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中国药物应用与监测 2015年2月 第12卷 第1期 Chinese Journal of Drug Application and Monitoring, Vol.12, No.1, February 2015
人鼻咽癌是在鼻咽部形成的恶性肿瘤，其发生与
EBV感染、遗传缺陷和环境因素有关 [1]，主要在东南
亚、阿拉斯加、南非和中东等地发病率较高，尤其是
在中国南部 [2]。目前，放疗和手术两种方法主要应用
于鼻咽癌早期和转移，或者化疗或放化疗后的复发等
症状。有报道 [3]指出，成人和儿童鼻咽癌患者 5年内
的存活率大约都在60%。因此，发展新的治疗方法和
发现新的药物用于鼻咽癌的治疗很有必要。
化合物AG4[4]是从紫金牛科（Myrsinaceae）紫金
牛属植物走马胎（Ardisia gigantifolia Stapf.，缩写为
AG）干燥的根茎中提取分离得到的一种三萜皂苷成
分，其化学名为：3β-O-{α-L-吡喃鼠李糖基 -(1→ 3)-
[β-D-吡喃木糖基 -(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基 -(1→4)-
[β-D-吡喃葡萄糖 -(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖基 }-西
克拉敏A。本实验室前期的研究结果表明 [4-5]，AG4
对人宫颈癌细胞（HeLa）、人膀胱癌细胞（EJ）、人胃
癌细胞（BGC-823）及人肝癌细胞（HepG2）有明显的
增殖抑制作用。在此基础上进一步研究发现，AG4在
体外对人鼻咽癌细胞CNE的增殖有明显的抑制作用。
本文建立人鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型，考察不同剂
量的AG4在裸鼠体内的抑瘤作用及可能的机制。
1　材料
1.1　细胞株
人鼻咽癌细胞CNE购于中国医学科学院肿瘤医
走马胎中化合物AG4对人鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的影响
陈　超，孙　艳，董宪喆，郭代红，郑小丽，穆丽华，刘　屏（解放军总医院临床药理研究室，北京 100853）
[摘要 ]　目的：研究走马胎中化合物AG4对人鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法：建立人鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植
瘤模型，以抑瘤率为指标研究化合物AG4的体内抑瘤作用及AG4干预对裸鼠的一般情况（体质量、活动、食欲等）的影响；
同时采用实时荧光定量PCR法观察AG4对肿瘤内凋亡相关基因表达的影响。结果：阳性药顺铂组（2.00 mg·kg-1）对荷瘤裸鼠
的抑瘤率为49.41%，3.02 mg·kg-1AG4组的抑瘤率为42.34%，AG4对裸鼠体质量及肝、脾、肾的脏器指数没有明显影响；AG4
能明显升高Bax和Bad基因的相对表达量，降低Bcl-2基因的相对表达量。结论：AG4在裸鼠体内对人鼻咽癌细胞有较强的
抑制作用，对裸鼠没有明显的毒副作用，其作用机制可能与激活线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡有关。
[关键词 ]　走马胎；鼻咽癌；Bcl-2家族；裸鼠
[中图分类号 ]　R96　　 [文献标识码 ]　A　 [文章编号 ]　1672 – 8157(2015)01 – 0012 – 04
Inhibition of compound AG4 from Ardisia gigantifolia Stapf. on xenograft tumor growth of human
nasopharyngeal carcinoma in nude mice
CHEN Chao, SUN Yan, DONG Xian-zhe, GUO Dai-hong, ZHENG Xiao-li, MU Li-hua, LIU Ping(Department of Clinical
Pharmacology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
[ABSTRACT]　Objective: To investigate the influence of compound AG4 derived from Ardisia gigantifolia Stapf. on xenograft
tumor of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) in nude mice. Methods: Human NPC nude mice model were established, and the
inhibition rate (IR) was the index to evaluate the tumor growth suppression of AG4 in vivo. Simultaneously, general conditions (weight,
action, appetite) of nude mice and the expression of Bcl-2, Bad and Bax mRNA by real time PCR method were observed during
AG4 interference. Results: The IR of positive control group (cisplatin 2.00 mg·kg-1) and AG4 group (3.02 mg·kg-1) was 49.41% and
42.34% respectively. The effect of AG4 on the weight lose of nude mice was not significant comparing with negative control group,
and the toxicity of AG4 to the vital organs (liver, spleen and kidney) and immunity index (spleen index) was not obvious in short
period. AG4 could increase the Bax and Bad mRNA expression, and decrease the Bcl-2 mRNA expression. Conclusion: AG4 had
obvious inhibition effects on xenograft tumor in human NPC nude mice, and with no outstanding adverse effects, the mechanisms
may relate to the induction of tumor apoptosis due to the activation of mitochondria signal pathway.
