全 文 ：遗传 Hereditas (Beijing) 2016 8 , 38(8): 756―764
www.chinagene.cn 研究报告
收稿日期: 20160104; 修回日期: 20160216
基金项目: 国家自然科学基金项目(编号：31170211)和浙江省科技计划项目(编号：2012C12902)资助[Supported by the National Natural Science Foun-
dation of China (No. 31170211) and Science and Technology Research Projects of Zhejiang Province(No. 2012C12902)]
作者简介: 刘丁源，硕士研究生，专业方向：遗传学。E-mail: dingyuan0726@126.com
通讯作者: 王君晖，副教授，研究方向：遗传学。E-mail: junhuiwang@zju.edu.cn
DOI: 10.16288/j.yczz.16-002
网络出版时间: 2016/5/12 10:40:47
URI: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20160512.1040.002.html
快速构建多重 sgRNA载体利用CRISPR/Cas9技术敲除
拟南芥 IAA2基因
刘丁源，邱婷，丁晓辉，李苗苗，朱睦元，王君晖
浙江大学生命科学学院，杭州 310058
IAA2(Indole Acetic Acid 2)是拟南芥 Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员，目前还没有它的突变体的报道，
阻碍了对其功能和作用机制的深入研究。在 CRISPR/Cas9基因组编辑技术中，1个 sgRNA只能靶向基因的 1个位点，
有时基因敲除的效率并不高。为了提高敲除效率，本文在 Golden-Gate 克隆技术的基础上，通过两轮 PCR 扩增，将
每 3个 sgRNA串联到同 1个入门载体中，再将入门载体与含 Cas9表达框的目标载体 LR反应，获得最终的表达载体。
结果表明，设计的 6个 sgRNA有 4个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变。与
单个 sgRNA相比，多重 sgRNA的基因敲除效率高、种系突变多；与其他构建多重 sgRNA载体的方法相比，本方法
具有快速、高效等优点。本文所得到的 5个突变体为后续的 IAA2功能研究提供了良好的材料。
CRISPR/Cas9；多重 sgRNA串联；基因组编辑；IAA2基因
Rapid construction of multiple sgRNA vectors and knockout of the Ar-
abidopsis IAA2 gene using the CRISPR/Cas9 genomic editing
technology
Dingyuan Liu, Ting Qiu, Xiaohui Ding, Miaomiao Li, Muyuan Zhu, Junhui Wang
College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
Abstract: IAA2 is a member of the Aux/IAA auxin responsive gene family in Arabidopsis thaliana. No iaa2 mutant
has been reported until now, thus hindering its further mechanistic investigations. The normal genomic editing technology
of CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) uses only a sin-
gle guide RNA (sgRNA) to target one site in a specific gene, and the gene knockout efficiency is not high. Instead, multiple
sgRNAs can target multiple sites; therefore, the efficiency may be improved. In the present investigation, we used the gold-
en-gate cloning strategy and two rounds of PCR reactions to combine three sgRNAs in the same entry vector. The final
expression vector was obtained by LR reactions with the destination vector containing the Cas9 expression cassette. Four
out of the six sgRNAs were effective, and we also obtained a lot of insertion and deletion mutations. Compared with one
sgRNA approach, multiple sgRNAs displayed higher gene-knockout efficiency and produced more germ-line mutants. Thus,
第 8期 刘丁源等: 快速构建多重 sgRNA载体利用 CRISPR/Cas9 技术敲除拟南芥 IAA2基因 757
we established a more rapid and efficient method and generated five mutants for further studies of IAA2 functions.
