全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 8期，第 1802-1807页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.8, 1802-1807
研究报告
Research Report
甜叶菊甜菊醇糖苷生物合成关键酶基因表达量与莱宝迪苷 A含量的相
关关系
张虹 1,2 张芮 1,2 薄玉瑶 1,2 刘祥 1,2 张自萍 1,2 陈任 1,2*
1宁夏大学生命科学学院,银川, 750021; 2宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,银川, 750021
*通讯作者, chenren511@163.com
摘 要 莱宝迪苷 A (rebaudioside, RA)是甜叶菊甜菊醇糖苷中的主要甜味成分，其含量受到生物合成中多个
酶基因的影响。本研究以 6个甜叶菊品种为材料，利用实时荧光定量 RT-PCR测定 RA生物合成途径中
UGT85C2、UGT91D2m和 UGT76G1三个关键酶基因的表达量，并与其 RA含量进行相关性分析。结果显示
UGT76G1基因相对表达量与 RA含量有极显著相关关系(p=0.008)，而 UGT85C2和 UGT91D2m基因表达量与
RA含量无相关关系，说明 UGT76G1基因的表达对 RA合成有着较为重要的影响。研究结果可为利用基因工
程手段人为调控甜菊醇糖苷的生物合成，提高 RA的含量提供理论依据。
关键词 甜叶菊,甜菊醇糖苷, UDP- 糖基转移酶,实时荧光定量 RT-PCR,相关性分析
Correlation between the Transcript Levels of Key Enzyme-encoding Genes
and the Content of Rebaudioside a in Steviol Glycoside Biosynthesis of
Stevia rebaudiana
Zhang Hong 1,2 Zhang Rui 1,2 Bo Yuyao 1,2 Liu Xiang 1,2 Zhang Ziping 1,2 Chen Ren 1,2*
1 School of Life Science, Ningxia University, Yinchuan, 750021; 2 Key Lab of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Bio-
logical Resources in Western China, Ningxia University, Yinchuan, 750021
* Corresponding author, chenren511@163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.013.001802
Abstract Rebaudioside A (RA) is a main sweetening ingredient of steviol glycosides in Stevia rebaudiana, the
content of which is influenced by many enzyme-encoding genes in the steviol glycoside biosynthesis pathway. In
present study 6 kind stevia cultivars were used for the real-time quantitative RT-PCR to measure their transcript
levels of 3 kinds of key enzyme-encoding genes, UGT85C2, UGT91D2m and UGT76G1 in the biosynthesis
pathway, and the correlation between the transcript levels and its RA content were analyzed. The results showed
that UGT76G1 transcript level and RA content had a significantly correlation (p=0.008), whereas UGT85C2 and
UGT91D2m had not, indicating that the UGT76G1 transcription had more important influence on the RA
biosynthesis. Our research will provide the necessary technology for regulation of steviol glycoside biosynthesis to
increase RA content in stevia by molecular breeding.
