全 文 ：西北林学院学报 2006, 21( 5): 102～ 105
Journal of No r thw est Fo r estry Univ e rsity
影响农杆菌介导的河北杨遗传转化的因素
⒇
贾小明 ,　樊军锋*
(西北农林科技大学林学院 , 陕西杨陵 712100)
摘　要: 从预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间、共培养时间及添加 AS(乙酰丁香酮 ) 5个方面 ,以
卡那霉素抗性芽频率作为衡量指标 ,研究了各因素对河北杨遗传转化率的影响。优化筛选的最适转
化系统为:预培养 2 d,农杆菌活化菌液 1 /2M S稀释 10倍 ,侵染 5 min,共培养 4 d。按此方法河北杨
叶盘转化率可达 35% 。
关键词: 河北杨 ; 遗传转化 ; 转化率
中图分类号: S792. 119. 04　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001-7461( 2006) 05-0102-04
Factors Affecting Agrobacterium Mediated Transf ormation of Populus hopeiensis
JIA Xiao-ming, 　 FAN Jun-feng*
(Col lege of Forestry , Northwest A & F University Yang lin g Shaan xi 712100,China )
Abstract: The ef fects of inf luencing factors w ere studied, such as pre-culture time, Agrobacterium concen-
tration, infection time, co-cul ture time and adding AS on genetic t ransformation f requency of Populus
hopeiensis , of w hich the f requency o f kanamycin resistance buds w as used as measure standard. The supe-
rio r transforma tion system w as as follow ing, pre-cultured tw o days and then infected 5 minutes in A-
grobacterium diluted ten times w ith 1 /2M S liquid medium , co-cul tured four days at last. The t ransfo rma-
tion f requency of leaf disc of Populus hopeiensis would reach to 35% with this sy stem.
Key words: Populus hopeiensis; g enetic transforma tion; t ransfo rmation f requency
　　植物遗传转化 ( g enetic t ransfo rmation)是指利
用重组 DNA技术 ,借助细胞组织培养技术 ,将外源
基因导入植物细胞 ,获得转基因植物的技术 [1 ]。可以
定向改造植物性状、育种周期短 ,倍受育种学家的青
睐。遗传转化多应用于草本植物 ,木本植物相对较
少。木本植物遗传转化存在 2大难题 [1～ 11 ]。其一多数
树种离体再生困难 ,其二转化率低。 因此 ,对于离体
再生不成问题的树种 ,进一步研究影响其遗传转化
的因素 ,找出最佳转化方案 ,才能最终通过转基因技
术改良其种性。影响木本植物遗传转化的因素很多 ,
内因主要有 ,农杆菌菌株、树种及基因型等 ,外因有
预培养、侵染菌液 pH值及浓度、侵染时间、共培养
时间、酚类化合物等 [ 7～ 9]。河北杨 ( Populus hopeien-
