全 文 ：烟草科技 /TobaccoScience＆Technology 烟草化学 /TobaccoChemistry 2008年第 3期(总第 248期)
作者简介:李雪梅(1971-), 女 ,在读博士 ,云南省微生物发酵
重点实验室副研究员 ,研究方向:烟草化学及烟用添加剂。
E-mail:xmli@cyats.com
收稿日期:2007-08-18
责任编辑:周雅宁　E-mail:zyn0626@126.com
电话:0371-67672778
利用香荚兰内生菌制备天然香料及其在卷烟中的应用
李雪梅 1, 3 , 徐若飞 2 , 杨黎华 1 , 杨金奎3 , 张克勤 3
1.云南烟草科学研究院 ,昆明高新开发区科医路 41号　650106
2.云南省红云集团技术中心 ,昆明市北市区　650202
3.云南省微生物发酵重点实验室 ,昆明市翠湖北路 2号　650091
关键词:香荚兰;产香内生菌;天然香料;卷烟
摘要:为了获得具有良好应用效果的特色风味料 ,从香荚兰气生根中分离到一株产香内生芽孢杆菌 Van
-1a, 200 r/min、37 ℃摇床培养 3d, Van-1a可转化阿魏酸生成含有香兰素及愈创木酚衍生香味物的
天然香料。采用 GC/MS从中分离鉴定出 10种挥发性香味化学成分 。卷烟加香试验表明:该天然香料
能与烟香较好谐调 ,具有提调烟香 、细腻醇和烟气 、改善卷烟吸味的良好效果 。
中图分类号:TS264.3　文献标识码:B　文章编号:1002-0861(2008)03-0031-05
NaturalFlavorPreparedfromVanilaEndophyteanditsApplicationinCigarete
LIXUE-MEI(1, 3), XURUO-FEI(2), YANGLI-HUA(1), YANGJIN-KUI(3), andZHANGKE-QIN(3)
1.YunnanAcademyofTobaccoScience, Kunming650106, China
2.TechnologyCenterofHongyunGroup, Kunming650202, China
3.KeyLaboratoryofMicrobialFermentationofYunnanProvince, Kunming650091, China
Keywords:Vanila;Aromaproducingendophyte;Naturalflavor;Cigarete
Abstract:Inordertoobtainaflavorofspecialnoteandwithgoodapplicationefect, anaromaproducing
endophyticBacilussp.Van-1awasseparatedfromaerialrootofVanila.Afterfermentingfor3 daysat37℃
onashakerataspeedof200 r/min, Van-1aenabledferulicacidtoproduceanaturalflavorcontaining
vanilinandguaiacolderivatives, andfromwhich, 10volatilearomaticchemicalcomponentswereidentifiedby
GC/MS:vanilin, vanilaacid, eugenol, 4 -vinylguiacol, 4 -ethylguiacol, 4 -propylguiacol, 4, 4 -
diguiacol, 1-butanol, 3-hydroxy-2-butanoneand2-ethyl-1-hexanol.Cigareteflavoringtestshowed
thatthenaturalflavorwasharmoniouswithtobaccoinflavorandcouldenhancetobaccoflavor, melowtobacco
smokeandimprovesmokingtasteobviously.