Keywords Stevia rebaudiana, Steviol glycosides, UDP-glycosyltransferases, Real-time fluorescence quantitative
RT-PCR, Correlation analysis
收稿日期：2015-04-13 接受日期：2015-05-08 网络出版日期：2015-06-23
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/3254
基金项目：本研究由宁夏大学引进人才科研启动经费(020-80020131)和宁夏回族自治区科技支撑计划项目(413-0396)共同资助
甜叶菊(Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl)甜菊
醇糖苷(steviol glycosids, SGs)因其甜度为蔗糖的 150~
450倍，而热量只有蔗糖的 1/300 (Brandle and Telmer,
2007)，是极为珍贵的天然甜味剂，对肥胖症、糖尿病
图 1甜叶菊甜菊醇糖苷生物合成途径
Figure 1 The biosynthesis pathway of steviol glycosides in Stevia rebaudiana
和龋齿等病患者尤为适宜，同时还具有降低血压、降
低尿酸值、抗氧化、抗病毒、促进新陈代谢和强壮身
体等功效，目前已广泛应用于食品、医药、饲料等生
产领域。目前已鉴定到的甜叶菊甜菊醇糖苷成分主
要有 9种：即甜菊醇糖苷(stevioside, ST)，莱宝迪苷
(rebaudioside, R) A、B、C、D、E和 F，以及杜尔可苷
(dulcoside, D) A和 B。其中，ST和 RA是最主要的两
种糖苷成分。ST占干叶重的 5%~10%，甜度是蔗糖
的 110~270倍，带有后苦味，在一定程度上影响了应
用效果；RA 占干叶重 2%~4%，甜度为蔗糖的
180~400倍，味质上与蔗糖较为接近，无后苦味，口感
和品质优于 ST (Yadav et al., 2011; Prakash et al., 2012;
Ceunen and Geuns, 2013)。因此，甜叶菊甜菊醇糖苷
的甜度和口感主要取决于 RA的含量，提高甜叶菊
叶中 RA的比例是生产中迫切需要解决的课题，它
关系到甜叶菊甜菊醇糖苷作为食用甜味剂的应用范
围、应用价值及与其他甜味剂的竞争力。
在甜叶菊甜菊醇糖苷生物合成途径中，所有的
甜叶菊糖苷均以甜菊醇为前体，在不同的 UDP- 糖基
转移酶(UDP-glycosyltransferases, UGTs)催化下，在
C13和 C19位上分别连接不同数量的葡萄糖基、鼠
李糖基和木质糖基而形成各种具有不同性质的甜菊
醇糖苷(Humphrey et al., 2006)。其中，控制甜叶菊糖
苷 RA生物合成的有 4个UGTs酶编码的基因(Rich-
man et al., 2005)，即 UGT85C2、UGT91D2m、UGT74G1
和 UGT76G1 (图 1)，它们在其甜菊醇糖苷生物合成
途径中是交叉作用、互相影响的。这些基因的详细功
能，特别是对 RA合成的调控机制还未见有报道。
本研究以中国目前种植的同心(TX)、绿源(LY)、
守田 2号(ST2)、中山(ZS)、守田 3号(ST3)和菊隆(JL)
6个甜叶菊品种为实验材料，对 6个甜叶菊品种 RA
合成途径中关键酶基因的表达量进行实时荧光定
量 RT-PCR检测，并利用高效液相色谱(HPLC)分析
其相对应的 RA含量，探讨位于 RA合成主路途径
上游的 UGT85C2、UGT91D2m 及最后一个酶基因
UGT76G1的表达量与 RA生物合成的相关关系，旨
在为今后利用基因工程手段人为调控各种甜菊醇糖
苷的生物合成，提高 RA的含量提供理论依据。
甜叶菊甜菊醇糖苷生物合成关键酶基因表达量与莱宝迪苷 A含量的相关关系
Correlation between Key Enzyme-encoding Genes and RA Content in SGs Biosynthesis of Stevia
1803
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 2不同甜叶菊品种总 RNA电泳图
注: M: DL2000 marker; 6个甜叶菊品种分别是: 1:同心; 2:绿
源; 3:守田 2号; 4:中山; 5:守田 3号; 6:菊隆
