全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１３（２２）：１１４～１１９
第一作者简介：李娜（１９８８－），女，硕士研究生，现主要从事林木遗
传育种学研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：６５７８７４４３２＠ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：张存旭（１９６１－），男，博士，副教授，硕士生导师，现主要从
事林木遗传育种学研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｘｚｈａｎｇ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ．
基金项目：国家林业公益性行业专项资助项目（２００８０４０１０）；陕西
省教育厅科研计划资助项目（０６ＪＫ１５３）。
收稿日期：２０１３－０６－１９
毛梾ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立
李 　 娜，张 存 旭，刘 　 伟，宋 利 伟，王 　 豪，杨 　 玲
（西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌７１２１００）
　　摘　要：以毛梾叶片为试材，通过单因素２次循环试验对毛梾ＩＳＳＲ反应体系进行优化，建立
了毛梾ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的最佳反应体系和扩增程序。结果表明：ＰＣＲ反应体系总体积为２５μＬ，其
中１０×Ｂｕｆｅｒ　２．５μＬ，模板ＤＮＡ用量５０ｎｇ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量１．５Ｕ，Ｍｇ
２＋浓度２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，引
物浓度０．６μｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ浓度０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ；扩增程序：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性５０ｓ，
４８．８～５９．１℃退火６０ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，３８个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。在此基础上，从１００条
ＩＳＳＲ通用引物中筛选出１７条多态性好、稳定性高的引物，并优化了它们的退火温度。这一优化体
系的建立，为开展毛梾种质资源鉴定、遗传多样性及分子育种方面的研究提供了技术依据和参考。
关键词：毛梾；ＩＳＳＲ；单因素２次循环试验；体系优化；引物筛选
中图分类号：Ｓ　７９２．９９　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１３）２２－０１０４－０６
　　毛梾（Ｃｏｒｎｕｓ　ｗａｔｅｒｉ）属山茱萸科梾木属落叶乔木或
灌木，又名车梁木、油树，既是我国重要的优良用材树
种，也是产区很有开发潜力的油料树种，其果实含油量
高达３４％，其油既可食用，又可作为生物柴油理想的原
料，可见毛梾是极具发展前景的食用和工业用油料树
种，具有较高的经济及科研价值［１］。现国内外对毛梾的
研究相对较少，其多种价值尚未开发利用，到目前为止，
关于毛梾的研究主要集中在生物学特性［２］、种子繁殖及
栽培技术［３］等宏观方面，利用ＩＳＳＲ标记技术对毛梾的
相关研究国内外尚鲜见报道。
ＩＳＳＲ（Ｉｎｔｅｒ　Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｐｅａｔ）又称简单序列
重复区间扩增，是由Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等［４］改造创建的一种新
型分子标记技术。该标记技术与其它分子标记技术相
比，具有试验过程更为简单、快速，多态性和重复性高，
所需ＤＮＡ量少，无需知道基因组序列且成本较低等优
点，现多用于林木遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传
图谱构建、基因定位［５－７］等的研究。由于ＩＳＳＲ标记与
ＲＡＰＤ标记一样，是一种基于聚合酶链式反应的分子标
记，其扩增反应易受到各组分浓度及ＰＣＲ扩增程序的影
响且具有物种特异性，因此有必要对毛梾ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反
应体系及扩增程序中的主要影响因子进行系统优化，以
确保试验分析的准确性。目前，对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系
进行优化多采用单因素单循环设计或正交实验设计［８］，
采用单因素２次或２次以上循环设计进行ＩＳＳＲ反应条
件优化鲜见报道。该研究采用单因素２次循环试验，优
化出毛梾ＩＳＳＲ的最佳反应体系和扩增程序，在此基础
上，筛选出适合毛梾ＩＳＳＲ分析的有效引物并优化其退
火温度，以期为进一步利用ＩＳＳＲ标记技术进行毛梾种
质资源遗传多样性、分子鉴定、分子标记辅助育种和基