　　香荚兰被誉为 “香料皇后 ”,香荚兰豆及其制品在
糖果 、饮料 、烘焙制品 、烟酒等食品加香领域的应用非
常重要 [ 1-3] 。天然香荚兰制品中的主要香味成分包括
香兰素(1% ～ 3%)、香草酸 、丁香酚 、愈创木酚等。由
于消费者普遍存有的消费心理 ,即天然化合物比化学
合成的更健康 ,因此 ,国外于 20世纪 80年代已开始了
模拟香荚兰天然风味料研制方面的研究 ,并保持着持
续增长的研究兴趣[ 4-7] 。近两年来 ,国内有关香兰素生
物合成的研究也开始起步 [ 8-9] 。
香兰素的生物技术法生产是通过应用真菌 、细菌 、
植物细胞或基因工程微生物 ,对木质素 、1, 2-二苯乙
烯酚 、异丁香酚 、丁香酚 、阿魏酸或芳香族氨基酸等不
同的前体物质进行生物转化或从头合成来实现的;而
在有关应用生物技术生产天然香兰素的研究中 ,报道
最深入集中的是阿魏酸的生物转化 [ 10-12] 。阿魏酸是
木质素的降解产物 ,在植物细胞中和多糖 、木质素交联
31
构成细胞壁的一部分 。应用碱解或酶解方法从麸皮等
农副产品中提取阿魏酸已有较多报道 [ 13-15] 。为了开
辟经济高效的定向生产特色风味烟用香原料的新途
径 ,利用分离自香荚兰植株的内生微生物转化阿魏酸
生产香兰素和愈创木酚衍生香味物 ,进而制备特征天
然香料应用于卷烟加香 ,作者讨论了该内生菌的分离
筛选 、天然香料的制备 、化学成分分析及其在卷烟加香
中的应用。
1　材料 、试剂与仪器
1.1　材料与试剂
香荚兰植株(2004年 10月采自云南省香荚兰公
司西双版纳种植基地);阿魏酸 、4-乙烯基愈创木酚 、
香兰素(标样 ,美国 Sigma-Aldrich公司);甲醇(SP,
美国 Fisher公司);阿魏酸 、磷酸二氢钾 、磷酸氢二钠 、
硫酸镁 、氯化钙 、硫酸亚铁 、硫酸锰 、钼酸钠 、氯化钠
(AR,上海试剂公司);二氯甲烷 、正己烷 、氯仿 、无水乙
醚 、冰醋酸(AR,广东汕头市西陇化工厂);酵母膏 、牛
肉膏 、蛋白胨(生物试剂 ,北京奥博星生物技术责任公
司)。
1.2　培养基
基础培养基(发酵):阿魏酸 1.0 g,酵母膏 1.0 g,
KH2PO4 0.9g, Na2HPO4 10 g, MgSO4·2H2O0.2g, CaCl2
0.1g, FeSO4·2H2O0.01g,蒸馏水定容至 1000mL, pH
为 7.0。
筛选培养基:在基础培养基基础上添加 MnSO4
0.6mg, Na2MoSO4 0.6 ng。
普通培养基(富集 ,种子培养):牛肉膏 3 g,蛋白胨
10g, NaCl5g,蒸馏水定容至 1000mL, pH值为 7.4 ～ 7.6。
以上培养基 121 ℃高压蒸汽灭菌 30 min。阿魏酸
经紫外线灭菌后根据需要加入 。
1.3　仪器
Waters2690型高效液相色谱仪 (美国 Waters公
司);Waters996型紫外检测器(美国 Waters公司);硅
胶 G板和 G254板(青岛海洋化工厂);ZF-1型三用
紫外分析仪 (上海顾村电光仪器厂);HP5890GC/
6972MS气相色谱 /质谱分析联用仪(美国 HP公司);
LG10型高速离心机(北京医用离心机厂)。
2　样品的处理与分析
2.1　产香菌的富集分离与鉴定
按照常规无菌操作 [ 13-14] ,取香荚兰植株不同部位
(气生根 、茎 、叶 、豆荚),按下列程序表面消毒:自来水
冲洗※剪切成小块(0.5 cm×0.5 cm)※ 75%酒精漂
洗(3 ～ 5min)※无菌水冲洗 3 ～ 4次※0.1%HgCl2漂
洗(10 ～ 30 s)※无菌水冲洗 5次 。将消毒过的植株材
料植于富集培养基平板上 , 28 ℃温箱培养 。待样品边
缘有菌落长出 ,分离 ,反复纯化得到纯菌株 。
将分离出的纯菌株分别接入筛选培养基中 ,
30 ℃、140 r/min摇瓶培养 5 d。每天观察记录发酵液
外观和香气特征变化情况 。对发酵液中的化学成分进
行薄层层析(TLC)检测;对 TLC检查出转化产物的发
酵液用高效液相色谱(HPLC)分析验证。
2.2　天然香料的制备