Figure 2 Electropherogram of total RNAs extracted from the
leaves of different stevia cultivars
Note: M: DL2000 marker; Six different stevia cultivars: 1: TX; 2:
LY; 3: ST2; 4: ZS; 5: ST3; 6: JL
表 1实时荧光定量 RT-PCR引物
Table 1 Primers for real-time fluorescence quantitative RT-PCR
基因名称
Gene name
UGT85C2
UGT91D2m
UGT76G1
EF1琢
正向 /反向引物(5-3)
Forward/reverse primer (5-3)
TGGGTTCTTGTCGGTTTTCAC/ACATCATGACCGGAATTCCAA
GGTTTCCCTTTCCGACCAAA/CACCAGTCGGGCAAGATCA
ATGGTCCGCTCGCTGGTAT/TCGTCAGCTCCGTGTTCGT
CTGCTGAAATGAACAAAAGGTCAT/ACGTTCAGCTTTGAGCTTGTCA
扩增长度(bp)
Length (bp)
62
56
54
65
图 3 6个不同甜叶菊品种中各基因相对表达量
注 : A: UGT85C2; B: UGT91D2m; C: UGT76G1; 1: 同心 ; 2: 绿
源; 3:守田 2号; 4:中山; 5:守田 3号; 6:菊隆
Figure 3 Gene relative transcript levels in six different stevia cul-
tivars
Note: A: UGT85C2; B: UGT91D2m; C: UGT76G1; 1: TX; 2: LY;
3: ST2; 4: ZS; 5: ST3; 6: JL
1结果与分析
1.1 总 RNA质量检测及实时荧光定量 RT-PCR扩
增体系验证
分别取 6个甜叶菊品种相同叶位的叶片提取总
RNA，经超微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测，
结果表明，所有的 RNA样品 OD 值 2.0臆A260/280臆
2.2，A260/230逸1.8，28S 和 18S RNA电泳条带清晰，无
明显拖尾现象(图 2)，说明提取的总 RNA样品完整
性较好。根据 NCBI 公布的甜叶菊 UGT85C2、
UGT91D2m、UGT76G1 和 EF1琢 (elongation factor-1
alpha)的 mRNA序列设计的引物(表 1)，经 PCR后的
溶解曲线检测均为单峰，说明引物具有特异性，荧光
定量 RT-PCR的结果准确可信。
1.2 不同甜叶菊品种间 UGT85C2、UGT91D2m 和
UGT76G1基因相对表达量分析
实时荧光定量 RT-PCR的结果表明(图 3)，6个
不同甜叶菊品种中，各基因的相对表达量存在显著
差异。其中，UGT85C2 基因的相对表达量以 LY最
低，为 1.00，JL最高，达 2.31；UGT91D2m基因的相对
表达量以 Tx最低，为 1.00，ST3最高，达 2.57；UGT76G1
基因的相对表达量以 TX最低，为 1.00，JL最高，达
1.93，且呈增加趋势。
1.3不同甜叶菊品种 RA含量分析
利用 HPLC方法对不同品种甜叶菊 RA含量的
1804
甜叶菊甜菊醇糖苷生物合成关键酶基因表达量与莱宝迪苷 A含量的相关关系
Correlation between Key Enzyme-encoding Genes and RA Content in SGs Biosynthesis of Stevia
图 4 6个不同甜叶菊品种中 RA含量
注: 1:同心; 2:绿源; 3:守田 2号; 4:中山; 5:守田 3号; 6:菊隆
Figure 4 RA contents in six different stevia cultivars
Note: 1: TX; 2: LY; 3: ST2; 4: ZS; 5: ST3; 6: JL
测定结果显示，每 100 mg甜叶菊干叶中，TX的 RA
含量最少，仅 1.32 mg；JL的 RA含量最高，为 4.6 mg
(图 4)；与 UGT76G1基因在不同甜叶菊品种中的相
对表达量比较，RA含量的变化趋势与 UGT76G1 基
因表达趋势相符。
1.4 UGT85C2、UGT91D2m和 UGT76G1基因相对表
达量与 RA含量的相关分析