因定位等研究提供技术依据和参考。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试毛梾采自西北农林科技大学林学院苗圃试验
地，于２０１２年４月末从毛梾健康植株上采摘幼叶，将其
分别放入装有硅胶的密封袋中，做好标记，带回贮于超
低温冰箱中备用。
试剂与仪器：试验所用引物购自上海生物工程公
司，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、
ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ均购自ＴａＫａＲａ公司；所用仪器有Ｂｉｏ－
ＲＡＤ　Ｍｙ　ｃｙｃｌｅｒＴＭｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　ＰＣＲ扩增仪（美国），Ｂｉｏ－
ＲＡＤ　Ｐｏｗｅｒｐａｃ　Ｂａｓｉｃ－０４１ＢＲ电泳仪（美国）和ＤＹＹ－１２型
电泳槽（北京六一仪器厂），Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ核
酸蛋白测定仪（德国），Ｂｉｏ－ＲＡＤ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＨｏｏｄⅡ凝胶成
像系统（美国）。
１．２　试验方法
１．２．１　基因组ＤＮＡ的提取　基因组ＤＮＡ的提取参照
李昌珠等［９］的方法，用核酸蛋白测定仪测定ＤＮＡ的浓
度和纯度，用超纯水将 ＤＮＡ统一稀释至２０ｎｇ／μＬ，
－２０℃保存备用。
１．２．２　ＩＳＳＲ扩增反应条件优化　在ＩＳＳＲ经典扩增方
案的基础上，将李昌珠等［９］的扩增程序和反应体系构成
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北方园艺２０１３（２２）：１１４～１１９ ·生物技术·
设定为该试验的原初反应程序和原初反应体系，经过初
步的引物筛选，选用引物ＵＢＣ８５５作为此反应体系优化
试验的固定引物，根据ＩＳＳＲ体系优化的相关文献及预
备试验的结果，反应体系中各因素处理水平见表１。
ＰＣＲ产物在２％的琼脂糖凝胶上以１００Ｖ电压进行电泳
分离，ＥＢ染色显带，凝胶成像系统下观察，拍照。
表１　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的处理因素与水平
　　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
因素Ｆａｃｔｏｒ 水平Ｌｅｖｅｌ
模板ＤＮＡ用量／ｎｇ　 １０、２０、３０、４０、５０、６０、７０
ｄＮＴＰｓ浓度／ｍｍｏｌ·Ｌ－１　 ０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０
Ｍｇ２＋浓度／ｍｍｏｌ·Ｌ－１　 １．０、１．５、２．０、２．５、３．０
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量／Ｕ　 ０．５０、１．００、１．５０、１．７５、２．００
引物浓度／μｍｏｌ·Ｌ－１　 ０．２、０．４、０．６、０．８、１．０
退火温度／℃ ４８．０、４８．８、５０．３、５２．４、５５．３、５７．６、５９．１、６０．０
循环次数／次 ３０、３２、３５、３８、４０、４３、４５
退火时间／ｓ　 ３０、４５、６０
２　结果与分析
２．１　模板ＤＮＡ用量优化
由图１可知，当模板ＤＮＡ用量为１０、２０ｎｇ时扩增
出的条带较少，当其用量为３０～７０ｎｇ时，能扩增出数量
大致相同的条带，说明毛梾ＩＳＳＲ反应对模板ＤＮＡ用量
不敏感，模板用量许可范围较大，但当模板用量为４０ｎｇ
时条带最清晰。
图１　模板ＤＮＡ用量对ＩＳＳＲ扩增的影响
注：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～７分别表示１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０ｎｇ
（２５μＬ）的ＤＮＡ用量。
Ｆｉｇ．１　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｎ　ＩＳＳＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～７ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　１０，２０，
３０，４０，５０，６０，７０ｎｇ（２５μＬ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
２．２　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量优化
由图２可见，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量过低时，无条带
产生，随着用量的增加，条带增加、变亮，当酶用量为
１．００Ｕ和１．５０Ｕ时，扩增谱带清晰、稳定且扩增效果无
明显差别，为节约成本，在确保试验结果稳定的前提下，
选用较低的用量１．００Ｕ。
２．３　Ｍｇ２＋浓度优化
由图３可见，当 Ｍｇ２＋浓度为１．０ｍｍｏｌ／Ｌ时，未扩
增出条带；随着 Ｍｇ２＋浓度的增加，有扩增产物出现，但
相应的条带少且弱；当 Ｍｇ２＋浓度为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，条
