全 文 ：台湾引进甜杨桃的两种真菌病原鉴定
刘　韬1 , 肖荣凤2 , 刘　波2 , 黄素芳2 , 阮传清2 , 林　捷1
(1.福建省农业科学院生物技术研究所 , 福建　福州　350003;
2.福建省农业科学院农业生物资源所 , 福建　福州　350003)
收稿日期:2011-01-02初稿;2011-02-19修改稿
作者简介:刘韬 (1962-), 男 , 高级农艺师 , 研究方向为果树学 、 生态农业
通讯作者:刘波 (1957-), 男 , 博士 , 研究员 , 研究方向:微生物技术与农业生物药物
基金项目:福建省科技计划重点项目 2007N0032;公益性行业 (农业)科研专项 (200903034)
摘　要:对福建闽南地区种植的从台湾引进的甜杨桃进行真菌性病害的鉴定。 在病害症状和病症组织病理学鉴
定的基础上 , 进行菌株的 rDNA-ITS 区序列 PCR扩增 , 测序结果在 GenBank 中进行同源性搜索 , 下载部分具有
代表性属或种的 ITS 序列 , 利用软件 MEGA4 构建分子系统发育树;按照柯赫氏法则对病原物进行了致病性测
定 , 回接后的叶片或果实上产生与田间自然侵染相同的症状 , 重新分离到相同病原物。通过病原形态 、 rDNA-
ITS 序列及致病性分析 , 确定发生在叶片与果实上的 2 种主要真菌性病原 , 分别是引起叶斑病的拟茎点霉
(Phomopsis sp.)和果实 、 叶片炭疽病的胶孢炭疽菌 (Colletotrichum gloeosporioides)。
关键词:甜杨桃;病害;鉴定;拟茎点霉;胶孢炭疽菌
中图分类号:S 687 文献标识码:A
Identi fication of Two Fungal Pathogens in Sweet Carambola from Taiwan
L IU tao1 , XIAO Rong-feng2 , LIU Bo2 , HUANG Su-fang 2 , RUAN Chuan-qing 2 , L IN Jie1
(1.Institute o f Biotechnology , Fujian Academy of Agricultural S ciences , Fuzhou , F ujian　350003 , China;
2.Agricultural Bio-resources Research Institute , Fuj ian Academy of Agricultural Sciences ,
F uz hou , Fuj ian　350003 , China)
Abstract:Fungal diseases of the sweet carambola , Averrhoa carambola L., intr oduced f rom Taiwan we re
investig ated.The infected samples we re co llected f rom southern Fujian. Two fungal pathogens w ere identified by
using histopatho lo gy and the ribo somal DNA internal transc ribed spacer(ITS)sequencing.By comparing with the
co rr esponding sequences in GenBank , the phy lo genetic trees fo r the strains , SC-01 and SC-06 , were constructed.
The two isolates we re re-inoculated by the Kochs rule to the leaves and fruits to produce identical symptoms as
obse rved in the field.Subsequently , it w as confirmed that the leaf spo t w as caused by Phomopsis sp., and the leaf