sis )是我国西北地区重要乡土树种 ,为西北、华北黄
土丘陵峁梁、沟坡及沙滩地的重要水土保持和造林
树种 [14 ]。关于河北杨遗传转化的研究目前尚未见报
道 ,本研究在河北杨叶片离体再生系统建立的基础
上 ,通过对影响遗传转化频率的几个主要因素的研
究 ,筛选优化适合河北杨遗传转化的因子 (处理 )组
合 ,为该树种基因转化提供实验依据。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
河北杨采自西北农林科技大学林学院渭河试验
站杨树基因库。温室水培休眠枝条 ,用萌发的嫩枝建
立无菌苗体系。 本试验用河北杨无菌苗叶片。
1. 2　培养基
基本培养基为: 1 /2M S培养基。
⒇ 　收稿日期: 2005-12-06　修回日期: 2005-12-26
　基金项目:科技部转基因专项“耐盐、抗虫转基因杨树新品种选育” ( JY03-B-26-02)、西北农林科技大学校专项“杨树优良无性系高效遗
传转化受体系统的建立” ( 05ZR051)、“国家林业局黄土高原林木培育重点实验室”资助
　作者简介:贾小明 ( 1973- ) ,男 ,甘肃泾川人 ,讲师 ,从事林木遗传育种的教学与研究。
* 通讯作者:樊军锋 ( 1963- ) ,男 ,陕西扶风人 ,副研究员。
叶片不定芽诱导培养基为: 1 /2M S+ 0. 25 mg
· L- 1 6-BA+ 0. 01 mg· L- 1 TDZ+ 0. 25mg· L- 1
IAA。
叶片不定芽筛选培养基为: 不定芽诱导培养基
+ 500 mg· L- 1羧苄青霉素 ( Cb)+ 30 mg· L- 1卡那
霉素 ( Km)。
1. 3　基因、质粒及农杆菌菌株
双价抗虫基因 BtCry1Ac (部分改造的 Bt.基
因 ) / API(慈菇蛋白酶抑制剂基因 )表达载体 pBtiA
由中科院微生物所构建 ,其上具有选择性标志基因
——新霉素磷酸转移酶基因 N PTⅡ (抗卡那霉素基
因 )。农杆菌菌株为 LBA4404,每 1个月在 YEP半固
体平板培养基 (附加 50 mg· L- 1Km)上活化一次 ,
平时贮藏于 4℃冰箱。
1. 4　菌的活化
转化前一天 12 h,用接种环取保存在 YEP半固
体培养基上的含有 BtCry1Ac / API的 LBA4404单
菌落 ,接种到 YEP液体培养基 200 mL中 , 28℃ , 150
r /min,过夜振荡培养 ,使农杆菌处于旺盛对数生长
期。转化前 ,以 5倍 1 /2M S液体培养基稀释菌液后转
化。
除过转化菌液稀释倍数的试验 ,其他试验均按
上述方法进行。
1. 5　转化方法
采取 Horsch发明的叶盘法。
取杨树叶片若干片 ,用手术刀在叶脉处横切划
痕后放入活化农杆菌 1 /2M S稀释液中 ,浸泡 5 min
后取出 ,接种在不含任何抗生素的芽诱导培养基中。
25± 2℃暗室中共培养 5 d后 ,再转入含有 500 mg /L
羧苄青霉素 (用于杀死过量农杆菌 )的芽诱导培养基
中培养 7 d,转入含有 500 mg /L羧苄青霉素 (用于杀
死过量农杆菌 )及含不定芽诱导临界浓度抗生素 (卡
那霉素 30 mg· L- 1 )的芽诱导筛选培养基中继续培
养。转化不定芽因体内含有抗性标记基因 ,能在含有
临界浓度抗生素的培养基上生长 ,未转化不定芽因
体内不含有抗性标记基因 ,不能在含有临界浓度抗
生素的培养基上生长存活。每 10～ 15 d换 1次筛选
培养基。
在每个转化因子筛选试验中 ,除过本因子 ,其他
未涉及的因子处理均按上述方法进行。
1. 6　转化因子试验设计
1. 6. 1　预培养时间　转化前 ,分别设置 0 d(对照 )、
1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 d预培养 ,培养基为不顶芽诱导培
养基。
1. 6. 2　侵染菌液浓度　遗传转化中 ,对菌液浓度的
确定都是用 OD600值确定 ,不利于无菌操作。 为了简