图２　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶浓度对ＩＳＳＲ扩增的影响
注：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～５分别表示０．５０、１．００、１．５０、１．７５、
２．００Ｕ（２５μＬ）的Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量。
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｏｎ　ＩＳＳＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～５ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
０．５０，１．００，１．５０，１．７５，２．００Ｕ（２５μＬ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
带数量较多，清晰稳定，效果最好；而当 Ｍｇ２＋浓度继续
增加至３．０ｍｍｏｌ／Ｌ时，非特异性条带增加，条带变弱，
不清晰。因此，确定２．５ｍｍｏｌ／Ｌ为Ｍｇ２＋的最适浓度。
图３　Ｍｇ２＋浓度对ＩＳＳＲ扩增的影响
注：Ｍ：ＤＬ　２　０００ Ｍａｒｋｅｒ；１～５分别表示１．０、１．５、２．０、２．５、
３．０ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｍｇ２＋浓度。
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ＩＳＳＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～５ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　Ｍｇ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
１．０，１．５，２．０，２．５，３．０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
２．４　引物浓度优化
由图４可见，当引物浓度在０．２～０．６μｍｏｌ／Ｌ时，
扩增不完全，电泳条带较少且不清晰；当引物浓度为
１．０μｍｏｌ／Ｌ时，非特异性条带增加，扩增条带减弱变暗，
模糊不清；以扩增条带的多少、强弱以及带型的清晰度、
稳定性为标准，故确定０．８μｍｏｌ／Ｌ为最适引物浓度。
２．５　ｄＮＴＰｓ浓度优化
由图５可见，当ｄＮＴＰ浓度过低，在０．１～０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
之间时，扩增条带数量少且趋于弱化；当ｄＮＴＰ浓度过
高，在０．３～０．４ｍｍｏｌ／Ｌ时，扩增出的条带数并未增加，
反而明显减少，有缺失现象，不易辨认；而当ｄＮＴＰ浓度
０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ时，扩增效率最高，条带最亮。
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·生物技术· 北方园艺２０１３（２２）：１１４～１１９
图４　引物浓度对ＩＳＳＲ扩增的影响
注：Ｍ：ＤＬ　２　０００ Ｍａｒｋｅｒ；１～５分别表示０．２、０．４、０．６、０．８、
１．０μｍｏｌ／Ｌ的引物浓度。
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ＩＳＳＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～５ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
０．２，０．４，０．６，０．８，１．０μｍｏｌ／Ｌ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图５　ｄＮＴＰｓ浓度对ＩＳＳＲ扩增的影响
注：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～７分别表示０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、
０．３５、０．４０ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ浓度。
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄＮＴＰｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ＩＳＳＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ＤＬ　２　０００ Ｍａｒｋｅｒ；１～７ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｄＮＴＰｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
０．１０，０．１５，０．２０，０．２５，０．３０，０．３５，０．４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
２．６　退火时间优化
由图６可见，退火时间为３０、４５ｓ时扩增条带黯淡，
而退火时间为６０ｓ时条带较亮，扩增效果最好。故最佳