将筛选出的香荚兰产香内生菌株活化 ,活化菌株
接入种子培养基中 , 37 ℃、130 r/min摇床培养 24 h。
将培养好的种子液按培养液量 8%的比例 ,接入含转
化底物阿魏酸的发酵培养基 , 200 r/min、37 ℃摇床培
养 3d。用乙酸乙酯萃取发酵液 ,减压浓缩除去挥发性
溶剂 ,用 75%乙醇回溶浓缩物 ,制备出淡黄色的天然
香料。
2.3　天然香料中致香化学成分的分析
2.3.1　薄层层析(TLC)检测
用 50 mL乙酸乙酯分两次萃取摇瓶发酵液(25
mL×2),有机相合并备 TLC检测。用毛细管将样品液
与阿魏酸 -香兰素标液分别点样于硅胶 G板和 G254
板上 ,置于展开剂 [正己烷 -氯仿 -无水乙醚 -冰醋
酸(4∶3∶2∶1)]中展开 ,硅胶 G板在碘蒸汽中显色 ,硅
胶 G254板在波长为 254 nm的紫外光下显色 ,比较显
色的物质点呈现出的颜色 、Rf值与标准品是否一致。
为了进一步验证香兰素 ,向显色后的硅胶 G板上喷洒
2, 4-二硝基苯肼溶液(0.4%),用吹风机吹干 ,观察
显色情况。
2.3.2　高效液相色谱(HPLC)检测
准确吸取发酵液 2 mL,加入 2 mL甲醇稀释 ,微孔
滤膜过滤 , 滤液进行 HPLC分析 。色谱条件为:色谱
柱:WatersSymmetryC18柱 (3.9 mm×150 mm);流动
相:0.5%乙酸 -甲醇 (60∶40);流速:0.8 mL/min;柱
温:室温;进样量:10 μL;Waters996检测器于 290 nm
处检测;外标定量 。
2.3.3　气相色谱 -质谱(GC/MS)分析
用二氯甲烷萃取天然香味料 3次(25mL×3),合
并有机相 ,加无水硫酸钠干燥过夜 ,过滤 ,滤液经减压
浓缩掉大部分溶剂 ,得到淡黄色挥发性物质。所得挥
发性组分进行 GC/MS分析。条件:色谱柱:HP-5毛
细管柱(30 m×0.25 mmi.d.);柱温:50 ～ 250 ℃;程
序升温:8 ℃/min;载气:He;流速:40 cm3 /s;进样口温
度:250 ℃;进样量:1.0μL;分流比:50∶1。质谱条件:
32
电离源:EI;电离能量:70 eV;离子源温度:200 ℃;扫
描范围:30 ～ 500 amu。所得图谱经计算机谱库
(NBS75Wiley138)检索 ,并与各组分的裂解方式及有
关标准图谱资料 [ 16-17]核对鉴定。
2.4　天然复合香味料的卷烟加香应用
准确称取 0.05 g利用香荚兰内生菌制备的天然
香味料 ,加入 10g乙醇(50%),混匀后 ,用微量喷雾器
均匀地喷加在 50 g待试烟丝上。将加香烟丝卷制成
烟支 ,放入恒温恒湿箱内平衡后 ,组织专业评吸人员进
行评吸 。
3　结果和分析
3.1　香荚兰产香内生菌的分离和鉴定
从所选用的不同部位经消毒的香荚兰植株材料中
分离出 24株菌。 TLC点板检查显示共有 10株菌的发
酵液中存在香兰素;其中 ,发酵液中同时存在 4-乙烯
基愈创木酚的有 4株。依据不同样品卷烟加香初步试
验结果 ,从中选取发酵液香韵特征显著的香兰素和 4
-乙烯基愈创木酚斑点明显的菌株作为进一步研究的
出发菌 ,编号 Van-1a。按常规操作 [ 18]对菌株的革兰氏
染色 、碳氮源利用情况等生理特征进行试验 ,结合形态
结构观察结果确定该内生微生物为芽孢杆菌(Bacilus
sp.),来自于香荚兰气生根 。
采用高效液相色谱对 Van-1a发酵液进行检测 ,发
酵液样品中香兰素 、阿魏酸和 4 -乙烯基愈创木酚由
其保留时间及紫外光谱图与标样对照确定 ,并作了峰
纯度分辨 ,结果如图 1所示 。图 1显示:发酵样品中的
阿魏酸 、香兰素 、4-乙烯基愈创木酚的吸收峰保留时
间与标准品中的一致 。这表明:香荚兰内生菌 Van-
1a,具有转化底物阿魏酸产生香兰素和 4 -乙烯基愈
创木酚的能力。
3.2　GC/MS分离鉴定的天然复合香味料中的挥发性
香味化学成分
将筛选得到的香荚兰产香内生菌 Van-1a接入发
酵培养基中培养 3 d后 ,发酵液呈现淡黄色浑浊液体 ,
有浓郁的温和甜香 、熏香香韵。用乙酸乙酯萃取发酵