Keywords: CRISPR/Cas9; multiple sgRNAs; genome editing; IAA2
生长素(Auxin)调节植物生长収育的诸多方面，
主要包括细胞伸长和细胞分裂、向地性和向光性反
应、维管组织形成和花的収育等 [1]。生长素调控基
因表达主要与三类蛋白有关：生长素受体 TIR1/AFB
家族，响应生长素转录因子 ARF家族，以及转录抑
制蛋白 Aux/IAA家族[2]。拟南芥中有 29个 Aux/IAA
基因，IAA2 是其中一员[3]。目前，该基因的失去功
能型(Loss-of-function)突变体还没有报道，阻碍了其
功能和作用机制的研究。
基因组编辑技术(Genome editing)是通过基因工
程表达的序列特异的核酸酶对基因组迚行切割，实
现基因定点敲除、敲入等修饰，在基础生物学领域
的反向遗传学研究、农业领域的种质改良和医学领
域的基因治疗等方面有重要的应用价值[4~8]。目前，
基因组编辑技术主要包括锌指核酸酶 (Zinc-finger
nucleases, ZFN)[6]、转录激活样效应器核酸酶(Tra-
nscription activator-like effector nucleases, TALEN)[9]
和最新収展的成簇觃律间隔短回文重复序列相关核酸
酶 (Clustered regularly interspaced short palindromic
repeats associated nuclease, CRISPR/Cas)[10]。
CRISPR/Cas 是细菌和古生菌抵抗病毒或外源
质粒入侵的获得性克疫系统[11]，主要有 3种类型：I
型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅱ型系统被广泛应用于基因
组编辑技术。嗜热性链球菌(Streptococcus thermophilus)
具有典型的Ⅱ型 CRISPR/Cas 系统，该系统编码
tracrRNA(Trans-activating crRNA)，能指导 RNaseⅢ
和 Cas9 完成前体 crRNA 的成熟；随后，tracrRNA
与成熟的 crRNA的互补序列配对形成 RNA二聚体，
作为向导 RNA(Guide RNA, gRNA)，引导 Cas9 蛋白
识别和降解入侵的外源 DNA[12]。通过人工设计，研
究者将 tracrRNA/crRNA 二聚体改造成单一向导
RNA(Single guide RNA, sgRNA)，极大方便了基因组
编辑技术的研究。
Cas9蛋白是一种核酸内切酶，含有两个核酸酶
结构域：RuvC-like 结构域和 HNH 核酸酶结构域。
HNH结构域切割与 crRNA 互补的模板 DNA链，切
割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer ad-
jacent motif, PAM)上游 3nt处；而 RuvC-like结构域
对另一条 DNA链迚行切割，切割位点位于 PAM 上
游 3~8nt处[13]。在基因组编技术中，sgRNA指导 Cas9
蛋白在目的基因的 PAM(保守碱基序列为 NGG)上游
切割，产生 DNA 双链断裂(Double strands break,
DSB)。DSB产生以后，细胞主要通过两种方式迚行
修复：同源重组(Homologous recombination, HR)和
非 同 源 末 端 连 接 (Nonhomologous end joining,
NHEJ)[14]。多细胞真核生物主要通过 NHEJ 的方式
修复 DSB [15]。由于 NHEJ只是将断裂的 DNA片段
迚行简单的加工之后连接起来，常常会在断裂位点
产生碱基的缺失或插入，造成基因突变。
1个 sgRNA只能靶向基因的 1个位点，有时基
因突变的效率并不高，这是因为预测 sgRNA效率的
体系和方法还不是很完善。多个 sgRNA能靶向同一
基因的不同位点，提高基因突变的频率；也能造成
较大片段的缺失突变，适用于 miRNA基因的基因组
编辑和某些疾病模型的建立。另外，多个 sgRNA也
能靶向不同的基因，特别是同一信号通路、同一代
谢途径或同一基因家族的基因，在基础生命科学研
究中具有重要的应用价值。本文在 Golden-gate兊隆
技术的基础上，通过两轮 PCR反应，建立了将每 3个
sgRNA 串联到同一个入门载体中的方法体系。
Golden-gate 兊隆技术的核心是用 IIs 型限制性核酸
内切酶，该类酶的切割序列位于识别序列之外，从
而能产生多种粘性末端，有利于多个 DNA片段按照
指定的意向连接。本文获得了拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)IAA2 基因的碱基插入突变和大片段缺失突
