全 文 ：农业生物技术科学
ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.24No.82008August
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柿树（DiospyroskakiThunb）是柿属植物中作为果
树而被广泛利用的一个代表种。由于生长期长及遗传
杂合性，常规杂交育种比较困难，生产上一般通过嫁接
繁殖[1,2]。当前对柿砧的研究主要有嫁接亲和性调查、砧
木快速育苗、嫁接方法和机理、嫁接苗的生理生化特性
等[3~5]，通过组织培养繁殖砧木的研究不多[6,7]，利用转基
因技术改良砧木性状的研究尚未见报道，而开展遗传
转化的前提和基础之一便是建立一种有效的离体再生
体系。
油柿（DiospyrosoleiferaCheng），又名山柿，落叶
乔木，广泛分布于中国中南部和南方，与某些柿品种
嫁接亲和性好，可引起树形矮化、提早结果，是良好
的砧木种类[8]。笔者此前曾研究了其下胚轴的离体培
养并获得了再生植株[9]。与胚轴相比，叶片材料容易
获取、组培操作较简便，同时也是一种良好的遗传转
化受体材料。笔者试验了组织培养不同因素对离体
第一作者简介：谢启鑫，男，1981年出生，江西人，硕士，助理研究员，研究方向为植物遗传与转基因。通信地址：330200江西南昌市 江西省农科院蔬
菜花卉研究所。Tel：0791-7090349，E-mail：biocrat@126.com。
通讯作者：庄东红，博士，教授，主要从事植物分子遗传学研究。E-mail：dhzhuang@stu.edu.cn。
收稿日期：2008-05-28，修回日期：2008-06-11。
油柿叶片离体再生体系的建立
谢启鑫 1,3,庄东红 1,2
（1汕头大学生物系，汕头515063；2韩山师范学院生物系，潮州521041；
3江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，南昌330200）
摘 要:以油柿叶片为材料开展了离体培养研究,旨在建立其再生体系,为转基因操作奠定基础。结果表
明,油柿叶盘在MS(1/2N)+IBA0.1mg/L+ZT3.0mg/L培养基上,经前期暗处理3周后移至正常光照下培
养的再生效果最好,其不定芽再生率和外植体平均不定芽数最高,分别为80.5%和(4.1±0.8)个。再生苗
接种于添加 IAA和IBA各0.5mg/L的MS(1/2N)培养基上,4周时生根率可达 92%,成功地建立了油柿
叶片的离体再生体系。
关键词:油柿;叶片;再生体系
中图分类号:S665 文献标识码:A
DevelopingofPlantRegenerationSystemfromLeafExplants
ofDatePlum(DiospyrosoleiferaCheng)
XieQixin1,3,ZhuangDonghong1,2
(1DepartmentofBiology,ShantouUniversity,Shantou515063;
2DepartmentofBiology,HanshanTeachersColege,Chaozhou521041;
3InstituteofVegetablesandFlowers,JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang330200)
Abstract:InordertodevelopingaplantregenerationsystemofDiospyrosoleiferaChengtherebyestablisha
foundationfortransformation,shootregenerationandrootingfromleafexplantswerestudied.Theresult
showedthatmodifiedMurashigeandSkoog(MS)[MS(1/2N)]containing0.1mg/Lindolebutyricacidand3.0
mg/Lzeatinwasthemostoptimumforshootregenerationwhena3weekspreviousdarktreatmentwasadded.
Theshootpercentageandaverageshootsnumberperexplantwere80.5%and (4.1±0.8)respectively.Asfor
regeneratedshootsrooting,themodifiedMurashigeandSkoogcontaining0.5mg/Lbothindoleaceticacid
andindolebutyricacidwasmostefective,inwhichrootingpercentagereachedupto92%after4weeks.
TheplantregenerationsystemofDiospyrosoleiferaChenghasbeendevelopedsuccessfuly.