退火时间为６０ｓ。
２．７　循环次数优化
ＰＣＲ循环次数决定着扩增程度，次数太少，ＰＣＲ产
物量极低；次数过多，超过最适值后，会增加非特异性扩
增产物的数量和复杂性。该试验设置了７个不同循环
次数，从图７可以看出，在３８次循环条件下，扩增的条带
清晰可辨，强弱合适，多态性最好。
２．８　退火温度优化
在确定反应体系的基础上，该试验采用梯度ＰＣＲ
模式，确定ＵＢＣ－８５５的最佳退火温度，根据引物给定的
Ｔｍ 值设定温度范围４８～６０℃，ＰＣＲ仪自动产生８个温
度梯度：４８．０、４８．８、５０．３、５２．４、５５．３、５７．６、５９．１、６０．０℃。
图８结果显示，退火温度对毛梾ＩＳＳＲ扩增效果有显著
图６　退火时间对ＩＳＳＲ扩增的影响
注：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～３分别表示退火时间为３０、４５、６０ｓ。
Ｆｉｇ．６　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ＩＳＳＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～３ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｉｍｅ　３０，４５，６０ｓ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图７　循环次数对ＩＳＳＲ扩增的影响
注：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～７分别表示循环次数为３０、３２、３５、３８、
４０、４３、４５次。
Ｆｉｇ．７　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｎ　ＩＳＳＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～７ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　３０，３２，３５，
３８，４０，４３，４５ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图８　退火温度对ＩＳＳＲ扩增的影响
注：Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１～８分别表示退火温度为４８．０、４８．８、
５０．３、５２．４、５５．３、５７．６、５９．１、６０．０℃。
Ｆｉｇ．８　Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ＩＳＳＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｎｏｔｅ：Ｍ：ＤＬ　２　０００ Ｍａｒｋｅｒ；１～８ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
４８．０，４８．８，５０．３，５２．４，５５．３，５７．６，５９．１，６０．０℃ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
６１１
北方园艺２０１３（２２）：１１４～１１９ ·生物技术·
影响，当退火温度低于５２．４℃时，扩增出的条带模糊，主
带不够清晰；随着温度的升高，扩增特异性增强，但当提
高退火温度至５７．６℃以上，扩增条带数明显减少，而当
退火温度为５５．３℃时，谱带最清晰，效果最好。
２．９　交互作用对ＩＳＳＲ扩增结果的影响
该研究通过单因素２次循环试验来检验相关反应
因素间的交互作用是否对ＩＳＳＲ扩增结果产生影响，
图１～８为第１次循环，图９为第２次循环。由图１～９前
后２次循环可以看出，各反应因素间交互作用明显。因
此，为排除交互作用对试验的影响，该试验的最终结果
应与第２次循环所得出的结论一致。
图９　ＩＳＳＲ反应条件第２次循环优化
注：Ａ：模板ＤＮＡ用量；Ｂ：Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量；Ｃ：Ｍｇ２＋浓度；Ｄ：引物浓度；Ｅ：ｄＮＴＰｓ浓度；Ｆ：退火时间；Ｇ：循环次数；Ｈ：退火温度。
Ｆｉｇ．９　Ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｎ　ＩＳＳＲ
Ｎｏｔｅ：Ａ：Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ｑｕａｎｔｉｔｙ；Ｂ：Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｑｕａｎｔｉｔｙ；Ｃ：Ｍｇ２＋ｃｏｎｔｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｄ：Ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｎｔｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｅ：ｄＮＴＰｓ　ｃｏｎｔｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｆ：Ａｎｎｅａ－
ｌｉｎｇ　ｔｉｍｅ；Ｇ：Ｃｙｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ；Ｈ：Ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．