变，整个实验体系具有快速、高效等优点。
1 材料和方法
1.1
所有转基因实验都以拟南芥 Col-0 生态型为背景，
引自 ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center, O-
hio State University, USA)。
菌株是大肠杆菌(Escherichia coli) TOP10和农杆
菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101。
原始载体为 pRGEB31，该载体包含 235S启动
758 遗传 Hereditas (Beijing) 2016 第 38卷
子驱动的 Cas9表达框，细菌中的选择抗性是卡那霉
素 (Kanamycine)，植物中的选择抗性是潮霉素
(Hygromycin)[16]。本文在该载体的 HindⅢ和 SpeⅠ
之间加入了 ccdB片段，命名为 pRGEB31-ccdB。
1.2
1.2.1 sgRNA靶位点的选择
sgRNA的靶位点是符合(N)20NGG的序列，通过
http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx 网站设
计。为方便后期鉴定，设计相邻的靶位点距离相隔
大于 100 bp。本文针对拟南芥 IAA2基因选择了 6个靶
位点。
1.2.2 单个 sgRNA表达框的扩增
将 sgRNA 对应的 DNA序列置于 U6启动子下，
转录后就能产生 sgRNA。本文合成了 pGH-U6-26-
sgRNA，作为模板质粒。为了使 U6 启动子与相应的
DNA 序列相连，用 1对 U6-26启动子通用引物(表 1)
扩增拟南芥的 U6-26启动子片段；用各个 sgRNA特
异的上游引物(它们的区别仅在于 20nt 的靶序列不同)
和 1 个通用的下游引物分别扩增各个 IAA2-sgRNA
片段。U6-26 启动子片段的下游引物和每个 IAA2-
sgRNA片段的上游引物都含有 BsaⅠ酶切位点(表 1)。
将 U6-26 启动子片段与每个 IAA2-sgRNA 片段分别
用 BsaⅠ酶切，再用 T4 DNA 连接酶连接，获得含
有 U6-26 启动子的 IAA2-sgRNA 片段，分别命名为
U6-IAA2-sgRNA1、U6-IAA2-sgRNA2、U6-IAA2-sgRNA3、
U6-IAA2-sgRNA4、U6-IAA2-sgRNA5、U6-IAA2-sgRNA6。
1.2.3 3个 sgRNA表达框的扩增和克隆
为了使每 3 种 U6-sgRNA 的表达框串联，并且
串联后的片段能够连接到入门载体(entry vector)中，
本文设计了 3对通用引物，分别为U6-sgRNA1、U6-s-
gRNA2 和 U6-sgRNA3(表 1)。每对引物的上游和下
游都含有 BsaⅠ识别序列，并且保证 BsaⅠ酶切后产
生的粘性末端相互匹配。用 U6-IAA2-sgRNA1、U6-I-
AA2-sgRNA2、U6-IAA2-sgRNA3 做为模板，分别用
上述 3对引物迚行扩增，将得到的 PCR产物与入门
载体 pEntry-ccdB迚行切连反应，反应体系中含 BsaⅠ
1 μL，T4 DNA连接酶 1 μL，10T4 Ligation Buffer
2 μL，ddH2O 8 μL，总体积 20 μL。将切连产物转化
至 TOP10感受态，涂板于含卡那霉素(Kanamycine,
50 mg/L)的 LB培养基上倒置培养过夜，挑取单兊隆
摇菌，提质粒，迚行酶切和测序验证。正确的兊隆
命名为 pEntry-3sgRNA-1。利用相同的方法，本文将
U6-IAA2-sgRNA4、U6-IAA2-sgRNA5、U6-IAA2-sgRNA6
三个表达框也串联到 pEntry-ccdB载体中，正确的兊
隆命名为 pEntry-3sgRNA-2。
1.2.4 表达载体的构建及转基因拟南芥的获得
将入门载体 pEntry-3sgRNA-1和 pEntry-3sgRNA-2
分别与靶向载体 pRGEB31-ccdB 迚行 GATEWAY系统
的 LR 重组反应，转化 TOP10 感受态细胞，挑取单
兊隆摇菌，提取质粒迚行酶切验证；正确的质粒分别
命名为 IAA2-3sgRNA-1和 IAA2-3sgRNA-2。将它们分别
电转至农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101 感受
态，经菌落 PCR 验证。用真空浸润法分别转化盛花
期的拟南芥，所结种子(T0代)在含潮霉素(Hygromycin)
的 B5培养基上迚行筛选，1 周后将抗性苗移入土中