进一步采用回归分析法对三个基因的相对表达
量与 RA含量进行相关分析，利用渐近回归模型进
行拟合，获得回归方程。经检验发现，RA含量与
UGT76G1表达量的线性相关系数 R2=0.783 3，相关关
系极显著(P=0.000 8)。而 RA 含量与 UGT85C2 和
UGT91D2m的相对表达量均无显著相关关系(表 2)。
2讨论
关键酶基因的表达是植物次生代谢产物积累的
决定因素，现代生物学技术通常考虑通过提高关键
酶基因的表达量作为分子育种的手段，提高目的次
生代谢产物的产量。
甜菊醇是多种甜叶菊甜菊醇糖苷合成的前体，
在 UGT85C2 的催化作用下，生成第一个糖苷，即甜
菊醇单糖苷，从而开启了多种甜叶菊甜菊醇糖苷的
合成(图 1)。UGT85C2基因位于多种甜菊醇糖苷生物
合成的上游，其表达量不仅影响到 RA的积累，还影
响到其他支路化合物的生物合成。Guleria等(2014)
的研究发现，UGT85C2基因在拟南芥中的过表达还
影响了赤霉素和叶绿素的合成。UGT91D2m被报道
在体外试验(Kishore et al., 2011, http://www.freepaten
tsonline.com/WO2015065650.html)中能以甜菊醇单糖
苷为底物合成甜菊醇双糖苷，而甜菊醇双糖苷不仅是
RA的前体物，也是其它糖苷的合成前前体，目前对于
UGT91D2m基因在甜叶菊中的功能还不是很清楚，因
此该基因的表达量是否能够直接影响 RA的积累还
未可知。本研究分析发现，UGT85C2、UGT91D2m基因
的表达量与 RA含量积累没有显著的相关关系，可
能是因为它们位于 RA合成途径的上游，同时牵涉
到邻近几条支路的化合物积累，影响比较分散。
而 UGT76G1 作为 RA合成途径中最后一个酶
基因，直接作用着 RA 的积累。Guleria 和 Yadav
(2013)利用农杆菌介导的瞬时 RNAi干扰研究了甜
叶菊 UGTs (UGT85C2 和 UGT76G1)基因的功能，在
转基因沉默系中，UGT76G1的沉默使得甜叶菊糖苷
含量减少得最多；其编码的酶与底物(甜菊醇 19葡糖
苷和甜茶糖苷)亲和力的分析表明，UGT76G1与底物
有很高的亲和性，该亲和力可能是决定甜叶菊 RA
含量高低的主要影响因子，因为 UGT76G1与底物的
高亲和力可促使支路中 RA 合成的前体物质的形
成，进而促进 RA的合成。本研究经实时荧光定量
RT-PCR检测得到的基因表达量与 6个品种的 RA
含量进行相关性分析，结果表明，UGT76G1的表达量
与 RA的积累存在极显著的相关性，这一结果与 Gu-
leria等(2014)的推测相符。
由此可见，UGT76G1 表达量较 UGT85C2 及
UGT91D2m对甜叶菊莱宝迪苷 A的合成起到更为重
要的作用。今后可望通过基因工程手段人为调控
UGT76G1表达量达到提高 RA的含量，改善甜叶菊
糖苷品质的目的。
表 2甜叶菊 UGT85C2、UGT91D2m和 UGT76G1基因相对表达量与 RA含量的相关分析
Table 2 Analysis of correlation between UGT85C2, UGT91D2m, UGT76G1 gene relative transcript level and RA content
回归方程
Regression equation
Y(76G1)=1.376 6+0.000 013*EXP (6.404 4*X)
Y(85C2))=1.368 8+0.000 531*EXP (3.560 5*X)
Y(91D2m))=1.277 7+0.006 850*EXP (2.176 4*X)
相关系数(R2)
Correlation coefficient (R2)
0.995 7
0.523 0
0.421 5
显著性检验(p)
Significance test (p)
0.000 8**
0.329 4
0.440 1
注: **:在 0.01水平上显著相关
Note: **: Significantly correlation in 0.01 level
1805
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
3材料与方法
3.1实验材料
6个不同品种分别为同心(TX)、绿源(LY)、守田
2号(ST2)、中山(ZS)、守田 3号(ST3)、菊隆(JL)，都为
我国目前种植品种。现种植于宁夏大学生命科学学
院组培室，光照为 16 h，温度 25℃，相对湿度 60%。
取甜叶菊第 3、第 4对叶为实验材料，每个品种取 3
