全 文 ：收稿日期:2011 － 12 － 02
基金项目:教育部科学技术研究重点项目(编号:209142) ;新疆维吾尔自治区重大科技专项项目科技支疆工程(编号:200840102)。
作者简介:赵琼珍(1987 －) ，女，硕士，主要从事植物逆境生理与分子生物学方面的研究。
通讯作者:李 群，女，副教授，硕士生导师;E-mail:liqun_007@ 126． com。
独行菜 CBF基因的克隆及其植物表达载体的构建
赵琼珍， 师秋菊， 李 群
(新疆大学生命科学与技术学院， 乌鲁木齐 830046)
摘要:本实验以新疆早春短命植物独行菜(Lepidiumapetalum Willd)为主要材料，利用聚合酶链式反应从独行菜中克隆了
CBF(C-repeatbinding factor)基因家族中的 CBF 3 基因和 CBF 4 基因，并将其成功构建到带有 35 S + Ω 的植物表达载体
pCAMBIA 2300 中，为进一步转化拟南芥以了解独行菜 CBF基因的结构和功能奠定了基础。
关键词: 独行菜;CBF;克隆;表达载体
中图分类号: Q 781 文献标志码: A 文章编号:1001 － 4705(2012)04-0004-03
Cloning and Plant Expression Vector Construction of
Transcription Factor CBF Gene in Lepidiumapetalum Willd
ZHAO Qiong-zhen，SHI Qiu-ju，LI Qun
(College of Life Science and Technology，Xingjiang University，Urmuqi 830046，China)
Abstract:The experiment had cloned CBF 3 and CBF 4 genes by PCR technique from the plants of Lepidiuma-
pet-alum Willd． Then connected the gene into the plant expression vector pCAMBIA 2300 which had 35 S +Ω．
Basic above all，the experiment had been successfully constructed the plant expression vector which was suit-
able for the Arabidopsis thaliana transformation． It was a foundation that for next step to learn about the struc-
ture and function of the cbf gene of Lep-idiumapetalum Willd．
Key words: Lepidiumapetalum Willd;CBF;clone;plant expression vector
新疆早春短命植物主要分布于新疆干旱和半干旱
地区，利用早春雨雪水进行萌发生长，在 4 ～ 6 月迅速
完成生活周期，并以种子形式渡过不良环境的特殊植
物类群［1］。目前对早春短命植物研究主要集中在植
物区系［2］、植物地理［3］、物候学［4］、生态生物学［4］、生
殖生态学［5］以及短命植物生长与环境的关系［6］等方
面，而对其适应低温的生理与分子机制的研究报道较
少，尤其对短命植物耐受早春低温分子机制的研究尚
未见报道。
低温是影响植物地理分布以及产量的一个重要的
环境胁迫因子。温带植物经过非冰冻低温胁迫后其抗
冻能力得到增加，这种现象称为“低温驯化”［7］。在低
温驯化的过程中导致植物发生多种生理、生化以及分
子水平上的变化。包括抗氧化机制的上调，低温防护
溶质和蛋白的合成和积累，细胞膜成分发生改变［7，8］。
这些生理、生化、分子水平的变化主要是由于植物在低
温胁迫的条件下基因表达发生了改变。因此低温对转
录组的激活以及对基因表达的抑制成了低温影响植物
的关键［9］。CBF 转录激活因子在其中起关键性的调
