全 文 ：书第 43卷 第 3期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol．43 No．3
2015年 3月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Mar． 2015
1)中国博士后基金(20110491124)。
第一作者简介:曲昊淼，男，1988年 10 月生，东北林业大学野生
动物资源学院，硕士研究生。E－mail:510008084@ qq．com。
通信作者:夏彦玲，东北林业大学野生动物资源学院，副教授。
E－mail:xiayanling1974@ 163．com。
收稿日期:2014年 8月 4日。
责任编辑:程 红。
梅花鹿鹿茸组织 Anxa－1基因 cDNA克隆及表达1)
曲昊淼 丁玲 赵姬臣 夏彦玲
(东北林业大学，哈尔滨，150040)
摘 要 从梅花鹿(Cervus nippon)鹿茸间充质中成功克隆出包括膜联蛋白 A1(Anxa－1)基因全部编码区的
cDNA序列，并结合生物学信息方法及实时荧光定量技术对该基因的氨基酸序列及不同生长时期的表达情况进行
了分析。结果表明:Anxa－1基因编码 346个氨基酸。经生物学信息分析，该基因编码蛋白为稳定蛋白，不具备信
号肽，相对分子质量为 38 830．4，理论等电点为 6．17，一级结构中亮氨酸占最大比例(10．4%)。同源序列比对及系
统进化树分析表明，梅花鹿 Anxa－1氨基酸序列与藏羚羊(Pantholops hodgsonii)、绵羊(Ovis aries)、山羊(Capra hir-
cus)和水牛(Bubalus bubalis)相似性较高。实时荧光定量 ＲT－PCＲ分析表明，Anxa－1基因在不同生长时期鹿茸顶
端间充质表达存在差异，生长前期的表达量高于中期与后期。
关键词 膜联蛋白 A1;鹿茸;cDNA;克隆;实时荧光定量 ＲT－PCＲ
分类号 S825．2
Cloning and Expression Analysis of Anxa-1 Gene cDNA from Sika Deer Antler Tissue / /Qu Haomiao，Ding Ling，
Zhao Jichen，Xia Yanling(Northeast Forestry University，Harbin 150040，P． Ｒ． China)/ / Journal of Northeast Forestry Uni-
versity，2015，43(3):99－103．
We cloned the cDNA sequence including all the coding region of the Anxa-1 gene from sika deer antler mesenchymal
for the first time，and used bioinformatics method and real-time ＲT-PCＲ to analyze the amino acid sequence and the ex-
pression at different phases． The Anxa-1 gene encoded a peptide of 346 amino acid residues of which the relative molecular
weight was 38 830．4． By analyzing biological information，the gene had an isoelectric point of 6．17，and did not contain a
signal peptide;Leucine accounted for the largest proportion in the primary structure was 10．4%． Homologous sequence a-
lignment and phylogenetic tree analysis indicated that the Anxa-1 mature protein of sika deer was highly similarity with
Pantholops hodgsonii，Ovis aries，Capra hircus and Bubalus bubalis． By real-time ＲT-PCＲ，the gene expression at different