化试验程序 ,我们将每次活化农杆菌的 Y EP培养基
体积确定为 200 mL,过夜振荡培养至稀奶状并无絮
状沉淀产生即为对数生长期 ,然后对此菌液用 1 /2
M S培养基稀释不同倍数 ,以研究稀释此状态农杆
菌对河北杨转化率的影响。稀释倍数设置 0、 5、 10、
20、 30倍 5个处理。
1. 6. 3　侵染时间　设置 1、 5、 10、 15 min 4个处理。
1. 6. 4　共培养时间　设置 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 d 7个处
理。
1. 6. 5　共培养中添加 AS　共设置 0、 50、 100、 200
μmol· L- 1 4个处理。
1. 6. 6　转化率评价指标　以转化后不定芽筛选培
养基中 60 d后保留的卡那霉素抗性芽百分率作为
评价转化频率的指标。
转化率 (% )= [ ( 60 d后保留的不定芽 ) / ( 60 d
后保留的不顶芽+ 死亡的不定芽 ) ]× 100%
2　结果与分析
2. 1　预培养时间对转化率的影响
结果表明 (表 1) ,适当时间的预培养可以提高河
北杨叶片转化率 ,但随着预培养时间的延长 ,转化率
呈现先升高后降低的趋势 ,预培养 2 d的转化率最
高 ,为 12. 36% ,预培养 4 d以上的时候 ,转化率降至
0。可能是由于长时间的预培养 ,使叶片伤口细胞再
次由脱分化状态进入分化状态 ,不利于外源 DNA的
进入和整合。
表 1　预培养时间对河北杨转化率的影响
Table 1　 Ef fects of pre-culture tim e on genetic transformation
f requency of P . hop eiensis
预培养
时间 /d
接种叶
片数
60 d后保留的
不定芽数 /个
60 d后死亡的
不定芽数 /个
转化率
/%
0 30 5 71 6. 58
1 30 8 67 10. 67
2 30 11 78 12. 36
3 30 3 75 3. 85
4 30 2 73 2. 67
5 30 0 84 0. 00
6 30 0 66 0. 00
7 30 0 75 0. 00
2. 2　菌液浓度对转化率的影响
试验发现 ,河北杨对农杆菌感染比较敏感 ,直接
用活化后的菌液侵染 ,由于农杆菌浓度过高 ,叶片产
生过敏性反应 ,导致在培养中会逐渐褪绿坏死 ,褪绿
首先发生在最易产生不定芽的叶脉切口处 ,最后蔓
延至整个叶片 ,完全不能产生不定芽。随着菌液稀释
103第 5期 贾小明等　影响农杆菌介导的河北杨遗传转化的因素
倍数的增加 ,叶片坏死减少 ,不定芽数量增加 ,但转
化率却呈下降趋势 (表 2)综合考虑叶片不定芽诱导
数量及转化率 2个因素 ,最后确定为对活化的菌液
(单菌落接种于 200 mLY EP培养基 )稀释 10倍后再
侵染 ,效果比较理想。
表 2　菌液稀释浓度对河北杨转化率的影响
Table 2　 Ef fects of ag robacterium concen t ration on
gen etic t rans formation f requency of P. hopeiensis
稀释
倍数
接种叶
片数
60 d后保
留的不定
芽数 /个
60 d后死
亡的不定
芽数 /个
转化率
/%
备注
0 30 0 0 0 叶片全部褪绿坏死
5 30 6 73 6. 67 叶片 1 /3褪绿坏死
10 30 10 54 15. 62 少数叶片叶尖褪绿
20 30 7 80 8. 05 少数叶片叶尖褪绿
30 30 4 91 4. 21 少数叶片叶尖褪绿
2. 3　侵染时间对转化率的影响
结果 (表 3)表明 ,河北杨叶片侵染 5 min时 ,转
化率最高。侵染 1 min时 ,虽然叶片诱导的不定芽最
多 ,但没有一株卡那霉素抗性芽产生。侵染 10 min
以上时 ,叶片受害严重 ,坏死叶片急剧增加 ,诱导的
不定芽数及卡那霉素抗性芽数都较 5 min时的低 ,
时间延长至 15 min时 ,没有一个不定芽产生。