２．１０　反应体系和扩增程序的建立
该试验采用单因素２次循环试验设计，表明毛梾
ＩＳＳＲ最佳反应体系是：ＰＣＲ反应体系总体积为２５μＬ，
其中１０×Ｂｕｆｅｒ　２．５μＬ，模板ＤＮＡ用量５０ｎｇ，Ｔａｑ　ＤＮＡ
聚合酶用量１．５Ｕ，Ｍｇ２＋浓度２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，引物浓度
０．６μｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ浓度０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ；毛梾ＩＳＳＲ最佳
扩增程序：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性５０ｓ，４８．８～
５９．１℃（退火温度随引物不同而设定）退火６０ｓ，７２℃延
伸１．５ｍｉｎ，３８个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
２．１１　ＩＳＳＲ引物的筛选
利用已确定的反应体系和扩增程序，用３个不同的
毛梾ＤＮＡ模板经初筛、复筛从１００条ＩＳＳＲ引物中筛选
出１７条扩增带型清晰、多态性高、特异性强的引物，同时
采用梯度ＰＣＲ模式，对这些引物的退火温度进行优化，
优化方法同２．８，引物筛选与其退火温度的优化结合进
行，结果发现不同引物具有不同的最佳退火温度，最终
筛选出的引物及其各自最适退火温度见表２。
表２　筛选出的有效引物及其最佳退火温度
　　Ｔａｂｌｅ　２ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′～３′）
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ／℃
ＵＢＣ－８０７ ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＴ　 ５２．４
ＵＢＣ－８１２ ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡ　 ５０．３
ＵＢＣ－８１３ ＣＴＣ　ＴＣＴ　ＣＴＣ　ＴＣＴ　ＣＴＣ　ＴＴ　 ５７．６
ＵＢＣ－８２５ ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＴ　 ５７．６
ＵＢＣ－８２６ ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＣ　 ５５．３
ＵＢＣ－８３４ ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＹＴ　 ５５．３
ＵＢＣ－８３５ ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＹＣ　 ５２．４
ＵＢＣ－８３６ ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＹＡ　 ５７．６
ＵＢＣ－８４０ ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＹＴ　 ５２．４
ＵＢＣ－８４２ ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＹＧ　 ５７．６
ＵＢＣ－８４４ ＣＴＣ　ＴＣＴ　ＣＴＣ　ＴＣＴ　ＣＴＣ　ＴＲＣ　 ５５．３
ＵＢＣ－８４８ ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＲＧ　 ４８．８
ＵＢＣ－８５５ ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＹＴ　 ５５．３
ＵＢＣ－８６８ ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　 ５０．３
ＵＢＣ－８８０ ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　 ５０．３
ＵＢＣ－８９５ ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＡＧＣ　ＴＣＴ　ＴＧＡ　ＴＣ　 ５５．３
ＵＢＣ－８９９ ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＴＧＴ　ＴＣＣＡ　 ５９．１
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３　结论与讨论
任耀忠等［８］已成功利用单因素２次循环试验设计
对栓皮栎ＲＡＰＤ反应条件进行优化，结果表明单因素
２次循环试验设计也同样适用于毛梾ＩＳＳＲ反应体系
的优化，最终优化的毛梾ＩＳＳＲ反应体系是：２５μＬ反
应体系中含有１０×Ｂｕｆｅｒ　２．５μＬ，模板 ＤＮＡ用量
５０ｎｇ，Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚 合 酶 用 量 １．５ Ｕ，Ｍｇ２＋ 浓 度
２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，引物 浓 度 ０．６μｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ浓度
