全 文 ：香荚兰酶促生香及超临界 CO2萃取香气成分的研究
金　丽1　夏文水1　陈德新2
(1.江南大学食品学院　无锡　214036;2.海南香圣天然食品有限公司　海南　570125)
The Study on Enzymatic Curing of Green Vanilla Pods
and Extraction by Supercritical CO2
Jin Li
1　Xia Wenshui1　Chen Dexin2
(1.Southern Yangtze University , Wuxi　214036;
2.Hainan Fragrance Saint Natural Food Co., Ltd., Hainan　570125)
Abstract
This research includes enzyma tic curing of green vanilla pods and its ex traction by supercritical CO2.The constituent of the
ex tract w as identified by GC-MS.The results showed that vanillin content was increased by adding β-glucosidase , which can
improve the hydrolysis of glucoside compounds in green vanilla pods.The optimum condition of ex traction by supercritical CO 2
w ere 16.1MPa, 40.9℃, 2.2hrs.
Key words:Vanillin　Enzymatic curing　Supercritical　extraction
摘要
对香荚兰的酶促生香及超临界 CO 2萃取香气成分进行了研究 , 并用 GC-MS 技术对萃取物的成分进行了分析。酶
促生香研究结果表明 ,采用外加 β-葡萄糖苷酶可以促进香荚兰青荚中糖苷化合物分解完全 , 提高豆荚中香兰素的含量 ,
克服传统生香工艺存在的缺陷。通过研究影响超临界 CO2萃取的主要因素 ,确定了萃取的最佳操作参数。萃取物的组成
成分大部分为主要的香气物质 ,萃取物的香气浓郁 ,特征香味突出。
关键词:香荚兰　香兰素　酶促生香　超临界萃取
　　0　前言
香荚兰 , 又名香子兰 、香草兰 、香果兰 、华尼
拉 ,系兰科香荚兰属多年生大型肉质攀援草本植
物 ,广泛分布于热带和亚热带地区[ 1] 。它是 2800
多种兰科植物中最有实用价值的一种优质食用香
料植物 ,其产品具有一种沁人心脾的独特香气 ,被
广泛用于各种食品的增香 ,素有“食品香料之王”
的美誉[ 2] 。
成熟后的香荚兰并不具有特征香味 ,其浓郁
的香气是生香加工之后产生的 。生香加工过程
中 ,香气成分的形成机理较为复杂 ,至今还未完全
被人们所了解 ,但酶促反应和非酶转化对其香气
形成所起的作用已得到证实[ 3] 。这为香荚兰的酶
促生香提供了一定的理论基础。目前国内香荚兰
的生香加工仍保持着杀青 、发酵 、快干 、熟化的传
统工艺 ,生香周期长达一年 ,并且耗费大量的人力
物力 。为改变国内香荚兰的生香加工现状 ,本文
根据前人的研究结果采用 β—葡萄糖苷酶对香荚
兰的酶促生香进行初步研究 ,并探讨酶促生香在
实际生产中的可行性 。
在香荚兰产品制备方面 ,人们通常采用有机
溶剂提取法 ,选用的溶剂一般是不同浓度的乙醇 。
有机溶剂提取法虽然提取率高 ,但常会把一些高
分子 、非挥发性成分(如:脂肪 、树脂 、蜡及色素)一
并提取出来 ,有时产品中还存在有机溶剂残留毒
性 ,影响产品质量[ 4] 。超临界 CO2流体具有临界