表 3　侵染时间对河北杨转化率的影响
Table 3　 Ef fect s of infection time on g enetic t rans format ion
f requency of P . hop eiensis
侵染
时间
/min
接种叶
片数
60 d后保
留的不定
芽数 /个
60 d后死
亡的不定
芽数 /个
转化率
/%
备注
1 30 0 83 0. 00
5 30 6 75 7. 40 1 /5叶片褪绿坏死
10 30 3 51 5. 56 1 /2叶片褪绿坏死
15 30 0 0 0. 00 叶片全部褪绿坏死
2. 4　共培养时间对转化率的影响
结果 (表 4)表明 ,共培养 4 d内 ,随着共培养时间
的延长 ,转化率明显增加 , 4 d时的转化率最高 ,为
10. 98% 。4 d以后 ,由于农杆菌生长旺盛 , Cb很难抑
制其生长 ,导致叶片逐渐死亡 ,转化率明显下降。共
培养 7 d时 ,全部叶片在后续培养中被农杆菌杀死 ,
没有不定芽产生。 试验中共培养时间与不定芽诱导
率成反比 ,所以在确定共培养时间时 ,应该权衡叶片
不定芽诱导数量与卡那霉素抗性芽产生数量。 比如
共培养 6 d与 5 d结果相比 ,虽然 6 d的转化率高 ,但
由于 6 d产生的卡那霉素抗性芽只有 2个 ,而 5 d为 5
个 ,所以宁可选择共培养 5 d,不选择 6 d,因为 6 d较
高转化率是以大幅度降低叶片不定芽为代价
的。　　　　
表 4　共培养时间对河北杨转化率的影响
Table 4　 Ef fect s of co-cul tu re time on g enetic t rans fo rmat ion
f requency of P . hop eiensis
共培
养时
间 /d
接种叶
片数
60 d后保
留的不定
芽数 /个
60 d后死
亡的不定芽
数 /个
转化率
/%
备注
1 30 0 90 0. 00
叶片与培养基接触处
无可见菌落
2 30 0 88 0. 00
叶片与培养基接触处
无可见菌落
3 30 6 75 7. 40
1 /2叶片与培养基接
触处可见菌落
4 30 9 73 10. 98
全部叶片与培养基接
触处可见菌落
5 30 5 70 6. 67
叶片与培养基接触处
菌落明显
6 30 2 24 7. 69
叶背叶脉局部出现菌
落 ,后续培养中 1 /2多
叶片被农杆菌杀死
7 30 0 0 0. 00
叶背局部与全部叶脉
处出现菌落后续培养中全部叶片被农杆菌
杀死
2. 5　 AS对转化率的影响
结果 (表 5)表明 ,共培养基中添加 AS对河北杨
叶片转化率没有明显影响 ,而且随着 AS浓度的增
加 ,叶片褐化加重 ,产生不定芽的能力下降。
表 5　共培养基中添加 AS对河北杨转化率的影响
Table 5　 Ef fects of AS on genetic transformation
f requency of P . hop eiensis
AS浓度
/μmol· L- 1
接种叶
片数
60 d后保
留的不定
芽数 /个
60 d后死
亡的不定
芽数 /个
转化率
/%
备注
0 30 5 72 6. 49 叶片无褐化
50 30 4 69 5. 48 1 /4叶片褐化
100 30 5 62 7. 46 1 /2叶片褐化
200 30 3 55 5. 17 全部叶片褐化
3　结论与讨论
3. 1　杨树转基因均采用农杆菌介导的叶盘转化法 ,
在毛白杨、 84 K的研究中发现 [13 ] , LBA4404菌株
能很好地侵染白杨派树种 ,因此本研究只研究了影
响河北杨遗传转化的外部因素 ,对于 LBA4404是否
是河北杨遗传转化的最适菌株 ,需进一步研究。
3. 2　在用农杆菌侵染外植体之前 ,外植体是否要进
行预培养 ,文献中的结果很不一致 ,预培养是否需
要 ,要依据不同的植物种和培养系统而定 [1～ 12 ]。 一
般认为预培养可促进细胞分裂 ,分裂状态的细胞更
易整合外源 DNA,因而提高外源基因的短暂表达和