节作用。最近，基因组学和代谢组学的研究表明，CBF
冷响应途径在植物低温响应中占主导地位。
独行菜(Lepidiumapetalum Willd)属十字花科独行
菜属植物，分布广泛，我国南北各省均有分布，多生于
路旁、荒地、屋旁及田间。生活在新疆北部的独行菜属
于比较典型的早春短命植物类型［10］。孟君发现，独行
菜种子在 4 ℃的条件下不能萌发［10］。赵惠新认为，独
行菜种子不能耐受 4 ℃低温萌发，原因可能是在露白
前存在一个关键的生理阶段，在 4 ℃胁迫逆境中不能
越过这个阶段，该阶段之前与之后的萌发过程都能耐
受 4 ℃低温，因此对低温胁迫有良好的耐受性［12］。基
于短命植物独行菜对低温耐受以及具有模式植物的特
点，本实验利用 PCR技术从早春短命植物拟南芥中成
功同时克隆了 CBF基因家族的两个 CBF基因，并构建
到带有 35 S + Ω 的植物表达载体 pCAMBIA 2300 中，
为进一步转化拟南芥以了解独行菜 CBF 基因的结构
和功能奠定了基础。
·4·
第 31 卷 第 4 期 2012 年 4 月 种 子 (Seed) Vol． 31 No． 4 Apr． 2012
DOI:10.16590/j.cnki.1001-4705.2012.04.042
上排:拟南芥 CBF 3 cDNA;下排:独行菜 CBF 3 cDNA。
图 3 CBF 3 基因序列对比图(同源性 86． 18%)
1 材料和方法
1． 1 材 料
1． 1． 1 植物材料及菌种来源
独行菜种子，质粒 pCAMBIA 2300、大肠杆菌
DH 5 a及根癌农杆菌菌株 EHA 105 均由本实验室
保存。
1． 1． 2 供试试剂
Taq酶、dNTP购自天根公司;DNA 凝胶回收试剂
盒购自鼎国公司;各种限制性内切酶、pMD 18-T 载体
及 T 4 DNA连接试剂盒均购自 TaKaRa 公司;其他试
剂均为国产分析纯产品。引物由华大基因公司合成。
1． 2 方 法
1． 2． 1 独行菜基因组 DNA的提取
取独行菜幼嫩叶片 0． 5 g，采用改良的 CTAB
法［13］提取独行菜叶片总 DNA。
1． 2． 2 CBF基因的克隆
根据 NCBI GenBank 已报道的 CBF 基因的序列，
利用 DNAMAN生物软件设计 CBF的简并引物，CBF 5
端:ATGAMCTCAKTTTCWRCBTTYTC;CBF 3＇端 YTAR-
TAACTCCARAGSGAYAYG，引物由华大基因公司合
成。以独行菜总 DNA 为模板，用简并引物进行 PCR
扩增。反应程序为:95 ℃，5 min;94 ℃，30 s;58 ℃，
40 s;72 ℃，50 s;30 个循环;72 ℃，7 min;4 ℃保存。扩
增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后用 DNA 胶回收试剂
盒回收，然后与克隆载体 pMD 18-T连接。将连接产物
转入大肠杆菌 DH 5 a，并在含有 50 mg /L Amp 的 LB
固体培养基上筛选，对重组子进行 PCR 鉴定，将阳性
克隆子送往大基因公司测序，DNAMAN 软件分析序列
同源性。
1． 2． 3 植物表达载体的构建
用 Sac 1 和 Pst 1 双酶切 pCAMBIA 2300 和 pMD
18-T-CBF 3，pMD 18-T-CBF 4，回收目的片段后经 T 4
DNA 连接酶连接，得到重组质粒 pCAMBIA 2300::
CBF 3，pCAMBIA 2300::CBF 4，转化大肠杆菌 DH 5 a，
在含 50 mg /L Kan的 LB固体培养上筛选重组子，进一
步采用 PCR 检测和酶切鉴定确定阳性克隆子，采用
SDS碱裂解法中量提取重组质粒 pCAMBIA 2300::
CBF 3 和 pCAMBIA 2300::CBF 4，采用冻融法将其质
粒导入根癌农杆菌 EHA 105 中。
2 结果与分析
2． 1 CBF基因的克隆与鉴定
采用简并引物进行 PCR扩增的产物经 1%的琼脂
糖凝胶电泳后得到 650 bp 特异性强的 DNA 条带，与