温度低 、化学性质稳定 、无毒 、无污染及无溶剂残
留问题等特点 ,特别适合用于热敏性香料香气成
　收稿日期:2001-01-12
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第一期
二★★二年二月
香料香精化妆品
FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS
No.1
February , 2002
分的提取 ,所得产品的特征香气更完全 、品质更
好。因此 ,本文采用超临界 CO2萃取技术制备天
然香荚兰萃取物 ,以期提高产品质量和增加附加
值 ,增加产品的市场竞争力。本文旨在通过研究 ,
改进香荚兰传统生香工艺 ,促进香荚兰加工向深
度方向发展 ,以推动香荚兰加工业的发展。
1　材料与方法
1.1　材料
香荚兰:产地海南 ,青荚收获于 2000 年 1 月
份 ,海南南亚天然香料应用研究所提供 。
超临界萃取装置:型号HA221-50-02 ,体积
2L
β—葡萄糖苷酶:酶活力 5.5u/mg ,上海Sigma
试剂公司
1.2　方法
1.2.1　香荚兰的酶促生香研究
1.2.1.1　新鲜香荚兰豆的酶促生香处理
取 100g 香荚兰青荚杀青后切碎 ,加入 100ml
缓冲溶液(PH=5.0),匀浆 ,然后在匀浆豆荚中加
入500个单位的 β -葡萄糖苷酶 ,置于 37℃恒温
水浴中反应 24小时。同样条件下制备一个不加
酶的空白对照样 。之后进行熟化。
1.2.1.2　生香样品的HPLC 分析
用 HPLC 分析传统生香 、酶促生香及空白样
品中主要香气成分的含量 。
样品的预处理:分别取三种样品各 3.00g ,用
95%的乙醇索式抽提 16 小时 , 抽提物定容至
100ml ,待测(参照 ISO5565-1982附录 B)。
外标溶液:准确称取香兰素 1.2000g 、对羟基
苯甲醛 0.0600g 、对羟基苯甲酸 0.0200g ,用 95%
的乙醇溶解后 ,定容至 100m l。
色谱条件:HP -1050 HPLC 及 UV 检测器;
柱子:BDS-C18;柱温:室温;流速:1ml/min;流动
相:20%甲醇 +0.5%冰醋酸 +水;检测波长:
266nm 、296nm 、240nm 梯度波长 。
1.2.2　香荚兰超临界 CO2萃取香气成分的
研究
1.2.2.1　香兰素含量的测定
取5.00g 香荚兰豆 ,用 95%的乙醇索式抽提
16小时 ,提取物定容至 100ml ,然后进行紫外分光
光度测定 。
1.2.2.2　超临界 CO2萃取影响因素的研究
取 50.0g香荚兰豆 ,在不同的萃取条件(预处
理 、压力 、温度 、时间)下进行超临界 CO2萃取 ,计
算香兰素提取率和萃取前后原料失重率 。
1.2.2.3　超临界 CO2萃取物的成分分析
取 1.00g 超临界 CO2萃取物 ,溶于 10m l 1∶1
(V/V)乙醚/戊烷混合溶剂 , 用 GC -MS 分析 。
色谱条件:Trace 气质联用仪;柱子:OV -1701
(30m×0.25mm);汽化室温度:250℃;程序升温:
起始温度40℃(保持 5min),最终温度 240℃,升温
速率 6℃/min。
2　结果与讨论
2.1　香荚兰酶促生香的研究
图 1和图 2分别为酶促生香样品和空白对照
样品的高效液相色谱图 。分析对照两图可知 ,在
外加 β -葡萄糖苷酶的作用下 ,图 1中香兰素色谱
峰显著变大 ,其它两组分色谱峰也有不同程度的
提高 ,而且 ,在保留时间为 6.9处的香兰素葡萄糖
苷峰基本消失。显然 ,β-葡萄糖苷酶对香荚兰青
荚中糖苷化合物的分解和香兰素及其它香气成分
的形成起了重要的作用。
图 1　酶促生香样品 HPLC图
图 2　空白样品 HPLC图