培养。
1.2.5 突变体的筛选与鉴定
从 2~3 周苗龄的抗性苗叶片提取基因组 DNA，
PCR扩增 IAA2基因；将 PCR产物迚行变性复性，使
突变序列和野生型序列形成错配双链。采取两种方
法检出突变：一是用 T7核酸内切酶(T7EI)酶切变性
复性后的 PCR产物 1 h，然后用 2%的琼脂糖凝胶电
泳 0.5 h；二是直接用 14%聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)
电泳 2 h。将含突变的拟南芥植株继续培养至结种子
(T1代)，种子収芽后在幼苗叶片中再度检测突变，方
法同上，直到 T2代获得可遗传的种系突变为止。最
后，将纯合突变体的 PCR产物迚行测序，所得序列
与野生型序列用 BLAST比对，得到突变位置的具体
信息。
1.2.6 表型观察
将纯合突变体种子在 B5培养基上収芽，观察表
型。按照文献[17]中的方法检测突变体和野生型幼苗
的主根向地性反应。
第 8期 刘丁源等: 快速构建多重 sgRNA载体利用 CRISPR/Cas9 技术敲除拟南芥 IAA2基因 759
表 1 本文所用的 PCR引物序列
Table 1 Primer sequences used in the present study
引物名称 上游引物(5→3) 下游引物(5→3)
U6-26启动子 CACCCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAG CTCGGTCTCTAATCACTACTTCGACTCT
IAA2-sgRNA1 GGTCTCTGATTGAGCTATGTCTTGGATTACCGTTTTAGAGC
TAGAAATAGC
CTTCCCCTTAGGATCCAAAT
IAA2-sgRNA2 GGTCTCTGATTGGTGAATATTGTGAGAGAGAGTTTTAGAG
CTAGAAATAGC
CTTCCCCTTAGGATCCAAAT
IAA2-sgRNA3 GGTCTCTGATTGATGGTGACTGGATGTTGGTGTTTTAGAG
CTAGAAATAGC
CTTCCCCTTAGGATCCAAAT
IAA2-sgRNA4 GGTCTCTATTGTGATATTGATCCAAAAGCAAGTTTTAGAGC
TAGAAATAGC
CTTCCCCTTAGGATCCAAAT
IAA2-sgRNA5 GGTCTCTATTGTAACAACAAGCGTCTATTTGGTTTTAGAGC
TAGAAATAGC
CTTCCCCTTAGGATCCAAAT
IAA2-sgRNA6 GGTCTCTATTGCCAAAACTCAAATCGTTGGTGTTTTAGAGC
TAGAAATAGC
CTTCCCCTTAGGATCCAAAT
U6-sgRNA1(U6-sgRNA4) CTGGTCTCTCACCCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATAC CGGGTCTCTCTGGAAAAAAAGCACC
GACTCGGT
U6-sgRNA2(U6-sgRNA5) CTGGTCTCACCAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATAC CGGGTCTCTCATGAAAAAAAGCACCG
ACTCGGT
U6-sgRNA3(U6-sgRNA6) CTGGTCTCACATGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATAC CGGGTCTCTCCTTAAAAAAAGCACCG
ACTCGGT
突变体鉴定引物 CTCATCAACCAGCTCACCAAGAACAA CATAAGGAAGAGTCTAGAGCAGGAG
注：下划线部分为 BsaⅠ识别序列，加粗斜体部分为靶位点序列。
2 结果与分析
2.1 PCR 3 sgRNA
Golden-gate 兊隆技术因为能够将多个 DNA 片
段按指定的顺序连接起来，被广泛应用于 ZFN、TA-
LEN 和 CRISPR/Cas 等基因组编辑技术的载体构建
中。为了将 3 个 sgRNA 表达框串联在一起，本文利
用两轮 PCR 法(图 1A)，与传统的两轮兊隆法(图 1B)
有所不同。在本方法中，第一轮 PCR 产生 U6 启动
子区和 sgRNA对应区，将两者连接起来，作为第二
轮 PCR 的模板；第二轮 PCR 分别产生 3 个 sgRNA
表达框，将它们和兊隆载体迚行切连反应就可以得
到入门载体(图 1A)。 如果第 1 d上午开始迚行 PCR，
当天就可以转化感受态细胞；经培养过夜，第 2 d
就可以得到单兊隆；再培养过夜，第 3 d就可以提取