phases had specificity，and the expression of the Anxa-1 gene was higher at its earlier stage than that at its intermediate
and advanced stage．
Keywords Annexin A1;Antler;cDNA;Clone;Ｒeal-time ＲT-PCＲ
鹿茸为雄鹿(驯鹿除外)未骨化而带有茸毛的
幼角，是我国一种传统贵重的滋补药材，在中医临床
中占有重要地位，已有两千多年的入药历史。鹿茸
的独特之处在于其是所有动物组织中唯一可以循环
再生的组织;在生长旺期，其尖端组织细胞的分裂生
长速度是肿瘤细胞生长速度的 30多倍，但没有任何
癌变迹象，这吸引了众多科学家的高度关注［1－3］，是
研究哺乳动物细胞增殖、生长与分化的理想材料。
鹿茸的快速增长离不开各种基因的调控，而这些基
因由于其自身因素及其在不同生长阶段表达量的不
同，导致其在组织中存在不同的调控作用，因此了解
基因在鹿茸组织中的调控作用有助于更深层次的了
解鹿茸的生长发育机理。
膜联蛋白 A1(Anxa－1)是一种以 Ca2+介导能与
带有负电荷的细胞膜磷脂相结合的蛋白，是 Annexin
超家族在脊椎动物中第一个被发现且研究最为深入
的成员。Anxa－1 广泛分布于动植物的各种组织器
官中，不同动植物中其氨基酸残基组成的长度也有
很大不同［4］，最早是作为糖皮质激素诱导的磷脂酶
A2抑制蛋白被发现的。Anxa－1 在细胞分化、增殖
及凋亡过程中起着重要作用［5］，研究表明，其在不
同类型的肿瘤细胞中表达量存在显著差异。目前
GenBank中尚无鹿源 Anxa－1基因序列的任何记录。
本研究根据牛、猪等物种 Anxa－1 基因序列设计同
源引物，首次成功克隆了具有完整编码区的 Anxa－1
基因的 cDNA序列，并对其序列进行了生物信息学
分析，通过实时荧光定量技术研究了鹿茸间充质在
不同生长时期———生长前期(小鞍子)、生长中期
(二杠茸)、生长后期(三杈茸)中 Anxa－1 基因的表
达差异，推测其在鹿茸生长发育过程中的作用，这一
研究的开展可能为鹿茸的生长发育机理的研究提供
很好的理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1．1 试验材料
选取人工驯养的一头健康成年东北梅花鹿
(Cervus nippon)作为试验动物。在其小鞍子茸型时
采集左茸顶端组织作为前期试验样品，在其二杠茸
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.20150120.015
型时采集右茸顶端组织作为中期试验样品，在其被
锯的左茸再长至三杈茸型时采集其顶端组织作为
后期试验样品，分别截取 3 个时期的鹿茸顶端 5
cm左右，迅速将其表面消毒，纵向剖开，按照 Li
等［6］所述的方法采取鹿茸顶端的间充质组织，按
每管大约 100 mg 分装于冻存管中，迅速放入液氮
罐中保存备用。
1．2 鹿茸顶端间充质组织的总 ＲNA的提取及 cDNA
模板的获取
按照 TＲIzol试剂的操作步骤分别提取鹿茸 3个
不同生长时期的总 ＲNA，1%琼脂糖凝胶电泳和紫
外分光法检测总 ＲNA 质量(图 1)。以提取的总
ＲNA为模板，以 Oligo－dT为引物，以 M－MLVⅢ逆转
录酶反转录合成 cDNA。
图 1 鹿茸顶端间充质组织总 ＲNA纯度检测
1．3 Anxa－1基因 cDNA克隆
参照 GenBank中牛、猪、绵羊等物种的 Anxa－1
基因 序 列，设 计 同 源 引 物 (Forward primer:
CAAAAATGGCAATGGTAT 和 Ｒeverse primer:AT-
CAAAGGAATGTTTAGTCTC)，以中期组织 cDNA 为
模板进行 PCＲ 扩增，利用 DNA 凝胶回收试剂盒回
收 PCＲ产物，将回收产物连接到 pMD18－T载体上，
转化到大肠杆菌 DH5α 中，涂板并于 37 ℃过夜培
养。挑取转化菌落，接种于 LB液体培养基中，37 ℃
振荡培养 6～8 h，经阳性克隆检测送往华大公司进
行双向测序。
1．4 Anxa－1的生物信息学分析
采用 OＲF 程序查找序列的开放阅读框，用 Ex-
PASy服务器上 ProtParam 程序分析蛋白的理化性
