以可溶形式进行表达；从第2 h
开始，Miraculin蛋白明显进行表达，在5 h与6 h的
时候表达量达到最高值，往后延长表达时间并没
有再提高目的蛋白表达量，因此可认为Miraculin
蛋白可溶表达最佳诱导时间为5 h。
2.4.2 摇床转速对Miraculin蛋白可溶表达的影响
在培养温度为37 ℃、IPTG浓度为1 mmol/L、
诱导表达时间为5 h的条件下，摇床转速分别设定
在80~200 r/min之间，目的蛋白可溶表达情况如图
6所示。
导表达时间为5 h的条件下，诱导表达温度分别设
定在24~40 ℃之间，目的蛋白可溶表达情况如图7
所示。
由图7可知，诱导表达温度在28~30 ℃时，目
的蛋白带条最浓，说明在此温度范围内Miraculin
蛋白可溶表达量最高。当温度低于28 ℃时细胞生
命活动速率较慢，因而目的蛋白表达量较低；当
温度高于30 ℃时细胞生命活动速率较快，目的蛋
白转向以包涵体的形式进行表达，导致可溶表达
量有所下降。因此可认为Miraculin蛋白可溶表达
最佳诱导温度为28 ℃。
2.4.4 诱导物IPTG使用浓度对Miraculin蛋白可溶表
达的影响 在培养温度为28 ℃、摇床转速为120 r/
min、诱导表达时间为5 h的条件下，诱导物IPTG
使用浓度设定在0.2~3.0 mmol/L之间，目的蛋白可
溶表达情况如图8所示。
注：1：80 r/min；2：100 r/min；3：120 r/min；4：150 r/min；
5：180 r/min；6：200 r/min。
图6 摇床转速对Miraculin蛋白可溶表达的影响 注：1.0.2 mmol/L；2.0.5 mmol/L；3.1.0 mmol/L；4.1.5 mmol/L；5.2.0 mmol/L；6.2.5 mmol/L；7.3.0 mmol/L。
图8 诱导物IPTG使用浓度对Miraculin蛋白可溶表达的影响
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由图6可知，当转速在80~120 r/min时，目的
蛋白可溶表达量随着转速的上升而提高，并在120
r/min时达到最高；在转速高于120 r/min时，目的
蛋白可溶表达量随着转速的上升而下降。可能是
随着转速的提高，培养基中溶氧量不断提高，细
胞生命活动速率不断提高，在溶氧超过一定的阈
值后，外源蛋白转向包涵体形式进行表达，导致
可溶表达量有所下降。因此可认为Miraculin蛋白
可溶表达最佳转速为120 r/min。
2.4.3 诱导温度对Miraculin蛋白可溶表达的影响
在摇床转速为120 r/min、IPTG浓度为1 mmol/L、诱
由图8可知，当IPTG浓度在1.5 mmol/L以内
时，Miraculin蛋白可溶表达量随着IPTG浓度的提
高而升高，并在1.5 mmol/L时达到最高，继续提高
IPTG浓度并没能提高Miraculin蛋白的表达量。因
此可认为Miraculin蛋白可溶表达最佳IPTG使用浓
度为1.5 mmol/L。
3 结论与展望
本研究成功克隆获得Miraculin基因，构建原
核表达载体pQE30-MIR，并进行原核可溶表达实
验。实验结果表明：Miraculin蛋白在大肠杆菌中
能以可溶形式进行表达，其可溶表达的最佳条件
为：28 ℃，120 r/min，IPTG使用浓度为1.5 mmol/
L，诱导表达5 h。本研究的后续工作应在Miraculin
蛋白的分离纯化与活性研究方面开展，为研制新
型的调味品或保健品提供有价值的参考。
参考文献：
[1] 刘祺,马雪梅,赵鹏翔.神秘果素的研究进展[J].食品科技,
2012,37(2):222-225
注：1.24 ℃；2.26 ℃；3.28 ℃；4.30 ℃；5.32 ℃；6.34 ℃；7.36
℃；8.38 ℃；9.40 ℃。
图7 诱导温度对Miraculin蛋白可溶表达的影响
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FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2015年 第40卷 第07期生物工程
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收稿日期：2015-03-24 *通讯作者
基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目(桂科合1298014-3)；广西大学大学生实验技能和科技创新能力训练基金项目(SYJN20132310)。
作者简介：梁钰(1983—)，女(壮族)，广西南宁人，硕士，实验师，研究方向为生物技术。
梁 钰1，程婷婷1，吴秘含1，梁莲华2,3，蒙健宗1,3*
(1.广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004；2.南宁邦尔克生物技术有限责任
公司，南宁 530003；3.南宁发酵与酶工程技术研究中心，南宁 530003)
摘要：为将Clostridium thermosulfurogenesβ-淀粉酶基因高效分泌表达，构建了带有ompA信
号肽的表达载体和重组大肠杆菌。通过测定酶活力考察诱导物浓度、诱导时相、表面活性剂
对重组菌分泌表达β-淀粉酶的影响。结果ompA信号肽介导Clostridium thermosulfurogenesβ-
淀粉酶分泌率为23.6%，略优于pelB信号肽；重组菌生长的对数前期和100 μmol//L的IPTG浓
度是较优的诱导表达条件；重组菌诱导表达初期添加1%吐温80，β-淀粉酶分泌酶活力提高
了105%，而在诱导至较高细胞密度后添加0.05% Triton X-100，β-淀粉酶分泌酶活力可提高
301%。
关键词：β-淀粉酶；信号肽；分泌表达；表面活性剂
中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2015)07-0040-05
Secretory expression of recombinant Clostridium thermosulfurogenes
β-amylase in Escherichia coli
LIANG Yu1, CHENG Ting-ting1, WU Mi-han1, LIANG Lian-hua2,3, MENG Jian-zong1,3*
(1.College of Life Science & Technology, Guangxi University, Nanning 530004;
2.Nanning Bioclone Biotech Co., Ltd., Nanning 530003; 3.Nanning Fermentation and
Enzyme Engineering Research Center, Nanning 530003)
重组Clostridium
thermosulfurogenes β-淀粉酶的
分泌表达
[2] 卢圣楼,刘红,贾桂云.神秘果功能成分及开发利用研究
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fruit to transgenic tomato: mass production of the taste-
modifying protein miraculin in transgenic plants[J]. Plant
Cell Reports,2012,31(3):513-525
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.07.009