[KEY WORDS]　Ardisia gigantifolia Stapf.; Nasopharyngeal carcinoma; Bcl-2 family; Nude mice
[基金项目 ]　国家自然科学基金资助项目（31370006）
[通信作者 ]　刘屏，女，研究员，主要从事中药药理和中药化学方
向的研究。E-mail：liuping301@126.com
[作者简介 ]　陈超，女，副主任药师，主要从事肿瘤药理学的研究。
E-mail：cherie_301@126.com
·实验研究·
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中国药物应用与监测 2015年2月 第12卷 第1期 Chinese Journal of Drug Application and Monitoring, Vol.12, No.1, February 2015
院，由本实验室复苏、传代、培养。
1.2　实验动物
雄性 BALB/C裸鼠 50只，4 ~ 5周龄，体质量
（18.96 ± 0.51） g，由解放军军事医学科学院动物实验
中心提供，实验动物质量合格证号：SCXX（京）2011-
0004，饲养于无特定病原体（specific pathogen free，
SPF）环境中。
1.3　实验仪器
MyIQ荧光定量PCR仪（美国Bio-RAD公司）；恒
温金属浴（北京金银杏生物科技公司）；MCO-15AC二
氧化碳培养箱（日本SANYO公司）；洁净工作台（北
京亚泰科隆仪器技术有限公司）；TS100倒置生物显微
镜（日本Nikon公司）。
1.4　主要试剂
AG4（纯度 99%，中国人民解放军总医院药理研
究室提供）；顺铂（cisplatin，DDP，齐鲁制药有限公
司）；0.9%氧化钠注射液（青岛华仁药业股份有限公
司）；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血
清（FCS，美国HyClone公司）；胰蛋白酶干粉（美国
Amresco公司）；Trizol（Invitrogen公司）；SybrGreen
qPCR Mix和第一链反转录试剂盒（TOYOBO公司）。
1.5　试药配制
AG4溶液的配制：精确称取6.34 mg的AG4冻干
粉，溶解于21 mL的0.9%氯化钠注射液中，混匀，无
菌过滤。工作液稀释至相应浓度，分装后于 – 20 ℃
储存。DDP溶液的配制：精确称取2.40 mg的DDP冻
干粉，溶解于 12 mL的 0.9%氯化钠注射液中，混匀，
无菌过滤，分装后于– 20 ℃储存。
2　方法
2.1　细胞培养
细胞置于含体积分数为 10%胎牛血清的RPMI
1640培养基中，在37 ℃，5% CO2，饱和湿度的条件下培
养，2 d换液一次，细胞生长至70% ~ 80%融合时传代。
2.2　人鼻咽癌细胞CNE裸鼠皮下移植瘤模型的建立
将处于对数生长期的CNE细胞胰酶消化，离心，
用不含血清的RPMI 1640培养基重悬，制备成细胞密
度为 7.50×l09·L-1的单细胞悬液，按每只 0.2 mL（约
1.50×l06个细胞）接种于裸鼠右前肢皮下。接种CNE
细胞后，每日观察一次，以瘤块长径大于 5 mm且触
之质硬视为造模成功的标准。
2.3　分组及给药
待瘤体长到 200 mm3时，将所有裸鼠随机分成
5组，阴性对照组（等体积NS）、DDP阳性药组（2.00
mg·kg-1）及AG4低、中、高 3个剂量组（0.76、1.51、
3.02 mg·kg-1），每组10只，按照各组相应的给药剂量，
每 2天腹腔注射给药一次，每只每次 0.2 mL，给药 6
次，阴性对照组给予等体积的0.9%氯化钠注射液。
2.4　AG4对人鼻咽癌裸鼠体内移植瘤生长情况的影响
每 2天称量裸鼠体质量和测量移植瘤体积 1次，
每次用电子数显卡尺测量移植瘤的长径（a）及与之垂
直的短径（b），计算肿瘤体积（tumor volume，TV），
TV=a×b2/2，并绘制各组移植瘤的生长曲线。末次给
药后第3日，称重，观察给药前后裸鼠体重的变化；颈
椎脱臼裸鼠，剖取腋下瘤组织，按公式 [6]计算肿瘤生