表 1　经不同生香处理后香荚兰豆中
主要香味成分含量的比较
样　　品 空白样品 酶生香样品 传统生香样品
熟化期(月) 2 2 3
水分含量(%) 16.3 16.3 17.2
对-羟基苯甲酸(%) 0.0573 0.0850 0.0397
对-羟基苯甲醛(%) 0.1231 0.4066 0.1314
香兰素(%) 1.4444 2.8303 2.1914
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第一期 香荚兰酶促生香及超临界 CO2萃取香气成分的研究 总第七十一期
　　在传统生香加工过程中 ,香兰素及其它香气
成分的形成主要依赖于豆荚本身所含有的葡萄糖
苷酶对糖苷化合物的分解作用 ,但这一分解作用
一般都进行得缓慢而又不够完全 。实验结果证明
外加 β -葡萄糖苷酶可以更快更完全地分解香兰
素葡萄糖苷。表 1所示即为三种经不同生香处理
的样品中主要香气成分含量的比较。由表可知 ,
酶促生香样品香兰素含量明显高于传统生香样
品。同时其表面附有白色透亮的香兰素针状结
晶 ,外观品质很好 。可见 ,酶处理增效结果十分明
显。
目前 ,在国际贸易中商品香荚兰中香兰素的
含量仍然是一个主要的质量指标 ,香兰素含量越
高 ,说明豆荚质量越好。从本文的研究结果分析 ,
采用酶促生香技术不仅可以促进香荚兰青荚中糖
苷化合物分解完全 ,提高豆荚中香兰素的含量 ,而
且还能缩短生香周期 ,提高香荚兰成品的质量。
当然 ,如果能找到廉价易得的酶源 ,降低其生产成
本 ,那么该技术在香荚兰成品的生产中将会有极
大的应用价值。
2.2　香荚兰豆的超临界 CO2萃取研究
2.2.1　原料预处理程度对超临界萃取的影
响
对四种不同粉碎程度的原料的超临界萃取实
验结果如图 3所示。
1.剪段后直接萃取　2.剪段后粉碎再萃取
3.粉碎后过 20目筛再萃取　4.粉碎后过 40目筛再萃取
图 3　不同预处理对萃取的影响
由图可以看出 ,原料剪成小段后 ,先粉碎再萃
取 ,可以明显地提高最终香兰素的提取率。这是
因为种子是香兰素的主要存在部位 ,种子的外壳
增大了 CO2的扩散渗透阻力 ,使得 CO2难以穿透
细胞组织 ,无法与种子内部的香兰素接触。粉碎
有利于破坏种子外壳 ,增大 CO2与原料的接触面
积 ,从而大大提高香兰素提取率。对于两个粉碎
后过筛(20目和 40 目)的样品 ,前者的香兰素萃
取率虽有微小的提高 ,但因难以粉碎完全 ,与筛上
物中香兰素的损失相比意义不大 ,而后者的香兰
素提取率反而有明显的降低 ,这可能是因为原料
过细 ,增加了料层的堆积密度并出现了堵塞筛孔
现象 ,使得香兰素难以穿过料层进入 CO2溶剂主
体 。因此 ,萃取过程中原料以粉碎不过筛为宜 。
2.2.2　萃取操作参数对超临界萃取的影响
(1)萃取压力对超临界萃取的影响
图 4　压力对超临界萃取的影响
萃取压力是改变超临界 CO2对物质溶解能力
的主要参数之一 。通过改变压力可以使 CO2的密
度发生变化 ,从而增大或减少它对溶质的溶解能
力 。在一定的压力范围内 ,萃取压力与溶质萃取
率呈线性关系 ,当超出此范围时 ,溶解已达饱和 ,
萃取率不再随着萃取压力的升高而增大 。由图 4
可知 ,在 8 ～ 25MPa 之间 ,总萃取量随着萃取压力
的升高而不断增加 ,而香兰素提取率则先上升后
下降 ,这说明超临界 CO2对香兰素的萃取存在一
个最佳的萃取压力 ,而并非越高越好 。
(2)萃取温度对超临界萃取的影响
图 5　温度对超临界萃取的影响
萃取温度是改变超临界 CO2溶解能力的另一
主要参数。在一定的压力条件下 ,萃取温度的变
化对萃取过程溶解度的影响比较复杂 ,它包含了
矛盾的两个方面。一方面 ,升高温度对提高被萃
取物的挥发度有利 ,即增大被萃取物在超临界二