and fruits anthracnose by Collotrichum gloeosporioides.
Key words:sweet carambo la;disea ses;identify;Phomopsis sp.;Colletotrichum gloeosporioides
　　杨桃 Averrhoa carambolaL .属酢酱草科 , 可
分为甜杨桃和酸杨桃两大类 , 以甜杨桃品质为好 。
甜杨桃原产热带 、南亚热带地区 , 属常绿小乔木果
树[ 1-2] 。福建省原有的杨桃品种多为酸杨桃 , 不宜
直接食用 , 限制了杨桃在福建省的发展[ 3] 。台湾水
果业发达 , 技术先进 , 品质优良 , 单产高 , 效益
好。近年来 , 随着闽台农业交流的加强 , 相继从台
湾引进了一些优质的甜杨桃品种 , 因其风味清甜可
口 , 具有生津止渴 、 清热解暑和调味等功能而深受
人们的青睐 , 使得甜杨桃在福建省的种植面积逐年
增加 。良好的配套栽培技术是甜杨桃品质与产量的
保证 , 其中病害的管理是不可忽视的环节 , 目前有
关福建省的甜杨桃生产过程中发生的常见病害还未
见详细的诊断报道 。传统的病害诊断方法主要是田
间植株发病症状的实地观察 、病菌的分离培养和形
态学鉴定 , 该方法需要有丰富的病害诊断经验 , 否
则容易出现误诊。本研究在病害症状与病原形态特
征观察的基础上 , 利用分子鉴定方法鉴定了福建省
闽南地区种植的甜杨桃上发生的 2种主要真菌性病
原菌。现将结果报道如下。
1　材料与方法
1.1　症状观察
甜杨桃品种为台农 2 号 , 种植于闽南地区。
福建农业学报 26(3):409 ～ 414 ,2011
F ujian Journal o f Agricultural Sciences
文章编号:1008-0384 (2011)03-409-06
2009年在甜杨桃树开花 、 结果和果实成熟期进行
病害调查和标本采集 。病害症状以肉眼观察为主 ,
结合显微镜进行观察描述 。
1.2　病原真菌形态学鉴定
1.2.1　切片镜检　取有明显病症的叶片或果实的
新鲜病组织进行徒手切片 , 利用光学显微镜对病原
菌进行形态特征观察 、测量和显微拍照[ 4] 。
1.2.2　分离培养　取症状明显的病组织采用常规
的组织分离法进行病菌的分离[ 5] 。切取病健交界处
的新鲜组织 0.5 cm ×0.3 cm 大小的薄片 , 经 75%
酒精处理 2 s , 再用 0.1%升汞处理 2 ～ 3 min后 ,
用无菌水清洗 3遍 , 置于马铃薯蔗糖琼脂培养基
(PSA)上培养 , 每皿放 5片病组织 , 共分离 10个
样本 , (25±1.5)℃培养 , 分离培养物经纯化保存 。
收集菌丝用于 DNA 提取并进行分子鉴定。
1.3　病原真菌的分子鉴定
1.3.1　rDNA-I TS 区扩增　取 1.2.2中的纯化保
存的培养物 , 采用 CTAB法提取 DNA 及上海生工
生物工程技术服务有限公司合成的真菌通用引物扩
增。
正向引物 (ITS4):
5′-TCCTCCGCT TAT TGATA TGC-3′,
反向引物 (ITS5):
5′-GGAAGTAAAAG TCG TAACAAG 。
PCR反应的总体积为 25 μL , 含有 1个单位的
Taq酶 、 10 ×buf fer 2.5 μL 、 dNTP 0.2 μL 、 10
μmo l·L-1的正向引物和反向引物各 1 μL 、 DNA
模板 25 ng 。PCR扩增程序:94℃预变性 10 min ,
94℃变性 1 min , 55℃退火 1 min , 72℃延伸 2
min , 共 25个循环 , 最后 72℃延伸 10 min。PCR
产物经琼脂糖凝胶电泳 , 切胶回收。
1.3.2　PCR产物的直接比对分析测序　将回收的
目的片断送交上海生工生物工程技术服务有限公
司 。将测得的序列通过国际互联网 (ht tp://
www.ncbi.nlm.nih.gov)进行 Blastn 检索 , 并下
载相关序列 , 用 Clustal W 软件进行比对后进行手
工校正 。系统发育树分析采用软件 MEGA 4 中的
邻近相邻法进行 , 利用 boo tst rap (1 000 次重复)
