全 文 ：收稿日期: 1997-03-27.
曹孟德 ,男 , 1964年生 ,博士 ;郑州 ,河南医科大学博士后流动站 ( 450052) .
* 医学博士论文的一部分 ,指导教师:王君健教授 .
香荚兰细胞悬浮培养产生香兰素的研究*
曹孟德　秦东春
　
(河南医科大学 )
　 陈奇才　
(信阳地区林业科学研究所 )
　 王君健华中理工大学
生物工程系
摘　要　研究了香荚兰细胞悬浮培养的生长周期、可溶性糖浓度、 pH值变化及植物生长调节剂对细胞生长
与香兰素产生的影响 .发现细胞悬浮培养生长周期以 14 d为宜 , NAA比 2, 4-D更适合细胞生长及香兰素形
成 .
关键词　香荚兰 ;悬浮培养 ;香兰素
分类号　 Q 81
　　香荚兰是世界上用得最广的香料 ,素有“食用
香料之王”的美誉 .其主香成分香兰素又名香草醛
( 3-甲氧基 -4-羟基 -苯甲醛 ) 含量较低 ,仅占香荚
兰豆干重的 2% ～ 3% .香兰素广泛存在于自然
界中 ,但主要从天然香荚兰豆中提取制备 .目前我
国的香兰素全是合成产品 ,人工合成的香兰素香
型单一 ,且在合成过程中易掺杂而影响其香味与
色泽 .由于香荚兰生长发育及其后期生香处理的
特殊性与复杂性 ,加之其香兰素含量不高 ,因此 ,
仅靠从天然香荚兰制备浸提物或天然香兰素是难
以满足市场需求的 ,而且价格昂贵 ,为一般消费者
难以接受 .为此 ,借助植物组织培养技术来生产天
然香兰素或许可以解决上述问题 .国外已在此方
面作了一些尝试 [1, 2 ] ,国内则未见报道 .
1　试验材料与方法
1. 1　供试材料与试剂
供试材料为继代培养 3次的墨西哥香荚兰愈
伤组织 .所用试剂均为分析纯级 .
1. 2　试验方法
1. 2. 1　香荚兰细胞的悬浮培养　将继代培养 3
次 (继代周期 4星期 )的香荚兰愈伤组织切成约
0. 5～ 1. 0mg重的小块接种到附加 30 g /L蔗糖、
1. 0mg /L 2. 4-D及 0. 1mg /L 6-BA的液体 MS
培养基中 (每 250 mL三角瓶装量为 100m L) ,
100 r /min, 28℃± 1℃下摇床培养 30 d,愈伤组
织在上述条件下则逐渐变成细胞或多细胞团 .
1. 2. 2　细胞活力的测定　参照文献 [3]方法进
行 .
1. 2. 3　可溶性糖的测定　参照袁晓华等 [4 ]采用
蒽酮比色法并稍加修改进行:根据培养时期培养
液糖浓度的不同适当稀释 ,取 100μL样液 ,加
5mL蒽酮试剂 ,摇匀后煮沸 5 min,取出后立即冷
却 ,用 721型分光光度计在 620 nm处比色 ,根据
标准曲线得出可溶性糖浓度 .
1. 2. 4　细胞生长的测定　细胞悬浮培养一段时
间后 ,抽滤 , 60℃烘至恒重 .以细胞干重作为其生
长的指标 .
1. 2. 5　细胞形态的观察　采用日本 OLYM PUS
BH-2型光学显微镜明视野及暗视野观察细胞形
态 .
1. 2. 6　培养液 pH的测定　采用国产 PHS-25型
雷磁酸度计测定培养液的 pH值 .
1. 2. 7　香兰素的提取与检测　参照文献 [1, 5,
6]的方法进行 .
2　结果与讨论
2. 1　香荚兰细胞的生长变化
2. 1. 1　生长曲线　香荚兰愈伤组织在附加
2, 4-D 1. 0mg /L, 6-BA 0. 1mg /L,蔗糖 30 g /L
的液体 MS培养基中培养 ,愈伤组织团块逐渐变
小 ,形成单个细胞或 10个以下细胞组成的小细胞
团 ,经 FDA染色测定 ,细胞活性达 86% ,经低速
离心分离 ( 500 r /min, 5min) 后 ,给细胞补充新
鲜培养基并在相同条件下继代培养 ,继代周期
10 d,继代两次之后 ,可以获得高密度的细胞悬浮
第 26卷 第 5期　 　　　　　华　中　理　工　大　学　学　报　　　　　　　 Vol. 26　No. 5
1998年　 5月　　　 　　　　 J. Huazhong Univ . o f Sci. & Tech.　　　 　　　　 May　 1998
DOI : 10. 13245 /j . hust . 1998. 05. 003
液 .以所得悬浮细胞为种子 ,按 100 mL液体培养
基接种鲜重 8 g香荚兰细胞所测定的细胞生长曲
线 dc (细胞干重 )如图 1.