氧化碳中的溶解度;另一方面 ,温度升高 ,将导致
—23—
香料香精化妆品 二★★二年二月
超临界 CO2的密度降低 ,使它对萃取物的溶解能
力下降 。溶质萃取率的高低就取决于此温度下 ,
何种状态占优势 。由图 5 可以看出 ,当温度低于
40℃时 ,随着萃取温度的升高 ,香兰素萃取率明显
增大;当温度高于 40℃时 ,香兰素萃取率开始下
降。这正是温度影响的两个矛盾方面综合作用的
结果 。
(3)萃取时间对超临界萃取的影响
图 6　时间对超临界萃取的影响
一般来说 ,随着萃取时间的延长 ,溶质萃取率
也逐渐增大 ,当达到某一时刻以后 ,萃取基本达到
平衡 ,萃取率的提高不明显。若继续延长萃取时
间 ,从经济的角度考虑不合理。所以 ,由图 6 可
知 ,萃取时间以 2 ～ 3hr为宜。
2.2.3　响应面分析优化萃取工艺
试验方案和试验结果如表 2 。
表 2　响应面分析试验方案和试验结果
试验号 X 1(MPa) X2(℃) X3(h r) Y(%)
1 0(15) -1(30) -1(1) 73.04
2 0(15) -1(30) 1(3) 75.90
3 0(15) 1(50) -1(1) 71.60
4 0(15) 1(50) 1(3) 76.72
5 -1(10) 0(40) -1(1) 76.72
6 -1(10) 0(40) 1(3) 78.76
7 1(20) 0(40) -1(1) 75.90
8 1(20) 0(40) 1(3) 79.99
9 -1(10) -1(30) 0(2) 77.94
10 -1(10) 1(50) 0(2) 79.03
11 1(20) -1(30) 0(2) 77.13
12 1(20) 1(50) 0(2) 80.81
13 0(15) 0(40) 0(2) 83.67
14 0(15) 0(40) 0(2) 84.08
15 0(15) 0(40) 0(2) 83.46
用 RSA分析软件回归拟合得回归方程:
Y=83.770-0.1725X1 +0.5187X2+1.7638
X3-0.7575X21-4.2850X22-5.170X23-0.6475X1
X2+0.5125X1X3+0.5650X2X3
作回归显著性检验和方差分析如下:
表 3　Y的方差分析
方差来源 平方和 自由度 平均平方和 F 显著性
一次项 27.2775 3 9.0925 94.6137 ＊
二次项 154.8438 3 51.6146 537.0873 ＊＊
交互项 4.0047 3 1.3349 13.8901
失拟项 4.0986 3 1.3662 14.2161
误　差 0.8581 2 0.0961
总　和 190.4163 14
F 0.05(3 , 2)=19.16
F 0.01(3 , 2)=99.17
R=0.9775 ,对α=0.05 , N1 =9 , N2=5 ,查 F
分布表计算得 Rα=0.946
因为 R>Rα, Y 回归效果显著 ,方差分析表
明 ,Y的一次项 、二次项的影响都显著。因此 ,各
因素和指标之间的关系不是简单的线性关系 ,而
是二次关系。由回归方程得出最优工艺条件为:
压力 16.1MPa、温度 40.9℃、时间 2.2hr。
2.2.4　超临界 CO2萃取物的成分分析
超临界 CO2萃取物的 GC-MS分析实验结果
如表 4 所示。由表可知 ,香兰素是萃取物中最主
要的香气成分 ,其相对含量最高 。评香表明 ,超临
界 CO2萃取物的特征香气突出 ,香气浓郁。
表 4　超临界 CO2萃取物的组成成分
保留时间(分) 化　合　物　名　称 峰面积(%)
碳氢化合物
3.14 庚烷 0.15
5.63 辛烷 0.79
9.05 壬烷 0.08
12.25 癸烷 0.05
15.11 十一烷 0.08