长抑制率（inhibition rate，IR） = [（阴性对照组平均瘤
重–干预组平均瘤重）/阴性对照组平均瘤重 ]×100%；
取出肝、脾、肾，分别称重，并计算脏器指数。阴性对
照组肿瘤平均瘤重小于1 g，或20%肿瘤重量小于400
mg，表示肿瘤生长不良，实验作废。参考文献的评价
标准 [7]：肿瘤生长抑制率< 30%为无效；肿瘤生长抑制
率≥30%，并经统计学处理，P < 0.05为有效。
2.5　Real time PCR
取约 1 0 0 m g 裸鼠原位移植瘤采用 T r i z o l
一步法抽取瘤组织总 R N A，定量后取 2 μ g 总
R N A逆转录成 c D N A；以管家基因 β - a c t i n 为
内 参 照 ，上 下 游 引 物 由 北 京 奥 科 鼎 盛 生 物
科技有限公司设计合成。 B c l - 2 上游引物：
5 -TCTGTGGATGACTGAGTACCTGAAC-3，下游
引物：5-AGAGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3；
Bax上游引物：5-CAGCAAACTGGTGCTCAAGG-3，
下游引物：5-GCCACAAAGATGGTCACGGT-3；Bad
上游引物：5-CGGAGGATGAGTGACGAGTTT-3，下游
引物：5-GGGTGGAGTTTCGGGATGTG-3；β-actin
上游引物：5-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3，下游
引物：5-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3。采用
MyIQ荧光定量 PCR仪，反应条件为 95 ℃预变性
2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环，并用自带分
析软件分析每个样本目的基因的ΔCt值，以2-ΔΔCt方
法比较用药组目的基因相对于对照组的表达。
2.6　数据处理
采用SPSS 19.0软件对数据作统计分析，数据用
（ ± sx ）表示，n = 10。组内数据进行正态分布检验，
组间数据进行方差齐性检验和单因素方差分析（one-
way，ANOVA），并采用SNK和LSD法进行两两比较，
P < 0.05为差异具有统计学意义。
3　结果
3.1　AG4对荷瘤裸鼠移植瘤生长的影响
裸鼠右前肢皮下接种CNE细胞，第 5天接种部
位即可见触之质硬的组织并达到造模标准，造模成功
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中国药物应用与监测 2015年2月 第12卷 第1期 Chinese Journal of Drug Application and Monitoring, Vol.12, No.1, February 2015
率100%。接种第13天，移植瘤体积长到200 mm3左
右时，将裸鼠随机分组后，开始腹腔给药。以给药时
间为横坐标，移植瘤体积为纵坐标，作移植瘤生长曲
线。如图1所示，各干预组移植瘤生长均较阴性对照
组慢。其中DDP组最慢，并且AG4高剂量组与之相
当，AG4中剂量组次之，AG4低剂量组与阴性对照组
移植瘤体积大小接近。AG4对瘤重的影响如表 1所
示，0.76、1.51和3.02 mg·kg-1剂量的AG4的抑瘤率分
别为7.31%（P > 0.05）、24.60%（P < 0.01）和42.34%（P <
0.01），且呈现良好的剂量 -效应关系；DDP对照组的
抑瘤率为49.41%。
3.2　AG4对荷瘤裸鼠体质量及免疫器官脏器系数的影响
AG4化疗后对裸鼠毒副作用的观察实验期间，50
只裸鼠无 1例死亡，但是随着移植瘤的长大，裸鼠精
神状态不佳，活动减少，食欲减退，但是药物干预组
在给药后的第 3天能恢复正常。如表 2所示，各组裸
鼠在给药前后体质量均有下降趋势，并且DDP组裸
鼠平均体质量下降最明显，但是各给药组与阴性对照
组比较差异均没有统计学意义（P > 0.05）。末次给药
后第 3天，取裸鼠重要免疫器官称重，发现各干预组