Keywords:DatePlum(DiospyrosoleiferaCheng),leaf,regenerationsystem
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叶片器官形成和植株再生的影响，初步建立了油柿
叶片的离体再生体系，为进一步开展遗传转化研究
奠定了基础。
1材料与方法
1.1试验时间与地点
试验于 2004年 6月—2007年 10月在汕头大学
生物系遗传实验室进行。
1.2材料
油柿带休眠芽的枝条采自汕头市澄海区栽培的成
年油柿树。
1.3试验方法
1.3.1油柿休眠芽初代培养 油柿带休眠芽的枝条先流
水冲洗1h，在超净工作台上切下休眠芽，75%乙醇表
面消毒30s，0.1%的升汞浸泡15min，中间不时摇动，无
菌水冲洗6次。剥去外被鳞片，取芽尖接种于不含激素
的1/2MS培养基上。培养基含0.8%琼脂、3%蔗糖和
500mg/LPVP（聚乙烯吡咯烷酮），pH调至 5.8后于
121℃高温灭菌15min。培养物置于（26±2）℃、光周期
为12h、光照度为60μmol/(m2·s1)的条件下培养（下同，
特殊处理除外）。
1.3.2叶片培养与不定芽诱导 继代6次以上的油柿组
培苗，在无菌条件下切取离顶端分生组织较近的第
3~4片展开叶，切取基部大小约为4mm×4mm的一段。
分别以MS、MS（1/2N）、1/2MS、1/2MS（1/2N）为基础培
养基，添加5.0mg/LZT和 0.01mg/LIBA，上表面朝下
接种于培养基上，试验基础培养基种类对不定芽诱导
的影响。以MS（1/2N）为基础培养基，附加不同浓度的
ZT（1.0、3.0、5.0、10.0mg/L）和IBA（0.01、0.1、1.0mg/L），
共12个处理，确定不同浓度的ZT与IBA组合对叶片
不定芽诱导的影响。为了试验暗处理时间对不定芽诱
导的影响，取叶片基部接种于添加 3.0mg/LZT和
0.1mg/LIBA的MS（1/2N）培养基上，随机分成 9组，
先期暗处理0~8W后转至正常光照下培养。上述各处
理均接种40个外植体，培养期间不更换培养基，8W
后统计不定芽再生率和外植体平均不定芽数，试验重
复2次。
1.3.3再生苗生根培养 切取再生芽顶端15~20mm长
的一段，接种于含 IAA和 IBA各 0.5mg/L的 MS
(1/2N)培养基上，前期暗培养9d后移至光周期为16h
的光照下培养，4周后统计生根率，试验重复2次。
1.3.4数据分析 所有数据均采用 SPSS软件进行方
差分析。不定芽再生率=再生叶片数/接种叶片数×
100%，叶片平均不定芽数=不定芽总数 /再生外植
体数。
2结果与分析
2.1叶片培养诱导不定芽
叶片培养1周后开始膨大增厚，叶脉显著变粗，
10d后边缘切口变褐，有的形成少量致密的愈伤组织，
20d后开始出现浅绿色芽点，此后分化率迅速上升，5
周时形成了较大的芽（图1）。
2.2基础培养基对不定芽再生的影响
不同基础培养基对油柿叶片不定芽再生的影响见
表1。从表1可见，4种基础培养基中，MS(1/2N)的培
养效果最好，1/2MS和 1/2MS(1/2N)次之，MS效果最
差。MS(1/2N)的不定芽再生率和外植体平均不定芽数
分别为57.8%和（2.9±0.8）个，均显著高于其它培养基。
2.3不同浓度的ZT和IBA组合对不定芽再生的影响
试验结果表明（表2），在不同浓度的ZT与IBA
组合中，ZT3.0mg/L+IBA0.1mg/L条件下的再生率最
高，达到71.6%，其次是ZT1.0mg/L+IBA0.1mg/L，为
63.7%，明显高于其它组合。较高的ZT浓度并不能显
著提高不定芽再生率，但能使外植体平均不定芽数显
著增加。
2.4前期暗处理时间对不定芽再生的影响
表3结果显示，一定时间的前期暗处理对油柿叶
片不定芽的再生有促进作用。随着暗培养时间的增加，
再生能力也提高，3周时达到80.5%，平均不定芽数达
图1油柿叶片培养5周时再生的不定芽
注：同列内相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在0.05水平上差异
不显著（下同）。
表1基础培养基种类对油柿叶片不定芽再生的影响
培养基
MS
MS(1/2N)
1/2MS
1/2MS(1/2N)
不定芽再生率/%
9.4d
57.8a
46.2b
33.5c
平均不定芽数
1.1±0.2c
2.9±0.8a
2.2±0.4b
2.4±0.7b
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到（4.1±0.8）个，显著高于对照。随着暗处理时间继续增