株作为重复。
3.2甜叶菊总 RNA提取及标准线样品的制备
不同品种不同单株的甜叶菊叶子的总 RNA提
取采用 RNAprep Pure多糖多酚植物总 RNA提取试
剂盒(DP441, 天根生化科技)以及试剂盒提供的方
法；在 RNA提取过程中，利用 RNase-Free DNase玉
(RT411,天根生化科技)去除样品中 DNA污染。各
RNA 浓度及质量用超微量分光光度计 (NaroDrop
2000,美国 Thermo Fisher Scientific)检测。用 1%琼脂
糖凝胶电泳检测 RNA完整性。
每个样品分别取出部分 RNA混合，用 RNase-F-
ree双蒸水调整成 400 ng/滋L的 RNA溶液 100 滋L。
然后按 4倍稀释，配制 6份作为标准线用的 RNA溶
液，浓度为 1/2、1/4、1/16、1/64、1/256和 1/1 024。
3.3 cDNA第一链的合成
反转录合成 cDNA 第一条链采用 TransScript
One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super-
Mix试剂盒(AT311-03,全式金)以及试剂盒提供的
方法。每份待测样品以及 6份作为标准线用的样品
(总RNA)，分别加入到每份反应液中反转录合成 cDNA
第一条链。
3.4引物设计
根据 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布
的甜叶菊 UGT85C2(AY345978)、UGT91D2m (EU751-
291)和 UGT76G1 (AY345974)基因以及作为内参基因
EF1琢 (AY157315)的 mRNA 序列，利用 Primer Ex-
press 3.0 (美国 Applied Biosystems)设计实时荧光定
量用 RT-PCR引物(表 1)。引物均由上海 Invitrogen公
司合成。
3.5实时荧光定量 RT-PCR分析
根据 TransStart Tip Green qPCR SuperMix (AQ-
141-02,全式金) 试剂盒提供的方法配制 PCR反应
液，使用的荧光染料为 SYBR green玉。每份待测样品
以及 6份作为标准线用的样品(cDNA)，均作为模板，
加入到每份反应液中。未加 cDNA模板的为空白对
照(NTC)。PCR反应在 BIO-RAD iQ5荧光定量 PCR
仪(美国 Bio-Rad)上进行，扩增反应条件为：94℃预变
性 30 s，94℃ 5 s、60℃ 15 s、72℃ 30 s，40个循环。
实时荧光定量 RT-PCR结束后，根据程序给定
的本底基准线 PCR Baseline Subtracted (PCR增殖达
对数阶段)，从扩增曲线上读取每个样本每个基因的
循环阈值 Ct (Threshold cycle)，然后根据标准线，获
得每个样本每个基因的起始质量 SQ 值 (Starting
quantity)。通过目的基因与内参基因 SQ的比值，相对
定量计算出每个样本每个基因的起始质量(视为基因
的相对表达量)和标准差。
3.6甜叶菊莱宝迪苷 A含量的测定
不同品种不同单株的甜叶菊叶子的 RA提取参
照文献(Yang et al., 2015)。RA 标准品纯度逸98%
(189-02581,日本Wako Pure Chemical)。含量分析采
用 HPLC (LC-20A, 日本 Shimadzu)方法，Zorbax-N-
H2 (250.0 mm伊4.6 mm, 5 滋m)为色谱柱，流动相为乙
腈：水(80:20, 体积比)，流速为 0.8 mL/min，柱温为
30℃，紫外检测器波长为 210 nm，进样量 10滋L。
3.7数据统计分析
运用 DPS14.5数据处理系统对甜叶菊不同品种
的 RA含量以及每个基因的相对表达量数据进行相
关分析。
作者贡献
张虹和张芮是本研究的实验设计和实验研究
的执行人；张虹完成数据分析，论文初稿的写作；薄
玉瑶和刘祥参与试验结果分析；张自萍参与论文修
改；陈任是项目的构思者及负责人，指导实验设计，
数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同
意最终的文本。
致谢
本研究由宁夏大学引进人才科研启动经费(020-
80020131)和宁夏回族自治区科技支撑计划项目(413-
0396)共同资助。
参考文献
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