质，ProScal程序分析蛋白的疏水性，使用 NCBI 上的
BlastP 程序进行蛋白保守区预测，应用软件 Sig-
nalP3．0 预测蛋白的信号肽，使用 PSOＲT Ⅱ和 TM-
HMM Server v．2．0对蛋白质的亚细胞定位及跨膜蛋
白分析，使用 SOPMA 软件进行蛋白质的二级结构
预测。利用软件 DNAStar 和 MEGA5．0 进行氨基酸
的多重序列比对和系统进化树的绘制。
1．5 Anxa－1的实时荧光定量 ＲT－PCＲ分析
分别提取鹿茸尖端不同生长时期的总 ＲNA，反
转录成 cDNA。合成 Anxa － 1 基因的特异性引物
(Forward primer:GCTATCCCCATCTCCGCAG 和 Ｒe-
verse primer:GGCTGGCTTGTAGCACACTTC)，以 β－
actin 作为内参基因(Forward primer:GCGTGACAT-
CAAGGAGAAGC 和 Ｒeverse primer:GGAAGGACG-
GCTGGAAGA)，对鹿茸不同生长时期的 Anxa－1 基
因表达量进行定量分析。在 ABI公司的 7500 Ｒeal－
Time PCＲ system 上进行 Ｒeal－time ＲT－PCＲ，PCＲ
反应体系(25．0 μL)包括:SYBＲ Premix EX TaqTM
Ⅱ(2×)12．5 μL，正向及反向引物(10 mmol·L－1)各
1．0 μL，cDNA模板 1．0 μL，加高压灭菌水补足体积
至 25．0 μL。反应程序分为两部分:第一部分为扩增
反应，95 ℃ 10 min，在 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃
30 s下循环 40次，设定在每个循环中 60 ℃ 1 min时
读取荧光值;第二部分为建立荧光 PCＲ产物熔解曲
线，扩增反应结束后继续从 72 ℃升温至 95 ℃，持续
15 s，然后降至 60 ℃，持续 1 min，之后缓慢升温至 95
℃，整体反应结束。使用软件 ABI 7500 Software
Version 2．3分析 Anxa－1基因相对 β－actin基因的的
差异表达 C t 值，通过普遍使用的 2
－ΔΔCt法［7］来计算
分析基因在不同时期的相对表达量，其中，ΔC t = C t
(目的基因)－C t(内标基因) ;ΔΔC t =ΔC t(试验组)－
ΔC t(对照组);2
－ΔΔCt表示试验组目的基因的表达相
对于对照组变化的倍数。
2 结果与分析
2．1 Anxa－1基因 cDNA的获得
Anxa－1基因的阳性克隆检测获得一条 1 000 bp
左右的插入片段(图 2) ，后经测序公司反馈回的双
向测序结果经 DNAStar 拼接得到 1 059 bp 片段，与
预期片段大小一致。经进一步与 GenBank 数据库
进行 Blast 比对分析，证实为 Anxa－1 基因的 cDNA
序列(图 3)。
M．DL2000 Marker;1．阳性菌落 PCＲ产物。
图 2 梅花鹿 Anxa－1基因 cDNA菌落 PCＲ阳性鉴定结果
001 东 北 林 业 大 学 学 报 第 43卷
图 3 Anxa－1基因的 cDNA序列和推定的氨基酸序列
2．2 Anxa－1基因的序列
OＲF程序显示:Anxa－1 基因的开放阅读框为
1 041 bp，编码 346个氨基酸;通过 NCBI的 BlastP 在
蛋白保守区数据库对 Anxa－1 基因进行蛋白保守区
预测表明，与此基因匹配的蛋白保守区共有 4 个
Annexin结构域，其匹配区段分别为从第 47 ～ 111 个
氨基酸、第 118 ～ 183 个氨基酸、第 202 ～ 267 个氨基
酸和第 277～342个氨基酸(图 4);ProtParam软件预
测 Anxa－1基因编码蛋白的相对分子质量为 38 830．4，
理论等电点为 6．17，整个氨基酸组成中亮氨酸占最
大比例(10．4%)，其次为赖氨酸(9．8%) ，不稳定系
数为 39．26，属于稳定蛋白;使用 SignalP3．0 软件显
示该基因编码的蛋白质不具备信号肽;利用 TM-
HMM Server v．2．0软件预测到其跨膜蛋白的数目为
0，结果预期数值为 0．00019，分值小于 18，它不可能
是一个跨膜蛋白;使用 PSOＲT Ⅱ软件进行亚细胞定
位分析表明，56．5%的可能性在细胞质中。
图 4 推导的 Anxa－1氨基酸保守区查找结果