加，再生率又有所下降。
2.5再生芽生根
再生芽接种于含 IAA和 IBA各 0.5mg/L的 MS
(1/2N)培养基上，暗培养9d后移至光周期为16h的光
照下，再经过4周培养，生根率高达92%，每个植株的
根数为2~3条，根粗黑，植株生长健壮（图2）。
3讨论
柿属植物中柿的组织培养研究较多，其它种的研
究较少。Tao等[10]曾研究了16个柿品种再生不定芽的
能力，结果只有一半能形成不定芽，再生率最低为2%，
最高为72%。笔者此前在参考有关研究[11]的基础上开
展了君迁子的叶片培养，结果不定芽再生率和平均不
定芽数分别为85.3%和（2.8±0.6）个[12]。油柿为柿嫁接
常用砧木之一，本试验以其叶片为材料获得了80.5%
的不定芽再生率和（4.1±0.8）个平均不定芽数。
MS培养基是柿属植物组织培养常用的一种基础
培养基，大部分研究均表明1/2MS和MS(1/2N)培养基
最适合柿培养[13]。笔者的研究也得出相似的结论，君迁
子叶片在1/2MS培养基上再生效果较好[12]，而油柿叶
片在MS(1/2N)培养基上无论不定芽再生率还是平均
不定芽数都显著高于其它培养基。
植物生长调节剂对于不定芽的再生起着关键的作
用。研究[13]表明，ZT是促进柿属植物外植体生长和再
分化最有效的细胞分裂素，而生长素对于外植体的分
化起辅助作用，一般使用IAA或IBA。笔者此前的研
究[12]表明，适合君迁子叶片再生不定芽的最佳植物生
长调节剂组合为ZT5.0mg/L+IBA0.01mg/L，而本研究
试验了不同浓度的ZT和IBA组合对油柿叶片再生不
定芽的效果后发现，ZT3.0mg/L+IBA0.1mg/L条件下
不定芽再生率最高。两者对植物生长调节剂的要求存
在一定的差异，但都需要较高浓度的细胞分裂素和较
低浓度的生长素。
前人在诱导柿不定芽再生时通常都采用光周期为
12~16h的光照培养[10,14]，然而有资料[1]表明暗处理能促
进愈伤组织增殖和外植体的形态发生，对于某些植物
表2不同浓度的ZT与IBA组合对油柿叶片不定芽再生的影响
组合
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
ZT/(mg·L-1)
1.0
3.0
5.0
10.0
IBA/(mg·L-1)
0.01
0.1
1.0
0.01
0.1
1.0
0.01
0.1
1.0
0.01
0.1
1.0
再生率/%
38.3 e
63.7 b
19.1 gh
36.5 e
71.6 a
45.0 d
55.4 c
30.5 ef
22.7 fg
46.6 d
53.2 c
27.4 f
平均不定芽数
1.3±0.3 h
2.0±0.5 fg
1.8±0.6 g
1.3±0.6 h
3.6±0.8 c
2.4±0.6 ef
3.0±0.5 d
5.1±1.4 a
1.2±0.5 h
2.8±0.6 de
3.5±1.1 c
4.2±1.0 b
暗培养时间/周
0
1
2
3
4
5
6
再生率/%
70.4 bc
73.2 b
78.5 a
80.5 a
76.3 ab
71.8 bc
65.1 c
平均不定芽数
3.2±1.2 d
3.6±0.9 c
3.5±1.0 c
4.1±0.8 b
4.4±1.1 a
3.7±0.8 c
2.8±0.5 e
表3暗培养时间对油柿叶片不定芽再生的影响
图2再生苗生根
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叶片再生不定芽有十分重要的作用。Choi等[1]比较研
究了不同光暗培养时间后发现，光照不同程度地抑制
富有和西村早生的形态发生，一定时间的暗培养能提
高再生率。研究[12]表明，君迁子暗培养5周的再生率是
对照的1倍多，而本试验中，油柿叶片前期暗培养3周
的再生率最高，但只比对照提高了14.3%。虽然前期暗
培养对不定芽再生有促进作用，但程度不同。
已有人进行了农杆菌介导外源基因转化柿树
（DiospyroskakiThunb.）叶片的研究，并成功获得转入
了抗性基因的再生植株[15]。油柿是柿嫁接常用的砧木
之一，笔者当前建立起来的叶片离体再生体系，也为进
一步利用转基因技术改良其某些性状创造了条件。
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致谢:本研究的试验材料由广东省汕头市果树研究所
廖玉章研究员惠赠,谨表谢意。
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