鼻咽癌裸鼠的肝、肾重量与NS组接近，如图 2所示；
DDP组和AG4高剂量组的脾指数虽有所增加，但与
NS组相比，差异均没有统计学意义（P > 0.05）。
3.3　AG4对荷瘤裸鼠肿瘤相关基因表达的影响
采用RT-PCR法检测线粒体通路上凋亡相关基因
的表达情况。由图3可见，AG4（1.51 mg·kg-1）、AG4
（3.02 mg·kg-1）组Bax和Bad基因的相对表达量均明显
高于正常对照组（P < 0.01）；给予AG4治疗后抗凋亡
基因Bcl-2的表达量降低。
4　讨论
裸鼠目前已成为医学生物学研究领域中不可缺
少的实验动物模型。特别是在肿瘤学、免疫学、毒理
学及有效药品的筛选等实验方面，它有着特殊的价
值。多年来，研究者建立了多种鼻咽癌动物模型，包
括诱发性鼻咽癌动物模型、移植性鼻咽癌动物模型、
转基因和基因敲除鼻咽癌动物模型、鼻咽癌转移动物
组别 剂量 /mg·kg-1
体质量 /g
体质量下降 /g
给药前 给药结束
NS – 19.75±2.02 18.15±2.02 1.60±0.65
DDP 2.00 21.58±1.69 19.40±1.42 2.18±0.40
AG4 0.76 18.05±3.18 16.80±3.68 1.25±0.35
1.51 19.93±2.54 18.15±1.65 1.78±0.54
3.02 18.86±3.81 17.08±2.50 1.80±0.19
表2　AG4对人鼻咽癌细胞CNE裸鼠体质量的影响
Tab 2　Effect of AG4 on the body weight of human nasopharyngeal
carcinoma CNE nude mice
图2　AG4对荷瘤裸鼠脏器系数的影响
Ⅰ– AG4对鼻咽癌细胞CNE裸鼠肝、肾的影响，Ⅱ– AG4对鼻咽癌
细胞CNE裸鼠脾指数的影响；A – NS组，B – DDP组，C – AG4（0.76
mg·kg-1）组，D – AG4（1.51 mg·kg-1）组，E – AG4（3.02 mg·kg-1）组
Fig 2　Effects of AG4 on organ index of human nasopharyngeal
carcinoma CNE nude mice
Ⅰ – effect of AG4 on liver and kidney index of human nasopharyngeal
carcinoma CNE nude mice, Ⅱ – effect of AG4 on spleen index of
human nasopharyngeal carcinoma CNE nude mice; A – NS group, B –
DDP group, C – AG4 (0.76 mg·kg-1) group, D – AG4 (1.51 mg·kg-1)
group, E – AG4 (3.02 mg·kg-1) group
组别 剂量 /mg·kg-1 瘤重 /g 抑瘤率 /%
NS – 1.37±0.38 –
DDP 2.00 0.70±0.17 49.41**
AG4 0.76 1.28±0.21 7.31
1.51 1.04±0.15 24.60**
3.02 0.80±0.19 42.34**
表 1　AG4对人鼻咽癌细胞CNE裸鼠体内移植瘤生长的抑制
作用
Tab 1　Inhibition effect of AG4 on xenograft tumor growth in
human nasopharyngeal carcinoma CNE nude mice　
注：与NS对照组相比，**P < 0.01
Note: compared with NS control group, **P < 0.01
图1　AG4对人鼻咽癌细胞CNE裸鼠移植瘤生长的影响
Fig 1　Effect of AG4 on human nasopharyngeal carcinoma CNE
xenograft tumor growth in nude mice
