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蒌叶抗氧化活性成分的提取
及活性测定体系的优化
纪明慧，郭飞燕* ，王呈文，白小月，高 倩，徐志江，凌昭星
(海南师范大学“省部共建－热带药用植物化学”教育部重点实验室，海南海口 571158)
摘 要:目的:研究蒌叶乙醇提取物的抗氧化活性。方法:采用微波辅助乙醇提取法提取蒌叶抗氧化活性成分，以鲁米诺
化学发光体系测定蒌叶乙醇提取物清除羟自由基的效果，并对测定体系进行优化。结果:当料液比为 13∶25(mg /mL)，乙
醇浓度为 50%，提取温度为 55℃，提取时间为 25min，微波提取功率为 600W时，蒌叶乙醇提取物对羟基自由基的清除
效果最佳，清除率可达 98.2%，清除率测定体系中，当 pH10.18，Luminol 浓度为 0.8 × 10 －4mol /L，H2O2 浓度为 0.3%时，
体系测量精密高、稳定性和重复性好。结论:蒌叶乙醇提取物对·OH有很好的清除作用。
关键词:蒌叶，抗氧化，鲁米诺，流动注射化学发光法
Extraction of antioxidant active components from piper betle
and optimization of activity determination system
JI Ming－hui，GUO Fei－yan* ，WANG Cheng－wen，BAI Xiao－yue，GAO Qian，XU Zhi－jiang，LING Zhao－xing
(Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，
Hainan Normal University，Haikou 571158，China)
Abstract:Objective:To study the antioxidant activity of ethanol extracts from Piper betle L.Method:The ultrasonic－
assisted ethanol extraction method was adopted to extract the antioxidant active components from Piper betle L，
chemiluminescence analysis in H2O2 － Luminol system was used to determine efficiency of scavenging hydroxyl
free radical and optimize the measurement system.Result:Under the conditions that solid－ to－ liquid ration was 13∶
25(mg /mL) ，ethanol concentration was 50%，extraction time was 25min and temperature was 55℃，microwave
power 600W，the effect of removing hydroxyl radical was best and the dearance rate was 98.2% . H2O2
concentration 0.30% and Luminol concentration 0.8 × 10 －4mol /L and pH10.18 was suitable condition.Conclusion:
The ethanol extract of Piper betle L had very good scavenging effect of hydroxyl radical.
Key words:Piper betle L;antioxidation;Luminol;flow－ injection chemiluminescence
中图分类号:TS201.2 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2012)21－0246－04
收稿日期:2012－05－17 * 通讯联系人
作者简介:纪明慧(1968－) ，女，副研究员，研究方向:有机化学。
基金项目:海南省教育厅科研基金项目(Hj2010－19)。
蒌叶(Piper betle L.)为胡椒科胡椒属植物，又名
蒟酱、青蒟、槟榔蒟、槟榔蒌等［1］，是普遍生长在亚洲
的一种植物，在我国主要分布于云南、广西、海南、台
湾等地。蒌叶是我国南方常见的药用植物，在《本草
纲目》、《中药大辞典》和《本草纲目拾遗》中均有记
载，蒌叶根、子、叶皆可入药，具有祛风散寒、行气化
痰、消肿止痒之功效。民间用于治疗风寒咳嗽、支气
管哮喘、风湿骨痛、胃寒痛、妊娠水肿、牙痛等，外用
治皮肤湿疹、脚癣［1－2］。在海南的南部，咀嚼蒌叶和