图 1　香荚兰细胞悬浮培养生长及香兰素形成曲线
在试验过程中还发现 ,纤维素酶的加入虽有
利于分散愈伤组织块形成单个细胞 ,但是通过光
学显微镜及 FDA染色观察 ,细胞多已破碎 ,活细
胞数低于 20% ;香荚兰细胞体积较大 ,细胞壁较
薄 ,呈蚕豆状或卵圆形 ,当摇床转速高于 120
r /min时 ,细胞易破碎 .因此 ,香荚兰细胞同其他植
物细胞一样 ,对搅拌时引起的流体剪切力很敏感 .
在香荚兰细胞培养的三个生长期培养物均含有细
胞团块和游离细胞 .
2. 1. 2　可溶性糖浓度的变化　在 14 d的培养时
间中 ,培养液中可溶性糖浓度 ds在细胞生长期间
不断下降 ,反映出细胞生长在吸收、利用培养液中
的碳源 ,在培养前 11 d,培养液中可溶性糖浓度随
培养时间的增加而几乎成直线下降 ,到第 11 d降
至最低 ,但 11 d后 ,糖浓度维持基本不变 (如图
2) .
图 2　培养基中糖浓度的变化
2. 1. 3　 pH变化　从图 3中可知 ,在香荚兰细胞
的培养周期中 ,培养液的 pH也在发生变化 ,在培
养中的前 9 d, pH值逐渐降低 , 9 d之后 , pH值几
乎维持不变 . pH的降低可能与培养细胞有机酸
的产生及铵盐的利用相关联 .在生长周期的前一
阶段 ,培养细胞代谢旺盛 ,呼吸强度大 ,有机酸增
加 ,此外 ,这一阶段主要以 NH+4 作为氮源 ;由于
N H
+
4 利用完后 ,培养细胞又以 NO-3作为氮源 ,硝
盐的消耗使溶液趋向碱性 ,应使溶液 pH回升 ,但
未见有 pH增高 ,这可能是后期细胞大量形成香
兰素及其相关化合物 ,香兰素等是含有酚羟基之
类基团的一类化合物 ,呈酸性 ,进而维持 pH值恒
定 .
图 3　培养基中的 pH变化曲线
2. 2　植物生长调节剂对香荚兰细胞生长及香兰
素产生的影响
植物生长调节剂对香荚兰细胞生长及香兰素
产生的影响见图 4.虽然各培养基中激素种类与
浓度不同 ,对香荚兰细胞的生长有影响 ,但这种影
响不是十分明显 ,因为最终细胞生物量在 9～
11 g /L之间变化相差不大 .相比较而言 ,萘乙酸
( N AA) 比 2, 4-D,低浓度的 6-BA ( 0. 2 mg /L )
比高浓度 6-BA ( 1. 0 mg /L) , 6-BA比 KT更利于
细胞的生长 .但是激素对香兰素的产量影响却十
分明显 ,在含有 2, 4-D的培养基中香兰素很少 ,
如图 4中的 1和 3,分别为 1. 45mg /L和 2. 24
mg /L;如果用 NAA替代 2, 4-D,则香兰素含量明
显增加 ,如图 4中的 2,达 7. 37mg /L.另外从图
图 4　激素对细胞生长及香兰素含量的影响
1. 2, 4-D 1. 0 mg /L+ 6-BA 0. 1 mg /L;
2. N AA 1. 0 mg /L+ 6-BA 0. 1 mg / L;
3. 2, 4-D 0. 1 mg /L+ 6-BA 0. 2 mg /L;
4. 2, 4-D 0. 1 mg /L+ 6-BA 1. 0 mg /L;
5. N AA 0. 5 mg /L+ KT 0. 5 mg / L;
6. N AA 0. 5 mg /L+ 6-BA 0. 5 mg / L
中可以看出 ,增加细胞分裂素的使用可 以部分解
除 2, 4-D对次生代谢的抑制作用 ,如图 4中的 4,
香兰素产量达 4. 76mg /L,是 3的两倍多 ; N AA
与细胞分裂素结合使用可以导致相对多的香兰素
的产生 .许多研究均表明 , 2, 4-D对植物细胞悬浮
培养中次生代谢有抑制作用 .在本实验中也发现
2, 4-D对香荚兰细胞悬浮培养产生香兰素有明显
的抑制作用 .