预期结果相符(图 1)。将该片段连接到克隆载体 pMD
18-T后，用简并引物进行 PCR 鉴定(图 2) ，得到 650
bp左右的 DNA片段;实验结果与预期结果一致，证明
CBF基因目的片段已经成功克隆到 pMD 18-T载体上。
1 为阴性对照;2 ～ 5 为 PCR扩增产物;6 为 Marker。
图 1 CBF基因片段的 PCR扩增
1 ～ 9 为 9 个不同的克隆;10 为 Marker。
图 2 兼并引物 PCR鉴定阳性克隆
2． 2 CBF基因的序列分析
阳性克隆子经测序分析，其中一个克隆子长度为
662 bp，与拟南芥 CBF 4 基因同源性为 83． 48% (图
3) ，另一个克隆子长度为 648 bp，与拟南芥 CBF 3 基因
同源性为 84． 40% (图 4)。兼并引物能同时扩增出
CBF基因家族中的两条不同 CBF基因，这与 CBF基因
家族具有高度的同源性有关。
·5·
研究报告 赵琼珍 等:独行菜 CBF基因的克隆及其植物表达载体的构建
2． 3 植物表达载体 pCAMBIA 2300::CBF 3 /CBF 4 的构建
上排:拟南芥 CBF 4 cDNA;下排:独行菜 CBF 4 cDNA。
图 4 CBF 4 基因序列对比图(同源性 83． 48%)
用 PCR 和酶切检
测所构建的植物表达载
体 pCAMBIA 2300::
CBF 3 /CBF 4 构建的正
确 性。在 表 达 载 体
pCAMBIA 2300::CBF
3 /CBF 4 上有 Sac 1 和
Pst 1 两个酶切位点，用
Sac 1 和 Pst 1 进行双酶切应得到两个片段，一个为
CBF基因 650 bp，另外一个为 pCAMBIA 2300 8． 7 kb。
从图 5 酶切电泳检测的结果来看，与预测的结果一致，
证明所构建的 pCAMBIA 2300::CBF 3 /CBF 4 表达载
体正确，可用于今后的遗传转化。
M:Marker;1:质粒 pCAMBIA 2300;2:Sac1 和 Pst1 双酶切 pCAMBIA 2300
条带;3:Sac 1 和 Pst 1 双酶切 pCAMBIA2300-CBF3 条带;4:Sac 1 和 Pst 1
双酶切 pCAMBIA 2300-CBF 4 条带。
图 5 pCAMBIA 2300::CBF 3 /CBF 4 酶切鉴定
3 讨论与结论
CBF基因家族成员在植物抗旱、抗寒及抗盐碱方
面可能起着很大的作用，其中 CBF 1，CBF 2，CBF 3 基
因均受低温诱导表达，CBF 4 受干旱和 ABA 诱导表
达，而且目前对 CBF 家族成员的研究集中在 CBF 1，
CBF 2 和 CBF 3 基因，而对 CBF 4 基因的研究相对较
少。利用 35 S组成型启动子使 CBF 4 过量表达，能引
起 COR 15 a及 COR 78 a的组成型表达，而这两个基因
是与抗寒性和抗旱性有关，结果使 CBF 4 转基因拟南
芥的抗寒性和抗旱性都大大提高，本实验以新疆典型
的早春短命植物独行菜 DNA为模板，用筛选出的 CBF
兼并引物对其进行 PCR扩增，得到了 650 bp左右的片
段，通过 PCR和酶切鉴定后进行 DNA测序，结果得到
两条不同的 DNA序列，其中一条序列与拟南芥 CBF 3
的同源性最高达到 86． 18%，另一条序列与拟南芥
CBF 4 基因的同源性最高达到 83． 48%，因此初步确定
这两个序列分别是 CBF 3 基因和 CBF 4 基因，这是因
为 CBF家族具有很高的同源性，因此用兼并引物同时
扩增出 CBF家族中的两条基因，正是因为 CBF基因家
族本身具有高度的同源性，同时也需要做进一步的实
验来验证其功能。因此本实验构建了适于拟南芥农杆
菌遗传转化的表达载体，为进一步验证这 2 个基因的
功能奠定了基础，同时也为下一步利用 CBF 3 基因、
CBF 4 基因快速培育耐逆性强的新品种奠定了基础。
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第 31 卷 第 4 期 2012 年 4 月 种 子 (Seed) Vol． 31 No． 4 Apr． 2012