2．3 不同物种间 Anxa－1的同源性
将梅花鹿与 GenBank选出的 8种动物的 Anxa－1
氨基酸全序列进行 BlastP 对比，发现其与藏羚羊
(Pantholops hodgsonii)、绵羊(Ovis aries)、山羊(Ca-
pra hircus)、水牛(Bubalus bubalis)具有很高的相似
性，与小鼠(Mus musculus)和猪(Sus scrofa)次之，而
与原鸡(Gallus gallus)和人(Homo sapiens)的 Anxa－1
序列相似性最低。
应用软件 DNAStar 和 MEGA5．0 对 9 个物种的
Anxa－1氨基酸序列进行多重序列比对和系统进化树
的绘制(图 5、图 6)，结果表明，不同物种的Anxa－1氨
基酸表现出较高的同源性，说明 Anxa－1基因作为功
能基因在进化中具有较高的保守性。从进化树可以
看出，在该基因座位上梅花鹿与藏羚羊、绵羊、山羊和
水牛在进化关系上较近，与原鸡和人亲缘关系较远，
分析结果与各种物种在传统分类学上的地位一致。
101第 3期 曲昊淼，等:梅花鹿鹿茸组织 Anxa－1基因 cDNA克隆及表达
1．梅花鹿(Cervus nippon) ;2．绵羊(Ovis aries) ;3．藏羚羊(Pantholops hodgsonii) ;4．山羊(Capra hircus) ;5．人类(Homo sapiens) ;6．猪(Sus scrofa) ;7．
小鼠(Mus musculus) ;8．水牛(Bubalus bubalis) ;9．原鸡(Gallus gallus)。
图 5 梅花鹿与其他动物 Anxa－1氨基酸的多重序列对比
图 6 动物 Anxa－1系统进化树
2．4 Anxa－1基因的实时荧光定量 ＲT－PCＲ
实时荧光定量 ＲT－PCＲ的结果显示，Anxa－1基
因在鹿茸生长前期表达量是中期的(1．84±0．34)倍，
后期的表达量是中期的(1．12±0．26)倍，可见 Anxa－
1基因在鹿茸尖端表达的规律是前期＞后期＞中期
(表 1)。
表 1 鹿茸顶端间充质组织前期、后期与中期 Anxa－1 基因
表达的差异
生长期
Anxa－1平均
Ct值
β－actin平均
Ct值
ΔCt ΔΔCt 2－ΔΔCt
前期 22．34±0．03 23．04±0．19 －(0．70±0．11)－(0．88±0．21) 1．84±0．34
中期(对照组) 23．41±0．03 23．23±0．11 0．18±0．06 0 1．00
后期 22．68±0．22 22．67±0．10 0．02±0．14 －(0．16±0．24) 1．12±0．26
注:表中数据为平均值±标准差。
3 结论与讨论
Anxa－1 基因 cDNA 中开放阅读框 1 041 bp 编
码 346 个氨基酸残基，组成分子量为 38 830． 4 的
Anxa－1蛋白，其中心结构域由 4 个重复序列组成，
每个重复序列含有 5 个 α螺旋。4 个重复序列紧密
201 东 北 林 业 大 学 学 报 第 43卷
压缩在一起，形成一个轻度弯曲的盘状结构，具有与
钙离子及磷脂结合的位点。从其生物学信息分析中
可以看出，其编码蛋白质没有具备信号肽的可能，且
不是跨膜蛋白，是高度保守的稳定蛋白。利用 MEGA
软件进行物种间遗传距离计算得出与原鸡的遗传距
离最远，与藏羚羊遗传距离最近，其分析结果与物种
的传统分类学地位十分一致，且符合进化关系。
近年来的研究表明，Anxa－1基因可能是作为一
种肿瘤抑制基因或某些肿瘤细胞 /组织特定类型的
肿瘤启动子。Srisomsap等［8］研究证明 Anxa－1 主要
具有抑癌功能，其在肿瘤形成前呈高表达，其后随不
同程度而减弱。也有研究表明其可抑制由表皮生长
因子(EGF)引起的肝细胞增殖［9］。但有研究发现
Anxa－1 也可促进细胞增殖，在肝细胞中磷酸化的
Anxa－1 可作为一种诱导信号刺激细胞信使前列腺
素 E2的释放，从而引发一系列的细胞增殖反应［10］。
目前就 Anxa－1 基因在细胞增殖中的作用还存在疑
议，有可能是其在不同的组织细胞中发挥不一样的
作用导致。本研究发现，Anxa－1基因在鹿茸生长前
期表达量高于生长中期、后期的表达量，由此可以推
测其在生长前期抑制了鹿茸细胞的增殖，而到了中
期和后期表达下调，鹿茸得以进入快速增长期。
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