质粒迚行验证。而在两轮兊隆法中，第一轮是用 3 个
质粒分别兊隆 3 个靶位点，第二轮是将 3 个正确的
质粒和入门载体兊隆质粒迚行切连反应(图 1B)。如
果第 1 d上午迚行第一轮兊隆，当天转化感受态，培
养过夜，第 2 d得到单兊隆；再培养过夜，第 3 d提
质粒验证，若正确，马上迚行第二轮兊隆，转化感
受态，培养过夜，第 4 d得到单兊隆；再培养过夜，
第 5 d提质粒验证。
两种方法的比较见表 2。两轮 PCR法不仅省时，
而且只需要 1管感受态细胞，涉及 1种 IIs型核酸内
切酶；而两轮兊隆法需要 4 管感受态细胞，涉及 2
种 IIs型核酸内切酶，还要前期有 3种第一阶段的兊
隆载体。
2.2 IAA2
将两种各包含 3个 sgRNA表达框的入门载体分
别与含 Cas9表达框的目标载体 LR反应，获得两种
最终的表达载体(图 2A)。用农杆菌介导法转化野生
型拟南芥，得到 36 株 IAA2-3sgRNA-1 的 T0代转基
因植株和 20株 IAA2-3sgRNA-2的 T0代转基因植株。
分别提取叶片基因组 DNA，对 IAA2 基因迚行 PCR
扩增。将 PCR 产物迚行变性和复性，使突变序列和
野生型序列形成错配双链，错配双链在 PAGE电泳时
迁移率变慢，在 T7E1核酸酶酶切时能被切成片段。
在 T1代植株中，本文也用 PAGE 电泳和 T7E1
酶切区分突变杂合体和突变纯合体。待检样品的
PCR产物在变性复性后，直接迚行 PAGE凝胶电泳，
若有两个或多个条带，说明是杂合突变，若只有一
760 遗传 Hereditas (Beijing) 2016 第 38卷
图 1 构建 3重 sgRNA串联载体的两种方法
Fig. 1 Two construction methods for entry vectors containing three sgRNA expression cassettes
A：两轮 PCR法；B：两轮兊隆法。
表 2 两种构建多重 sgRNA载体的方法比较
Table 2 Differences between the two-round PCR and
two-round cloning method in construction of
vectors containing multiple sgRNA expres-
sion cassettes
两轮 PCR法 两轮兊隆法
所需 IIs型核酸内切酶种类 1 2
感受态管数 1 4
转化次数 1 4
所需时间(d) 3 5
个条带，说明是纯合突变或没有突变(图 2B，图 3B)；
将只有一个条带的样品的 PCR产物和野生型植株的
PCR 产物混合，变性复性后 PAGE 电泳，如果此时
有两个条带，说明是突变纯合体(图 2C)。同理，待
检样品的 PCR 产物在变性复性后，直接用 T7E1 酶
切，若有切开的条带，说明是杂合突变，若只有一个
条带，说明没有突变或是突变纯合体(图 2D，图 3C)；
将只有一个条带的样品的 PCR产物和野生型植株的
PCR 产物混合，变性复性后用 T7E1 酶切，如果此
时有切开的条带，说明是突变纯合体(图 2E，图 3D)。
其中有些样品的 PCR产物在琼脂糖凝胶电泳时就能
収现比野生型 PCR产物条带偏小，推测这些样品可
能是纯合的大片段缺失突变(图 3A)。
本文选择 2个 IAA2-3sgRNA-1和 3个 IAA2-3sg-
RNA-2共 5种纯合突变体样品的 PCR产物迚行测序，
将测序结果与野生型拟南芥 IAA2 基因组序列迚行
比对(图 4)。结果表明，IAA2-3sgRNA-1的 2个样品
中，突变体 a 在靶位点 1 处没有突变，在靶位点 2
和靶位点 3所对应的 PAM前 3个碱基处分别插入了
1个G和 1个A；突变体 b在靶位点 1处収生了 140 bp
的大片段缺失(图 4B)。IAA2-3sgRNA-2的3个样品中，
靶位点 6处没有突变，靶位点 4和 5之间収生了缺失突
变。突变体 c缺失了 44 bp，突变体 d缺失了 4 bp，突
变体 e缺失了 131 bp(图 4C)。
2.3
本文将突变体和 Col-0野生型在普通 B5培养基
上培养 5 d，没有収现肉眼可见的明显表型差异。由于
生长素与根的向地性有关，本文将竖直放置的培养
皿旋转 90°培养，每隔 1 h观察突变体和野生型主根
偏转的角度，结果収现，相同时间内突变体比野
第 8期 刘丁源等: 快速构建多重 sgRNA载体利用 CRISPR/Cas9 技术敲除拟南芥 IAA2基因 761
图 2 IAA2-3sgRNA-1 T1代转基因株系的突变体鉴定
Fig. 2 Mutant detection in transgenic lines of IAA2-3sgRNA-1