槟榔是一种习俗，具有抑菌护齿的作用。有关蒌叶
挥发油成分、化学成分和营养成分已有一些文献报
导［1－4］，但有关蒌叶在抗氧化活性方面的研究报导并
不多见，梁辉等人［5］以 DPPH法及联苯三酚红褪色法
对云南保山产的蒌叶进行抗氧化研究。为此，笔者
采用微波辅助乙醇提取法对海南产蒌叶进行提取，
考察最佳的提取工艺条件，并用 H2O2 －鲁米诺化学
发光体系测定蒌叶乙醇提取物对·OH 的抑制作用，
以期为更好地开发和利用海南蒌叶提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
蒌叶 海南万宁，经海南师范大学生命科学学
院钟琼芯老师鉴定为胡椒科胡椒属植物;鲁米诺
(Luminol) 分析纯，苏州工业园区亚科化学试剂有
限公司;氢氧化钠、30% H2O2、无水乙醇 分析纯，广
州化学试剂厂;硫酸铜 分析纯，北京化工厂;维生
素 C 分析纯，天津市四通化工厂;0.1mol /L 的
Na2CO3－NaHCO3 缓冲溶液。
MAS－I型微波萃取仪 上海新仪微波化学科技
有限公司;pHS－3C型 pH 计 上海康仪仪器有限公
司;BS124S型电子天平 赛多利斯科学仪器有有限
公司;IFFM－E型流动注射化学发光仪 西安瑞迈电
子科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 流动注射化学发光体系的建立 如图 1 所示，
在实验过程中，鲁米诺溶液和待测液由主蠕泵泵入
管路，H2O2、硫酸铜、维生素 C 溶液则由副蠕泵泵入
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.21.046
247
表 1 流动注射化学发光仪运行参数程序
Table 1 Operating parameters of flow injection chemiluminescence instrument
步号 泵运行时间(s) 主泵速度(r /min) 副泵速度(r /min) 重复次数 阀位 数据读取 主泵方向 副泵方向 跳转
1
2
3
4
5
10
10
10
20
26
30
25
30
20
30
0
25
30
20
30
1
1
1
1
1
L
L
R
L
L
N
Y
Y
Y
Y
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
1
1
1
1
1
注:蠕动泵用橡皮乳胶管内径为 1mm。
管路，按运行程序(表 1)进行流动注射化学发光分
析，各溶液分别在混合器中混合并发生反应产生蓝
光，测定 10s内发光强度，由光检测器记录发光信号。
在副蠕泵中部分 Cu2 +被维生素 C 还原成 Cu +，然后
迅速与 H2O2 反应产生羟基自由基
［6］。当主蠕泵中
进的是鲁米诺溶液和空白溶液时，发光强度为空白
值 I0，当进的是待测液时，发光强度记为 I，根据发光
信号强度的降低值(I0 － I) ，可以定量分析待测液中
的成分清除羟基自由基的能力。其计算公式为［7－8］:
羟基自由基抑制率(%)=［(I0 －I)/ I0］× 100
图 1 流动注射化学发光分析法的原理示意图
Fig.1 Schematic diagram of
flow－injection chemiluminescence analysis
注:a:鲁米诺溶液;b:蒌叶乙醇提取物溶液;c:H2O2
溶液;d:硫酸铜和维生素 C 溶液;P1:主蠕动泵;P2:
副蠕动泵;V:八通阀;F:流通池;W:废液池;D:发光
检测器;PC:计算机。
1.2.2 蒌叶抗氧化活性成分提取 蒌叶烘干，粉碎
过 80 目筛，准确称取一定量的蒌叶粉末于 50mL 烧
杯中，加入 25mL 乙醇溶液，在不同温度、时间、微波
功率下提取，然后抽滤，滤渣再用相同浓度乙醇溶液
洗涤三次，合并滤液定容至 50mL，待测［9－10］。
1.2.3 蒌叶抗氧化活性测定 以 1.2.1 流动注射化学
发光体系测定蒌叶抗氧化活性。鲁米诺溶液、H2O2 溶
液和 1.0 ×10 －5mol /L硫酸铜以及 1.0 × 10 －5mol /L维生
素 C溶液都根据需要以 0.1mol /L的 Na2CO3－ NaHCO3
缓冲溶液配制以达到所需的 pH。硫酸铜溶液和维生
素 C溶液加入量比为 7∶4 (mL/mL) ，按运行程序(表
1)进行流动注射化学发光分析，进而分析 pH、H2O2 浓
度和鲁米诺浓度对测量体系的影响。
2 结果与分析
2.1 提取工艺的优化
2.1.1 料液比对·OH 的清除效果影响 在其它条
件不变的情况下，料液比对提取效果的影响见图 2。
提取条件:80% 乙醇、提取温度 50℃、提取时间
25min、微波功率 600W。由图 2 可以看出，当料液比
为 10∶25～13∶25 时，提取物对羟基自由基的清除率随
料液比的增加逐渐增加，增加料液比，提取物对羟基