０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ；最佳扩增程序：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变
性５０ｓ，４８．８～５９．１℃（退火温度随引物不同而设定）
退火６０ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，３８个循环；最后７２℃延伸
１０ｍｉｎ。利用优化的反应体系和扩增程序，从１００条
ＩＳＳＲ通用引物中筛选出１７条多态性好、稳定性高的有
效引物，并优化了它们的退火温度，这为进一步利用
ＩＳＳＲ分子标记技术开展对毛梾的相关研究奠定了基础。
ＩＳＳＲ反应体系中，关键是调节Ｍｇ２＋浓度、引物浓度、
ｄＮＴＰｓ浓度。Ｍｇ２＋是Ｔａｑ　ＤＮＡ酶的激活剂，它通过影响
Ｔａｑ　ＤＮＡ酶的活性从而显著地影响ＰＣＲ扩增；Ｍｇ２＋浓度
过低，Ｔａｑ　ＤＮＡ酶活力显著降低，甚至不能扩增出条带；
Ｍｇ２＋浓度过高则会使引物的错配频率增加，导致非特异
性扩增，使其背景模糊、条带弥散［１０］。引物浓度的变化实
质上是改变了引物和模板配对的几率，进而影响扩增结
果；浓度过低，导致引物和模板的结合率降低，不能进行有
效扩增，扩增不出条带或条带较弱；浓度过高，会引起碱基
错配和非特异性扩增，引物二聚体形成的几率也会增大，
导致条带出现弥散［１１］。ｄＮＴＰｓ作为ＰＣＲ反应的原料，参
与新链ＤＮＡ的合成，其用量取决于扩增片段的长度；此
外，ｄＮＴＰｓ浓度的大小直接关系到扩增产物量的多少，适
宜的ｄＮＴＰ浓度对获得理想的扩增结果尤为重要，浓度过
低会影响合成效率，则产率降低，甚至使产物单链化，扩增
条带少、弱，不易辨认；而高浓度的ｄＮＴＰｓ易产生错误掺
入，导致某些片段可能扩增不出产物，条带变少且模糊不
清［１２］。另外，该研究结果表明，毛梾的ＩＳＳＲ反应体系对
模板ＤＮＡ用量的变化不敏感，这与郭凌飞等［１３］报道的研
究结果一致。ＩＳＳＲ扩增程序中，退火温度对反应的影响
较大，退火温度随引物和试验材料的不同而不同，因而确
定合适的退火温度至关重要。温度过低时，产物特异性
差；温度过高时，扩增条带明显减少甚至无条带［１２］。适宜
的退火温度能够提高ＰＣＲ反应的特异性，因此，退火温度
的梯度试验是非常有必要的。
目前，ＩＳＳＲ反应体系的建立大多采用单因素单循
环试验方法，这样会忽视各因素之间的交互效应，由该
研究的第２次循环试验可知，各因素间的交互作用明
显，为兼顾到各因素间的交互作用，采用单因素２次循
环试验设计是进行ＩＳＳＲ反应条件优化较为科学合理的
方法。此外，也可采用正交设计、均匀设计等方法，其可
行性已有报道。该试验首次运用单因素２次循环试验
设计进行ＩＳＳＲ反应体系的优化，其可行性已得到验证，
这为今后其它物种ＩＳＳＲ体系优化的相关研究提供新方
法、新思路。试验过程中，引物的筛选及对各环节的效
果检测都表明最终优化的体系适合毛梾的ＩＳＳＲ分析。
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ＬＩ　Ｎａ，ＺＨＡＮＧ　Ｃｕｎ－ｘｕ，ＬＩＵ　Ｗｅｉ，ＳＯＮＧ　Ｌｉ－ｗｅｉ，ＷＡＮＧ　Ｈａｏ，ＹＡＮＧ　Ｌｉｎｇ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００）
８１１
北方园艺２０１３（２２）：１１９～１２１ ·植物保护·
第一作者简介：周雷（１９８９－），男，湖北宜昌人，硕士研究生，研究方
向为昆虫生态。
责任作者：王香萍（１９７５－），女，湖北钟祥人，博士，教授，现主要从
事植物保护教学与科研工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇ．ｘｉａｎｇ．ｐｉｎｇ＠
１２６．ｃｏｍ．
基金项目：湖北省教育厅资助项目（Ｄ２０１０１３０５）。
收稿日期：２０１３－０６－１７
江汉平原蔬菜地频振灯下昆虫群落多样性研究
周 　 雷１，王 　 玲２，雷 小 涛１，陈 光 然１，王 香 萍１
（１．长江大学 农学院，湖北 荆州４３４０２５；２．湖北省荆州市植保站，湖北 荆州４３４０２０）
　　摘　要：在江汉平原荆州郊区露地蔬菜田，应用佳多牌频振式杀虫灯对蔬菜昆虫进行了２ａ
诱杀试验，以明确蔬菜田诱杀的昆虫群落的结构及多样性情况。结果表明：频振灯诱杀的类群较
多，在不同年份之间波动差异不大，在同一年份不同月份之间波动变化较大。丰富度在高峰时约
为５０余种，但是其中鞘翅目和鳞翅目在其中所占比例较大，多样性在２．０～４．０之间波动，优势集
中性指数在０．０５～０．５０之间波动，均匀性指数在０．３～０．８之间波动。根据诱捕结果判断害虫发
生高峰时间，可以为害虫的监测与防治提供帮助。
关键词：频振式杀虫灯；蔬菜；昆虫；诱杀；多样性
中图分类号：Ｓ　４３６．３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１３）２２－０１１９－０３
　　频振式杀虫灯是利用频振波诱集各种趋光、趋波性
强的害虫，以电网触杀的一种灭虫器械。据报道，使用
频振灯对蔬菜害虫进行监测、预测预报以及对某些主要
害虫进行防治，其使用效果较单一波段的灯好［１－６］。
荆州地处江汉平原腹地，夏秋季节温度高，害虫猖
獗，蔬菜生产用药频繁，害虫极易产生抗药性，致使施药
次数不断增加，对蔬菜的安全使用威胁很大。因此，在
蔬菜生产中更应该遵循绿色生产的概念，为安全使用蔬
菜提供保证。该试验于２００９～２０１０年在江汉平原蔬菜
地使用频振式杀虫灯对诱杀的昆虫类群进行研究，以期
　　　　
了解其在江汉平原蔬菜地诱杀的主要类群，进一步为蔬
菜地害虫的绿色防治提供帮助和依据。
１　材料与方法