检验各分支的置信度[ 6] 。
1.4　病原真菌的致病性测定
根据柯赫氏法则 ,将叶片及果实上分离的病菌
原 ,采用针刺接种法接种到新鲜无病杨桃嫩枝叶片上
或果实上 ,保湿培养 ,观察症状 ,并重新分离病原菌。
2　结果与分析
2.1　杨桃叶部和果实病害症状
2.1.1　杨桃叶斑病害症状　杨桃叶部病斑圆形 、
近圆形至不规则形 , 初期褐色 (图 1A), 后变为灰
褐色 , 边缘褐色至红褐色 , 上生小黑粒点 , 有些病
斑破裂形成穿孔 (图 1B)。
图 1　叶斑病症状
Fig.1　Symptom of leaf spot
A.发病初期;B.发病后期
2.1.2　杨桃炭疽病害症状　为害甜杨桃叶片与果
实 , 叶片症状为叶尖 、叶缘 、 叶面均可形成不规则
病斑 , 中部灰白色至淡褐色 , 边缘有明显的褐色条
纹 , 上面密生小黑点 (图 2A 、 2B)。果实上症状
多发生于近成熟或成熟的果实上 , 造成落果和果实
腐烂 , 初期病斑略凹陷 , 淡褐色 , 圆形或近圆形;
后期病斑黑色 , 其上着生黄色小粒点 , 病组织可扩
展到果内 , 引起果实腐烂 (图 3A 、 3B)。
410 福建农业学报 第 26卷
图 2　叶片炭疽病症状
Fig.2　 Symptoms of anthracnose on the leaf
A.发病初期;B.发病后期
图 3　果实炭疽病症状
Fig.3　Symptoms of anthracnose on fruit
A.发病初期;B.发病后期
2.2　病原真菌形态学鉴定
2.2.1　叶斑病病原菌形态特征　经显微镜观察 ,
分生孢子器球形或扁球形 , 壁厚 , 埋生 , 有孔口 ,
大小为 90.0 (95.0 ～ 150.8)μm ×68.8 (52.5 ～
108.0)μm 。分生孢子卵圆形 , 单胞 , 无色 , 大小
为 2.65 (1.5 ～ 2.5)μm × 1.5 (1.2 ～ 2.0)μm ,
产孢细胞圆柱形 (图 4)。叶斑病发病初期时叶片
病斑上未见子实体 (图 1A), 采用 1.2.2方法进行
分离培养 , 培养物的菌丝呈乳白色 、 羽毛状 (图
5)。取 5个培养物保存 , 编号分别为 SC-01 至 SC-
05。根据病原菌显微镜检的形态学及分离物的菌落
形态特征 , 参照陆家云[ 4]的相关描述 , 初步鉴定为
拟茎点霉(Phomopsis sp.)。
2.1.2　炭疽病病原菌形态特征　经显微镜观察 ,
分生孢子盘盘状或垫状 , 生于寄主植物表皮下 , 散
生或合生 , 成熟后不规则开裂且产生大量刚毛 , 直
径 102.7 (49.5 ～ 179.0)μm 。分生孢子长椭圆形 ,
无色 , 单胞 , 表面光滑 , 顶端钝圆 , 大小为 16.2
(9.0 ～ 19.0)μm×5.5 (3.5 ～ 6.8)μm , 初步鉴定
图 4　病原菌的分生孢子器及分生孢子
Fig.4　Pycnidium of pathogen
为炭疽菌 (Colletotrichum sp.)(图 6A 、 6B)。果
实炭疽病早期其果实病斑上未见子实体 (图 3A),
采用 1.2.2方法进行分离培养 , 培养物呈灰白色和
灰褐色 (图 7), 取 5 个培养物保存 , 编号分别为
SC-06至 SC-10。
411第 3期 刘　韬等:台湾引进甜杨桃的两种真菌病原鉴定
图 5　叶斑病病原菌的菌落形态
Fig.5　Colony morphology of Phomopsis sp.
图 6　叶片 (A)和果实 (B)病斑的病原菌分生孢子盘
Fig.6　Acervulus of pathogens on the leaf(A)and fruit(B)
2.3　病原菌的分子鉴定
取叶斑病叶片分离培养物 SC-01和果实炭疽病
分离的培养物 SC-06进行测序分析 , 测得的片段大
小分别为 517 bp和 600 bp , 在 GenBank 上的登录
号分别为 HM146133 和 HM146134。将序列在
GenBank 数据库中进行 Blastn 搜索 , 得到一系列
图 7　炭疽病病原菌的菌落形态
Fig.7　Colony morphology of Colletotrichum sp.