自由基的清除率出现下降的趋势，说明当料液比增
大，提取液中有效的活性成分含量增加，同时其他成
分含量也会增加，其中某些成分对清除羟基自由基
的活动产生拮抗，从而导致清除效果变差。因此，本
实验选择提取液的最佳料液比为 13∶25(mg /mL)。
图 2 不同料液比提取物对·OH清除效果
Fig.2 The scavenging effect of extracts
with different solid to liquid ratio on ·OH
2.1.2 乙醇浓度对·OH 的清除效果影响 在其它
条件不变的情况下，考察不同乙醇浓度对提取效果
的影响，结果见图 3。提取条件:料液比13∶25、提取
温度 50℃、提取时间 25min，微波功率 600W。由图 3
可以看出，当乙醇浓度为 30% ～50%，提取液对·OH
的清除率随乙醇浓度的增加逐渐增加，当乙醇浓度
为 50%时，清除率最高。当乙醇浓度为 50% ～ 90%
时，提取物对·OH的清除率随乙醇浓度的增加逐渐
下降，说明提取液中对·OH产生抑制作用的活性组
分具有较大的极性。
图 3 不同乙醇浓度提取物对·OH清除效果
Fig.3 The scavenging effect of extracts
with different volume fraction of ethanol on ·OH
2.1.3 温度对·OH 的清除效果影响 在其它条件
不变的情况下，考察温度对提取效果的影响，结果见
图 4。提取条件:50%乙醇、料液比 13 ∶25、提取时间
25min，微波功率 600W。由图 4 可知，35℃时提取物
对·OH的清除率很低，随着提取温度的升高，提取
物对·OH 的清除率增加，55℃时清除率最高可达
98.2%;温度低于 55℃，蒌叶中有效的抗氧化活性成
分溶解度小，提取效果受到影响，因此活性不高;温
度高于 55℃时，随着温度的提高，有效成分溶解达到
248
饱和，提取物对羟基自由基的清除率变化不大。
图 4 不同温度提取物对·OH清除效果
Fig.4 The scavenging effect
of extracts with different temperature on ·OH
2.1.4 时间对·OH 的清除效果影响 在其它条件
不变的情况下，考察时间对提取效果的影响，结果见
图 5。提取条件:50%乙醇、料液比 13 ∶25、提取温度
55℃、微波功率 600W。由图 5 可知，随着提取时间
的延长，提取物对羟基自由基的清除率逐渐增加，
25min时清除率最高;时间小于 25min，蒌叶中有效的
抗氧化活性成分提取不够充分，因此提取物活性受
到影响;提取到 25min 时，提取基本完成，再延长提
取时间，提取物对羟基自由基的清除率没有明显的
变化，而体系溶液颜色变深，影响了测量效果。
图 5 不同时间提取物对·OH清除效果
Fig.5 The scavenging effect
of extracts with different time on ·OH
2.1.5 微波功率对·OH 的清除效果影响 在其它
条件不变的情况下，考察微波功率对提取效果的影
响，结果见图 6。提取条件:50%乙醇、料液比 13∶25、
提取温度 55℃、提取时间 25min。由图 6 可知，当微
波提取功率为 300～600W时，提取物对·OH 的清除
率随着微波功率的提高逐渐增加，最高可达 98.2%，
当微波提取功率为 600～800W 时，提取物的清除率
随着微波功率的提高呈现出下降趋势，表明增大微
波提取功率会导致蒌叶提取液中有效成分氧化分
解，影响了清除效果。
2.2 抗氧化活性测定体系的优化
2.2.1 pH的选择 在其它条件不变的情况下，考察体
系溶液的 pH对测量效果的影响见图 7。测定体系中
H2O2 浓度为 0.3%、鲁米诺浓度为 0.8 × 10
－4 mol /L、
CuSO4 和维生素 C浓度均为 1 ×10
－5mol /L，CuSO4 和维
生素 C比例为 7∶4(mL /mL)。由图 7 可知当体系溶
液的 pH为 8.64～12.17 时，随着 pH 增加，体系发光强
度变化不明显，羟基自由基清除率变化不大。但是过
高的 pH会使体系的发光处于不稳定状态，从而影响
实验的稳定性和重复性，三次平行实验，结果表明，当
pH为 10.18时提取物对羟基自由基清除率最好。
图 6 不同微波功率提取物对·OH清除效果
Fig.6 The scavenging effect of extracts
with different microwave power on ·OH
图 7 pH对测定结果的影响
Fig.7 The effect of pH on the measured results
2.2.2 H2O2 浓度的选择 在其它条件不变的情况
下，考察体系中 H2O2 浓度的变化对发光强度的影
响，结果见图 8。测定体系中鲁米诺溶液浓度为