１．１　试验材料
频振式杀虫灯（佳多牌ＰＳ－１５Ⅱ型频振式杀虫灯，河
南省汤阴县佳多科工贸有限公司生产）。试管、镊子、昆
虫体视镜、解剖针、试验记录专用笔和纸。试验田为蔬
菜田，主要为番茄、黄瓜、豆角及十字花科蔬菜。
１．２　试验方法
试验在湖北省荆州市荆州区郊区荆西村蔬菜基地
进行。２００９年从６月挂灯开始至１１月每３ｄ取１次虫，
２０１０年从５月开始挂灯至１０月每２ｄ取１次虫，每天晚
上１９：００开灯，次日６：００关灯，小雨天气可正常开灯，遇
大风雷雨天气不开灯。将诱杀的昆虫带回实验室进行
鉴定分类，并记录好昆虫的种类、数量。至诱虫量较少
后结束试验。
频振灯安装时确定好架灯位置后栽２根木桩或三
　　　　
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｎｕｓ　ｗａｌｔｅｒｉ　ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ＩＳＳＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｎｕｓ　ｗａｌｔｅｒｉ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｙ　ｖｉａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｗｉｔｈ　ｔｗｏ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｔｅｓｔｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ＩＳＳＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｉｎｇ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｎｕｓ　ｗａｌｔｅｒｉ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ＩＳＳＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ａ　ｔｏｔａｌ
ｖｏｌｕｍｅ　２５μＬ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　２．５μＬ　１０×Ｂｕｆｅｒ，５０ｎｇ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ，１．５ＵＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，２．０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，
０．６μｍｏｌ／Ｌ　ｐｒｉｍｅｒ，０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ．Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｏｗｓ：ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　５ｍｉｎ　ａｔ　９４℃；
３８ｃｙｃｌｅｓ　ｏｆ　５０ｓａｔ　９４℃，６０ｓａｔ　４８．８～５９．１℃，１．５ｍｉｎ　ａｔ　７２℃；ａｎｄ　ａ　ｆｉｎａｌ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｏｆ　１０ｍｉｎ　ａｔ　７２℃ａｔ　ｔｈｅ　ｅｎｄ　ｏｆ　ｔｈｅ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，１７ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ
ｏｕｔ　ｆｒｏｍ　１００ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ．Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｆｕｒｔｈｅｒ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ａｓ　ａ　ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｍａｙ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｂａｓｅ　ａｎｄ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｏｒｎｕｓ　ｗａｌｔｅｒ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｎｕｓ　ｗａｌｔｅｒｉ；ＩＳＳＲ；ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｗｉｔｈ　ｔｗｏ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｔｅｓｔｓ；ｓｙｓｔｅｍ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｐｒｉｍｅｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
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