液中的挥发性香味物质 ,进行 GC/MS分析 ,经计算机
图谱检索并与标准质谱图对照 ,从中鉴定出 10种挥发
性香味成分(图 2、表 1),占总检出峰的 77.07%。它
们是香兰素 、香草酸 、丁香酚 、4-乙烯基愈创木酚 , 4-
乙基愈创木酚 、4-丙基愈创木酚 、4, 4 -二联愈创木
酚 、1-丁醇 、3-羟基 -2-丁酮 、2-乙基 -1-己醇。
　　在以上检出的香味化合物中 ,香兰素是存在于香
荚兰豆中 、赋予其主要感官特性的香味化合物 ,具有浓
而甜且持久的香荚兰豆特征气味。丁香酚带有强烈丁
香样辛香;含量较高的 4 -乙烯基愈创木酚及其同系
物乙基愈创木酚 、丙基愈创木酚带有烟草特征酚香 、温
甜香韵 ,被视为是阈值更低 、品质更高的替代愈创木酚
的烟用添加剂[ 19-20] 。在卷烟加香中 ,这几种香味化合
物都是非常重要的调配原料 ,用以修饰烟用香精的甜
香 、坚果香或辛香香韵 , 赋予卷烟丰满柔和的烟香
风味。
1.香兰素　2.阿魏酸　3.4-乙烯基愈创木酚
图 1　发酵液样品(a)和标样(b)的 HPLC谱图比较
图 2　天然香料中的挥发性化学成分总离子流图
表 1　香荚兰内生产香菌 Van-1a发酵制备的天然香料
中挥发性香气成分
序号 保留时间(min) 成分
相对百分
含量(%)
1 1.93 1-丁醇 0.34
2 2.30 3-羟基 -2-丁酮 0.05
3 6.42 2-乙基 -1-己醇 0.18
4 10.20 4-乙基愈创木酚 0.75
5 11.11 4-乙烯基愈创木酚 70.31
6 11.38 丁香酚 2.97
7 12.01 香兰素 0.63
8 12.63 4-丙基愈创木酚 0.09
9 12.74 香草酸 0.12
10 20.21 十六胺 0.17
11 21.12 4, 4 -二联愈创木酚 1.63
12 21.93 9-十八烯胺 1.15
33
　　另外 ,这些香味化合物均是构成天然香荚兰特征
香气的关键成分 ,与底物阿魏酸具有相同的愈创木酚
基(邻甲氧基苯酚)母体结构 ,由此可以确定:来源于
天然香荚兰植株的内生微生物 Van-1a在适宜条件下
能产生丰富的生物酶系 ,可作用于植物细胞壁组成物
质阿魏酸 ,产生以上对天然香荚兰豆特征香气构成有
重要影响的香味化合物。从结构的相关性可以推断:
天然复合香味料中的主要香味成分的生成经历了图 3
所示的合成途径 。 图 3　天然复合香料中主要香味成分的生物合成途径
3.3　天然复合香料在卷烟加料中的应用
采用 2.2制备方法 ,采用微生物菌株对 1 g阿魏
酸进行转化 ,可获得 17.6 g天然复合香味料 ,其中含
有 0.088 g香兰素 。评吸结果 (表 2)表明:天然复合
香料能与烟香较好谐调 ,具有提调烟香 、细腻醇和烟
气 、改善卷烟吸味的良好效果。
表 2　天然复合香料在卷烟加料中的应用试验结果
项目 细腻性 透发性 丰富性 干燥感 成团性 醇和性 杂气 刺激 舒适性 协调性
对照烟 较好 较好 - 一般 中等 较好 较好 较小 较小 较好 - 较好
样烟 好 较好 较好 小 较好 好 较小 较小 - 较好 较好 +
4　结论
从香荚兰气生根中分离到一株产香内生菌 Van-
1a,初步鉴定为芽孢杆菌(Bacilussp.)。在适宜条件
下 , Van-1a可转化阿魏酸生成含有香兰素及愈创木
酚衍生香味物的天然复合香味料 ,具有浓郁的温甜熏
香香韵 。
采用 GC/MS从该天然香味料中分离鉴定出 10种
挥发性香味化学成分 ,卷烟加香试验表明:天然复合香
味料能与烟香较好谐调 ,具有明显提调烟香 、细腻醇和
烟气 、改善卷烟吸味的良好效果 。
研究结果表明 ,将从农副产品中提取阿魏酸与生
物转化阿魏酸制备富含有效香味成分的天然复合香味
料结合起来 ,是一条从低廉原料生产高附加值产品的
有效途径。同时 ,由于复合香味料是由多种香味成分
有机组合而成 ,其香韵独特 ,应用效果良好 ,难以仿制 ,
也是一种能赋予卷烟特征香气风格的特色烟用香
原料。
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