0.8 × 10 －4mol /L，pH为 10.18，1 × 10 －5mol /L CuSO4 和
维生素 C 加入比例 7 ∶4。由图 8 可以看出，当 H2O2
的浓度为 0.06%时，提取物对羟基自由基的清除率
很低，光强度很小，这表明体系中若无过氧化氢的存
在就没有羟基自由基的生成，无法产生化学发光。
当 H2O2 的浓度为 0.06% ～0.3%时，体系的化学发光
值随着 H2O2 浓度的增大而剧增，提取物对羟基自由
基的清除率迅速提高，清除效果非常明显，而后随着
H2O2 浓度的继续增大，发光强度逐渐减少，清除率开
始下降。这是因为 H2O2 本身对羟基自由基也有一
定的抑制作用［9］，H2O2 浓度过大，不仅会抑制发光，
也会使体系的发光处于一种不稳定的状态。三次平
行实验，结果表明，H2O2 的最合适浓度为 0.3%。
图 8 H2O2 浓度对测定结果的影响
Fig.8 Impact of H2O2 concentration on test results
2.2.3 鲁米诺浓度的选择 在其它条件不变的情况
下，考察体系中鲁米诺溶液浓度对发光强度的影响，
结果见图 9。测定体系中 H2O2 的浓度为 0.3%、pH
为 10.18、1 × 10 －5mol /L CuSO4 和 1 × 10
－5mol /L 维生
素 C加入量为 7∶4。由图 9 可以看出，体系的化学发
光依赖于鲁米诺的存在，当鲁米诺浓度为 0.4 × 10 －4
(下转第 145 页)
145
ΔSθ =(ΔHθ－ΔGθ)/T 式(9)
式中:CBe和 CAe分别是次甲基蓝在吸附剂中的平
衡浓度 (mg · L －1)和 在 溶 液 中 的 平 衡 浓 度
(mg·L －1) ;KC 为平衡常数;ΔSθ 为标准吸附熵变;
ΔHθ 为标准吸附焓;ΔGθ 为标准吸附自由能;T(K)为
温度;R为气体常数(J·mol －1·K －1)。
表 3 微孔淀粉吸附次甲基蓝的热力学参数
Table 3 Thermodynamic parameters for the adsorption
of MB in micro－porous starch
热力学参数 303K 318K 333K
Kc 15.2391 4.8268 2.3390
ΔGθ(kJ mol － 1) － 6.8652 － 4.1620 － 2.3524
ΔHθ(kJ mol － 1) － 44.4026
ΔSθ(kJ mol － 1 K －1) － 0.1239 － 0.1265 － 0.1263
由吸附热力学函数计算值分析:微孔淀粉对次
甲基蓝的吸附是自发过程(ΔGθ ＜ 0) ，且 ΔGθ 的绝对
值随着温度的升高而增加，这与等温吸附线表现出
的温度升高、吸附量减少的实验结果一致。此吸附
反应为放热过程。
3 结论
3. 1 在 30℃、pH为 5.0 时，吸附 60min后，微孔淀粉
对次甲基蓝吸附效果最好。
3. 2 微孔淀粉对次甲基蓝的吸附符合准二级动力
学方程。随着反应温度的升高，反应速率减小。由
此推断，微孔淀粉对次甲基蓝的吸附是放热反应。
3. 3 微孔淀粉对次甲基蓝的吸附符合 Freundlich 吸
附等温方程。体系温度升高，微孔淀粉对次甲基蓝
的吸附量逐渐减少，说明此过程可能是放热过程。
3. 4 吸附热力学参数为:ΔGθ ＜ 0，ΔHθ ＜ 0，ΔSθ ＜ 0，
吸附是自发的过程。
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2008.
(上接第 248 页)
～1.2 × 10 －4mol /L 时，随着鲁米诺浓度的增加，体系
的化学发光值呈逐渐增大的趋势，羟基自由基的清
除率也逐渐增大;而当鲁米诺浓度达到 0.8 × 10 －4
mol /L时，发光值达到最大值，发光强度趋于稳定，测
量体系相对稳定，提取液对羟基自由基的清除率达
到最大，可达 98.2%，继续增大鲁米诺浓度，体系的
发光强度降低，且实验的重现性较差。提取液对羟
基自由基的清除率下降，三次平行实验，结果表明，
最合适的鲁米诺浓度为 0.8 × 10 －4mol /L。
图 9 鲁米诺浓度对测定结果的影响
Fig.9 Impact of Luminol concentration on test results
3 结论
实验结果表明，以微波辅助提取，当料液比为
13∶25，乙醇浓度为 50%，温度为 55℃，时间为 25min，
微波功率为 600W时，蒌叶乙醇提取物对·OH 的清
除率效果最佳，清除率可达 98.2%，具有很强的抗氧
化活性;当 pH为 10.18，H2O2 浓度为 0.3%时，鲁米诺
浓度为 0.8 × 10 －4 mol /L，体系测量精密高、稳定性和
重复性好。蒌叶乙醇提取物为一混合体系，清除·
OH的作用机理较复杂，有待进一步研究。
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