17.71 十二烷 0.22
20.11 十三烷 0.35
22.35 十四烷 0.44
24.38 十五烷 0.42
26.04 十六烷 0.34
27.47 十七烷 0.44
28.73 十八烷 0.29
29.86 十九烷 0.39
30.93 二十烷 0.23
31.91 二十一烷 0.20
6.09 甲苯 1.44
9.32 乙苯 0.02
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第一期 香荚兰酶促生香及超临界 CO2萃取香气成分的研究 总第七十一期
保留时间(分) 化　合　物　名　称 峰面积(%)
醇类
3.73 2-庚醇 0.46
5.07 4-甲基-2-庚醇 1.08
11.15 2 , 3-丁二醇 0.23
19.51 苯乙醇 0.20
21.06 香叶醇 0.04
24.04 茴香醇 0.09
27.34 对羟基苯甲醇 0.20
27.70 香草醇 0.14
31.21 异植醇 2.19
酚类
18.03 苯酚 0.13
18.41 愈创木酚 0.12
醛酮类
6.44 4-甲基-2戊酮 0.21
6.54 己醛 0.24
14.15 2-庚酮 0.09
24.82 5-羟甲基-2-糠醛 0.40
27.92 加大麻素 0.11
28.28 对羟基苯甲醛 4.93
26.88 香兰素 61.87
30.45 丁香醛 0.21
保留时间(分) 化　合　物　名　称 峰面积(%)
酯类
2.87 乙酸乙酯 2.64
31.51 邻苯二甲酸异丁酯 0.24
31.59 棕榈酸乙酯 0.32
33.54 亚油酸乙酯 0.56
34.74 亚油酸甲酯 0.16
酸类
4.97 乙酸 0.68
12.74 异戊酸 0.05
16.56 正己酸 0.14
21.16 辛酸 0.20
29.76 香兰酸 0.46
32.27 十六烷酸 0.57
34.51 亚油酸 0.086
参考文献
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4　姚渭溪 ,香料香精化妆品 , 1995 ,(1):28～ 34
(上接第 14页)
分析结果表明 , 90%乙醇萃取香草兰豆荚得
到的萃取物中 ,除作为萃取剂的乙醇外 ,已鉴定的
挥发性香气物质组成包括:醛类 5 种 ,相对含量
43.75%;酯类 4种 ,相对含量 1.19%;醚类 2 种 ,
相对含量 1.62%;烷烃类 4种 ,相对含量 1.75%;
烯烃类 2种 ,相对含量 7.63%;脂肪酸 2种 ,相对
含量 3.04%;未能确认结构的化合物相对含量为
9.62%。在萃取物挥发性成分中 ,香兰素的相对
含量最高 ,为 29.95%。香兰素是香草兰萃取物的
主香成分 ,它是评价香草兰豆荚及产品加工质量的
主要指标之一。实验结果表明 ,用 90%乙醇作溶剂
从香草兰豆荚萃取香兰素可获得较好效果。
3　结束语
香草兰的香气 ,是一种综合香气 ,由香兰素和
多种化合物一起互相作用形成 ,这些化合物包括
各种挥发性成分和一些不挥发性成分 ,这些微量 、
痕量成分 ,对香草兰萃取物的独特香气香味起着
重要作用 ,决定了香草兰香料不可替代的感官特
性以及人工未能准确地复制其香型情况 。形成香
气的化合物在组成和含量上的差别 ,造成了不同
品种香草兰之间或不同产地香草兰之间芳香特性
的差异 ,也造成了不同萃取工艺或不同萃取方法
的香草兰萃取物之间芳香特性的差异和品质的差
异 。本文对香草兰萃取物挥发性香气成分进行分
析 ,希望能为探索和研究香草兰萃取物化学组成
与香气特性及营养价值之间的关系提供有用的信
息和依据。
参考文献
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