具有一定相似性的 ITS序列 , 菌株 SC-01 的序列
与 GenBank 数 据 库 中 拟 茎 点 霉 的 无 性 态
Phomopsis sp.和有性态 Diaporthe sp.菌株的序
列相似性高达 95%以上。菌株 SC-06 的序列与
GenBank 数据库中胶孢炭疽菌 C.g loeosporioides
和有性态 Glomerel la cingulata 菌株的序列相似性
高达99%以上。根据 Renske Landew eert等[ 7] 认为
真菌通过 I TS 区域比对 , 序列相似性>99%, 鉴
别为相同种;序列相似性>95%且<99%, 鉴别为
相同属;序列相似性≤95%, 鉴别为相同科。初步
认为菌株 SC-01 的病原菌属于拟茎点霉属 , 菌株
SC-06的病原菌属于胶孢炭疽菌种。
进一步下载数据库中临近属或种同源性的 ITS
序列与其对位排列后 , 利用 MEGA4 软件的邻近
相邻法构建系统发育树 (bootstrap值大于 50被显
示 , 树枝上方数值为 boo tst rap 值)。从系统发育
树中可以看出 , 菌株 SC-01 与拟茎点霉的无性态
Phomopsis sp.和有性态 Diaporthephaseolorum
序列以 99%的置信度聚在一支上 , 亲缘关系最近 ,
结合它们之间的同源性大于 95%, 可确定分离的
叶斑病病原菌为拟茎点霉 (图 8)。菌株 SC-06与
GenBank 数据库中胶孢炭疽菌 C.g loeosporioides
和有性态 G.cingulata 菌株以 99%的置信度聚在
一支上 , 亲缘关系最近 , 结合它们之间的同源性大
于 99%, 可确定分离的炭疽病原菌为胶孢炭疽菌
(图 9)。
2.4　病原真菌的致病性测定
杨桃叶片上分离的拟茎点霉菌与炭疽菌分别针
刺接种到新鲜嫩叶正面保湿培养 , 拟茎点霉菌约 7
d 、炭疽菌约 5 d , 可分别在叶片上形成大小约 3
412 福建农业学报 第 26卷
图 8　菌株 SC-01 基于 ITS 序列构建的分子系统发育树
Fig.8　Phyogenetic tree based on ITS sequences and constructed using Neighbor-joining method for strain SC-01
图 9　菌株 SC-06 基于 ITS 序列构建的分子系统发育树
Fig.9　Phyogenetic tree based on ITS sequences and constructed using Neighbor-joining method for strain SC-06
mm 的病斑 , 杨桃果实上分离的炭疽菌针刺接种到
新鲜无病杨桃果实上 , 约 10 d 出现 7 mm 大小的
炭疽病症状 , 重新分离感病部位的病健交界处病组
织 , 可分离到与接种病原菌相同的病原物 , 证实了
所分离病原物是杨桃的致病菌 。
3　讨　论
杨桃生产过程中真菌与藻类引起的病害是其主
要病 ,在国内外已有文献资料报道。在我国 ,何新
华[ 8]报道的杨桃病害有根腐病 、梢枯病 、叶斑病和粉
霉病 Corticum salmonicolor 及一些贮藏期病害如
褐色蒂腐病 Phomopsis spp.、黑斑病 Aiternaria
ai ternata 、炭 疽 病 C.gloeosporioides 、黑 点 病
Phoma averrhoiae 、 黑 霉 病 Cladosporium
Cladosporioides 、霉烟病 Leptothy rium spp.和果腐
病 Cladosporium herbarum 等。在国外 ,如在美国
佛罗里达州有报道炭疽病 、衰退病 Py thium
sp lendens 、藻斑病 Cephaleuros v irescens 、霉烟病和
叶斑 病 , 其中 叶斑 病可由 多种 病原 引起 如
Cercospora averrhoa , Corynespora cassi icola ,
Phomopsis sp., Gloesporium sp., Phy l lost icta sp.
等[ 9 -11] 。此外 ,其他学者也对叶斑病 、赤斑病和炭
疽病有过简单描述[ 12-15] 。
本试验在田间调查的基础上 , 结合病理学及分
子生物学鉴定对台湾引进的甜杨桃在田间主要发生
的 2种真菌性病害 (叶斑病与炭疽病)进行了调查
分析。通过症状 、 病原及分子鉴定确定了采集的叶
斑病由拟茎点霉属 , 但其病害早期症状与文献报道
的杨桃赤斑病[ 13] 的症状极易混淆 , 其病原菌的形
态与茎点霉属 Phoma sp.较为相似[ 4] 。另一种是
为害叶片与果实的炭疽病 , 其病原为胶孢炭疽菌。
上述鉴定结果是种植在福建闽南地区甜杨桃上的 2
种病害的病原菌 , 与国内外报道的一致。
叶斑病一般是出现在果树的老叶及生长营养条
件不足的时候 , 可引起枝叶干枯 , 明显减少叶片的
光合作用面积 , 导致植株早衰 , 影响果实发育 。炭
疽病是一种周年流行的病害 , 为害叶片与果实 , 如
为害果实 , 将严重影响果实的品质与产量。因此 ,
对于杨桃上常见真菌性病害 , 如果能在病斑上的子
实体或菌丝体还未形成前 , 通过病原培养与 PCR
413第 3期 刘　韬等:台湾引进甜杨桃的两种真菌病原鉴定
扩增鉴定进行早期诊断 , 一方面可进行针对性防
治 , 另一方面通过及时有效防治可防止子实体随气
流 、 雨水等环境条件进行扩散传播 , 减少侵染源 。
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(责任编辑:柯文辉)
414 福建农业学报 第 26卷