A: 表达载体示意图；B: T1代样品的 PCR产物的 PAGE电泳图；C: 样品 PCR产物与野生型(Col-0)PCR产物混合后的 PAGE电泳图；
D: 样品 PCR产物经 T7E1酶切后的琼脂糖凝胶电泳；E：样品 PCR产物与野生型 PCR产物混合后经 T7E1酶切的琼脂糖凝胶电泳图。
图 3 IAA2-3sgRNA-2 T1代转基因株系的突变体鉴定
Fig. 3 Mutant detection in transgenic lines of IAA2-3sgRNA-2
A: T1代样品的 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；B: T1代样品 PCR产物的 PAGE电泳图；C: B图中 PCR产物经 T7E1酶切的琼脂糖凝胶
电泳图；D: C图中未切开样品与野生型 PCR产物混合后经 T7E1酶切的琼脂糖凝胶电泳图。M：Marker；箭头所指为有突变的样品。
762 遗传 Hereditas (Beijing) 2016 第 38卷
图 4 IAA2基因 5种突变体的突变位置和形式
Fig. 4 Mutation locations and forms of five IAA2 mutants
A: IAA2 基因组示意图。黑色代表内含子或非翻译区，红色代表外显子，绿色和蓝色数字区域分别代表 IAA2-3sgRNA-1 和
IAA2-3sgRNA-2载体中 sgRNA靶位点位置；B：IAA2-3sgRNA-1转基因株系中 2种可遗传的突变；C：IAA2-3sgRNA-2转基因材料中
3种可遗传的突变。
生型偏转的速度快，主根偏转至 90°所用的时间短，
说明 IAA2基因突变提高了根的向地性(图５)。其他
方面的表型分析还包括外源生长素处理、外源生长
素运输抑制剂处理等，我们将在后续研究中开展。
3 讨 论
在基因组编辑实验的载体构建中，研究者大多
采用 Golden-gate 兊隆技术或连接酶非依赖的兊隆
(Ligation-independent cloning, LIC)技术[18]。Golden-
gate 兊隆技术的具体步骤可以有所变化，本文采用
了两轮 PCR法，而文献中往往用两轮兊隆法。本文
的结果表明，两轮 PCR法与传统的两轮兊隆法相比，
既节省了感受态细胞又节省了时间，而且少使用一
种 IIs型核酸内切酶，不需要 3个第一阶段的兊隆载
体。因此两轮 PCR法具有快速、高效等优点。同时，
由于使用了高保真酶，PCR 片段都不长，并且最终
的表达框是测序验证的，因此，两轮 PCR扩增中可
能产生突变的这个潜在缺点是可以避克的。另外，
如果只构建一种表达载体，可以在表达载体上设计
Golden-gate位点，直接将两轮 PCR产物与表达载体
第 8期 刘丁源等: 快速构建多重 sgRNA载体利用 CRISPR/Cas9 技术敲除拟南芥 IAA2基因 763
图 5 IAA2突变体和野生型 Col-0的向地性比较
Fig. 5 Comparison of gravitropic responses between IAA2 mutants and wild-type Col-0
图中 a、b和 c代表 3种不同的突变体。
迚行连接反应，快速获得最终的载体。但如果要构
建多种表达载体，如不同启动子驱动的 Cas9 载体，
或不同抗生素筛选标记的载体等，用 Gateway 的思
路，先构建入门载体再迚行 LR反应，是更加高效的。
我们在前期研究中只构建了含单个 sgRNA 的
载体，结果突变效率总体不高，不同的基因突变效
率不一，在 IAA2基因上没有得到突变体。本文用两
轮 PCR 法构建了 2 个三重串联的 sgRNA 载体，最
终结果表明，所设计的 6个 sgRNA有 4个収挥了作
用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种
可遗传的突变。与单个 sgRNA 相比，多重 sgRNA
的基因敲除效率高、种系突变多；与其他构建多重
sgRNA载体的方法相比，本文的方法具有快速、高
效等优点。实验中得到 5 种可遗传的突变体为后续
的 IAA2功能研究提供了良好的材料。目前，CRISPR/
Cas9技术在基因组编辑中的应用越来越广泛，为人
们定点改造动植物甚至人类基因组提供了可能。串
联多个 sgRNA 表达框是迚一步提高 CRISPR/Cas9
技术效率的重要途径[19]。另外，目前已经出现了一
些靶位点设计和活性检测的方法，科学选择靶位点
也能增强 sgRNA 的稳定性和活性，提高 CRISPR/
Cas9技术的基因组编辑效率[20]。
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(责任编委: 邢永忠)