稳定整合率 [1, 7 ]。 植物细胞分裂处于 S期最适 T-
DNA转移 ,处于 M期最适 T-DNA整合 [1, 7]。转化所
用叶片属已分化的组织 ,细胞处于 G0期 ,为了促进
104 西北林学院学报 21卷　
T-DNA转移与整合 ,必须使伤口细胞在共培养时
已脱分化进入旺盛分裂状态。研究表明 ,适当时间的
预培养可以提高河北杨叶片转化率。
3. 3　遗传转化中 ,侵染细菌的浓度对转化率的影响
很大 ,如果菌液浓度过高 ,菌体本身易相互聚结 ,影
响其在外植体上的附着 ;同时会使外植体产生过敏
性反应 ,丧失分化不定芽的能力 ;再生阶段农杆菌也
不能有效抑制。浓度过低时 ,不利于基因的转入。在
以往的研究中 ,对侵染菌液的浓度是用 OD600值来确
定的 ,文献报道研究中使用的农杆菌菌液浓度为
OD600= 0. 6～ 1. 5[ 1～ 12]。用 OD600值确定农杆菌浓度
时 ,活化菌液稀释后必须测定其浓度 ,这样做麻烦且
不利无菌操作 ,本研究采用固定活化培养基体积、活
化菌液至一定状态——稀奶状、最后对此菌液稀释
不同倍数的方法来确定最适转化菌液浓度 ,既方便
又易于操作。 研究表明 ,对活化的菌液 (单菌落接种
于 200 mLYEP培养基 )稀释 10倍后再侵染 ,效果比
较理想。
3. 4　在遗传转化中 ,植物种类、外植体不同 ,采用的
菌液浓度和侵染时间差别很大。一般处理原则是 ,对
农杆菌比较敏感的植物和外植体 ,宜采用较低的菌
液浓度和较短的侵染时间 [1, 2, 7 ]。河北杨是农杆菌的
天然宿主 ,易产生过敏反应而导致外植体切口处白
化坏死 ,加之农杆菌在活化时里面加的卡那霉素对
叶片也具毒害作用 ,叶片创伤又比较严重 ,所以采用
较短的侵染时间。
3. 5　共培养就是将侵染后的叶片接种在芽诱导培
养基上暗培养 [1 ]。遗传转化中 ,农杆菌附着、 T-DNA
的转移与整合都是在共培养时间内完成的 [1 ] ,因此 ,
共培养时间对转化率影响很大。 关于共培养时间的
确定 ,前人的经验是以叶片与培养基接触处是否出
现肉眼可见的微菌落作为结束共培养的标志 ,而不
是以共培养时间长短来确定 [1, 3, 5, 7, 13 ]。 本研究中 ,共
培养 4 d时全部叶片与培养基接触处出现可见微菌
落 ,转化率最高。 共培养时间太短或太长 ,导致农杆
菌附着不足或过度生长 ,最终导致转化率下降。
3. 6　文献报道 ,农杆菌对一系列植物酚类化合物具
有趋化性 ,它可以使农杆菌质粒上的 vi r基因活化和
表达 ,从而提高转化率 [1～ 3, 7, 9, 12 ]。 本研究发现 ,共培
养基中添加 AS对河北杨叶片转化率没有明显影
响 ,而且随着 AS浓度的增加 ,叶片褐化加重 ,产生
不定芽的能力下降。 AS对个别植物转化没有效果
文献也有报道 [ 1, 7] ,分析其原因 ,可能是由于 AS是
一种酚类化合物 ,氧化后变成醌类物质对植物产生
伤害 ,再加上植物受伤后本身容易产生酚类物质 ,加
重伤害 ;此外 , AS对农杆菌的生长可能也有一定的
伤害作用。
3. 7　影响遗传转化的因素很多 ,各因素之间可能存
在交互作用 ,而且叶片、农杆菌状态会影响转化效
果。因此优化试验中试验设计的科学性、合理性以及
对叶片及农杆菌状态的控制十分重要。 本研究所用
叶片全部来自以根部萌蘖方式继代增殖 10代的试
管苗第 3～ 5个叶片 ,农杆菌为卡那霉素筛选、活化
的同一世代农杆菌 ,保证了试验材料的一致性和结
果的可比性。为了消除交互作用对试验结果的影响 ,
降低分析的难度 ,试验设计中采用了固定其他因素 ,
只变化一个因素水平来筛选该因素的方法 ,后续试
验证明这种方法是十分有效的。研究最终筛选的适
合河北杨遗传转化的方案是: 预培养 2 d, 200 m L农
杆菌活化菌液 1 /2 M S稀释 10倍 ,侵染 5 min,共培
养 4 d。后续试验中 ,按此方法河北杨叶盘转化频率
(卡那霉素抗性芽频率 )可达 35% 。
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