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中国药物应用与监测 2015年2月 第12卷 第1期 Chinese Journal of Drug Application and Monitoring, Vol.12, No.1, February 2015
模型等 [8]。其中建立移植性鼻咽癌动物模型的成功率
较高，其方式主要有肿瘤组织块接种、组织块悬液注
射、肿瘤细胞悬液注射等。已有不少学者采用移植法
成功的将人鼻咽癌细胞移植到裸鼠皮下，并证实此法
长出的瘤组织能保持原发癌的形态结构、生物学特性
和遗传学特征 [9-10]。肿瘤细胞悬液注射法建模，即将
目的瘤细胞接种在裸鼠背部或腋下部的皮下，此法操
作简单，建模周期短，肿瘤位置表浅便于观察和测量
瘤体的大小。
故本文采用CNE细胞悬液直接接种于裸鼠腋下
部的皮下，成功建立了鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型，
待移植瘤长到 200 mm3左右后开始腹腔给药。由各
组鼻咽癌移植瘤的生长曲线可知，AG4腹腔注射给
药组移植瘤组织生长均较NS组慢，其中3.02 mg·kg-1
AG4组与阳性药DDP组生长速度接近，而0.76 mg·kg-1
AG4组与NS组无明显差异。连续给药 6次后，发现
3.02 mg·kg-1AG4组与DDP组的平均抑瘤率分别为
42.34%和49.41%，均大于30%，根据评价标准，说明
3.02 mg·kg-1的AG4能有效的抑制人鼻咽癌细胞CNE
裸鼠移植瘤的生长。为更深入的研究各条通路上的
凋亡相关基因的表达情况，采用RT-PCR法对AG4
抗肿瘤的机制进行了分子水平上的进一步探讨，检
测了线粒体通路上的促凋亡基因Bax、Bad和抗凋亡
基因Bcl-2。实验结果显示，AG4能明显升高Bad、
Bax基因的表达量，下调Bcl-2基因的表达。可见，
Bcl-2家族的成员在AG4抗肿瘤作用中起着关键的
作用。
目前治疗肿瘤的方法包括手术、放疗、化疗或者
多种方法配合，但是大多数方法都会给患者带来不
同程度的副反应，常见的有呕吐、脱发、体质量下降
等，甚至有的抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对
机体免疫功能也有很大的影响，常引起胸腺指数、脾
指数等免疫指标的异常 [11]。给药期间发现，裸鼠在
腹腔注射AG4溶液后当天活动减少，食欲减弱，但是
在第3天恢复正常，不影响下一次给药。末次给药后
称裸鼠体质量，比较给药前后各组裸鼠的平均体质量
变化。结果显示，各组裸鼠平均体质量均较给药前有
所降低，其中DDP组和高剂量AG4组最为明显，中剂
量AG4组次之，低剂量AG4组平均体质量降低的幅度
小于NS组，虽然体质量都有所下降，但是与NS组比
较，没有显著性差异（P > 0.05）。末次给药结束后，取
裸鼠相应组织称重，发现各给药组肝和肾的重量与NS
组比较，没有明显差异，说明AG4在短时间内对裸鼠
肝和肾没有明显的毒副作用。同时发现，阳性药顺铂
组和高剂量AG4组的脾指数与对照组相比略有升高。
推断，AG4不仅不影响裸鼠的免疫系统，有可能还会
改善其免疫功能，具体机制还需深入研究。
[参考文献 ]
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（收稿日期：2014-10-14 修回日期：2014-12-26）
图3　AG4对荷瘤裸鼠肿瘤凋亡相关基因表达的影响
A – NS组，B – AG4（0.76 mg·kg-1）组，C – AG4（1.51 mg·kg-1）组，
D – AG4（3.02 mg·kg-1）组；与A组比较，**P < 0.01
Fig 3　Effects of AG4 on Bcl-2, Bax, Bad mRNA expression of
human nasopharyngeal carcinoma CNE nude mice
A – NS group, B – AG4 (0.76 mg·kg-1) group, C – AG4 (1.51 mg·kg-1)
group, D – AG4 (3.02 mg·kg-1) group; compared with group A, **P < 0.01