9第 5期　　　　　　　　　　曹孟德等: 香荚兰细胞悬浮培养产生香兰素的研究　　　　　　　　　　　　　
2. 3　香荚兰细胞悬浮培养物香兰素的形成
考虑到 2, 4-D对香荚兰细胞悬浮培养产生
香兰素有抑制作用 ,将香荚兰细胞接种到附加
NAA ( 1. 0 mg /L) , 6-BA( 0. 1mg /L ) 及 30 g /L
蔗糖的 MS液体培养基中进行悬浮培养 14 d,香
荚兰细胞生长及培养液中香兰素形成的变化及其
检测结果如图 1曲线 dv .
由图 1可知 ,香荚兰细胞在接种后的第四 d
培养液中即可检测到香兰素的存在 ,说明香荚兰
细胞是外泌型的 ;细胞指数生长期 ,香兰素的量稳
步上 升 , 形成速 度约为 每 d 每 L 培养 基
0. 948mg;在静止期 ,香兰素形成速度加快 ,约为
每 d每 L培养基 1. 42 mg.上述实验结果表明 ,香
荚兰细胞悬浮培养香兰素的形成与细胞生长呈负
相关 ,细胞生长缓慢则有利于目的产物的形成 .通
常在快速生长、未分化的培养物中仅积累少量的
次生产物 ,这种细胞生长与次生代谢间的负相关
的原因分析如下 .一是两者竞争共同的前体 ,如多
酚化合物的合成即与蛋白质的合成竞争苯丙氨
酸 .香兰素是香荚兰细胞苯丙素类化合物代谢过
程中的中间代谢物阿魏酸以类似脂肪酸 β -氧化
的形式形成的 .次生代谢是在初生代谢进行到一
定阶段才开始的 ,特别是当两条代谢途径共用某
些前体物或中间体时尤其如此 .二是由于次生代
谢所需的酶在生长速度降低或生长停止时才能合
成的缘故 .
从图 1中亦可知 , 14 d后若继续培养 ,香兰
素量则下降 .香兰素产量下降的原因可能是被进
一步代谢成其他化合物或被空气氧化成香兰酸的
缘故 .因此 ,我们认为香荚兰细胞悬浮培养生产香
兰素 , 14 d的培养周期较为适宜 ,香兰素产量在第
11 d达最高值 ( 7. 58mg /L) .香荚兰细胞生长与
产物形成的动态变化类型是非生长偶联型 ,因此 ,
香荚兰细胞的大规模培养可以考虑用分批培养或
者固定化培养 .
华中理工大学生物工程系李家儒老师参加了
部分工作 ,在此表示感谢 .
参 考 文 献
1　Westco tt R, Jcheetham P S J, Ba rr aclough A J. Use
o f O rganized Viable Vanillla Plant Roo ts fo r the Pro-
duc tion o f Natura l Vanillin. Ph yto chem. , 1994, 35
( 1): 135～ 138
2　 Kno r r D, Caster C, Doerneburg H, e t al. , Bio syn-
thesis and Yield Improvement of Food Ing redient
from Plant Cell and Tissue Cultur es. Food Techno l. ,
1993, 47 ( 12): 57～ 63
3　李浚明 .植物组织培养教程 .北京: 北京农业大学出版
社 , 1992.
4　袁晓华 ,杨中汉 .植物生理生化实验 .北京: 高等教育
出版社 , 1983.
5　江志浩 ,韩梅芳 ,陈益勤 .用薄层层析法测定香兰素含
量 .化学世界 , 1988 ( 1): 24～ 27
6　范国良 ,张鸿礼 ,周维义等 .用反相高效液相色谱分析
香兰素和邻香兰素 .化学世界 , 1989 ( 2): 65～ 68
Study on Vanillin Production by Batch Cell Suspension
Culture of Vanilla Planifolia
Cao Mengde　 Qin Dongchun　Chen Qicai　Wang Junjian
Abstract　 The subcul ture intervals, v ariations of soluble sugar contents and pH values and effects of
plant g row th regula to rs on cell grow th and vanillin production w ere studied during batch cell suspen-
sion cul ture of Vanil la planifolia. It was found that the proper subculture interval w as 14 day s, N AA
could improve the cell g row th and biosynthesis of vani llin, and the inhibition of 2, 4-D on the fo rma-
tion of v anillin could be allev iated part ly by using cy tokinins in combination of it.
Keywords　Vanilla planifol ia; suspension culture; v ani llin
Cao Mengde　 Ph. D. ; Henan M edical Univ ersi ty, Zheng zhou 450052, China.
10　　　 　　　　　　　　　　　　　华　中　理　工　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　 1998年