全 文 ：·特约综述· 2015, 31(4):134-148
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
合成生物学自诞生之日起就受到人们的广泛关
注。2006 年，由美国国家科学院资助的合成生物
学工程研究中心成立 ；2007 年，欧洲委员会启动
了 18 项合成生物学领域的主要研究项目 ；英国也于
2007 年将合成生物学列为高优先级资助研究领域［1］。
2008 年，时代周刊将“创造生命”列为十大科学发
现之一 ；2009 年，英国皇家工程学院对合成生物学
及其应用前景和影响进行了详细介绍。同时，欧美
纷纷向合成生物学研究领域投入巨资。另一方面，
合成生物学的市场也在迅速扩张。BCC Research 的
研究报告认为，2012 年和 2013 年合成生物学总的
市场份额分别为 21 亿和 27 亿美元 ；到 2018 年，该
市场份额将达到 118 亿美元，且 2013-2018 五年间
的复合年增长率为 34.4%。
合成生物学起源于工程应用，其目的在于简化
复杂的自然生物系统，将其变为简单、可靠、质量
可控的模块或者零件。这些模块或零件可以使用计
算机辅助设计（Computer aided design，CAD）来进
行精确的预测和设计，可以进行不同的组合以获得
预期的功能，并且可以在工业规模进行生产制造［2］。
合成生物学的快速发展得益于基因合成和测序等技
术的进步。人工合成 DNA 价格的持续下降，使得
经过密码子优化的基因、启动子及其他调控元件的
使用更加广泛，甚至出现了完全由人工合成的基因
组［3］。高通量测序技术的快速发展使得测序的速度
空前提高，测序成本也不断下降，不断有新的物种
基因组数据被公开。基因元件功能表征和标准化是
设计和构建具有新特征生物的关键步骤，越来越多
的基因元件被构建和测试。
1 合成生物学及其起源
目前对于合成生物学有多种不同的定义，较普
遍的观点是，合成生物学的目标是设计和操纵生物
收稿日期 ： 2015-03-30
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31370130），江南大学自主科研计划重点项目（JUSRP51307A）
作者简介 ：吕永坤，男，博士研究生，研究方向 ：合成生物学 ；E-mail ：lykun2012@sina.com
通讯作者 ：周景文，男，博士，教授，研究方向 ：合成生物学、代谢工程 ；E-mail ：zhoujw1982@jiangnan.edu.cn
合成生物学技术研究进展
吕永坤  堵国成  陈坚  周景文
（江南大学，无锡 214122）
摘 要 ： 合成生物学是一门将生物学工程化的应用学科，目的在于将生命元件标准化和模块化 ；也可用于生命起源等基础
理论研究。对合成生物学进行了较为详细地介绍，主要综述了合成生物学领域新出现的方法及应用。
关键词 ： 合成生物学 ；生物功能元件 ；无细胞合成生物学 ；最小基因组 ；定向进化 ；基因组编辑
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.017
Advances in Synthetic Biology
Lü Yongkun Du Guocheng Chen Jian Zhou Jingwen
（Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract: Synthetic biology is an applied discipline that introduces engineering into biology. The aim of synthetic biology is to standardize
and modularize biological parts. It can also be applied in the basic researches，such as the research of life origin. This review gives a detailed
introduction to the synthetic biology，especially the new methods and applications.
Key words: synthetic biology ；biological part ；cell-free synthetic biology ；minimal genome ；directed evolution ；genome editing
2015,31(4) 135吕永坤等：合成生物学技术研究进展
基零件、装置和系统，创造新功能甚至新物种，也
可以对已有的天然生物系统进行重新设计。合成生
物学是一门应用工程学原理进行系统设计的应用学
科［9］。要理解合成生物学首先需要对其起源进行研
究。关于合成生物学的起源目前有三种不同的看法：
高通量化学合成 DNA 的实现；第一个基因计时器［10］
和基因电路开关的构建［11］；以合成的基因元件构建
完整的代谢通路。
如果将 DNA 的高通量化学合成作为合成生物学
的开端，那么合成生物学其实是一种新的合成技术，
为代谢途径的构建和调控提供了一种简单廉价的方
法。化学法合成基因的长度和类型不断扩展，如今
已经可以实现小型基因组的合成［12］。如果以第一个
基因计时器或基因电路开关的构建作为合成生物学
的开端，那么合成生物学其实是一种基础生物学问
题研究的新方法。在这种观点下，细胞被视为一台
设备，化学合成的 DNA 赋予其感受环境变化并以此
调整自身的功能、生理和突变率［13］。这类基因控制
元件有许多应用，可用以设计医学治疗的装置［14］。
由于存在巨大的工业化潜力，合成生物学在代谢途
径设计和构建中的应用可能是以上三种情况中最受
关注的。然而，从理论的角度来讲，该领域并无太
大贡献。因为研究者会认为，大多数所谓的合成
生物学不过是在代谢工程中引入化学合成的 DNA
而已。
2 生物功能元件
正如电子工程相对于物理学一样，合成生物学
可以理解为生物学的工程化，而生物功能元件正是
该工程领域的基本单元。通过理性设计，将不同功
能特征的元件进行组合，可以得到具有新功能或新
表型的生物体。实现这一目标需要依赖于对生物元
件功能的表征、标准化、组装和调试，以及对基因
回路、底盘和整个体系的设计。
2.1 生物功能元件的设计、合成和功能表征
生命形态的多样性，决定了生命系统可以合成
几乎所有现存有机化合物 ；遗传信息的可编辑性，
又提供了创造新的生命形态的可能性。生物功能元
件是合成生物学的基石，是具有特定功能的最小生
物元件，可以是氨基酸序列或核苷酸序列。不同的
功能元件可以进一步被组合成具有更加复杂功能的
装置和系统。理论上，通过对生物功能元件的设计、
组合，可以实现任何有机化合物和新物种的合成。
另一方面，非天然氨基酸的使用、新核酸的开发及
随之而来的遗传密码子表的扩展，又可以进一步扩
展化合物和新物种合成的范围。随着 DNA 合成技术
的发展和商业化，基因元件合成的保真性和通量不
断提高，同时成本迅速下降，这为基因元件的大规
模合成提供了基础。另一方面，高通量筛选技术的
普及，使得人们可以对大量基因元件进行高通量筛
选和功能表征。
2.2 生物功能元件的标准化
随着合成生物学的诞生，人们即在尝试将生物
功能元件标准化。1996 年，Rebatchouk 等［15］尝试
通过克隆技术建立一个标准的基因元件清单，但该
研究并未立即引起广泛的兴趣。来自麻省理工学院
的 Kight 于 2003 年提出了“生物砖”（BioBrick）的
概念。随后，大量的研究机构开始使用标准的生物
砖元件来构建新的生物装置和生物系统。生物砖是
进行生物功能元件标准化的重要尝试，可以将其理
解为积木的单元，通过这些积木不同方式的组合，
我们可以组装出各种不同的结构［16］。通常生物砖元
件应该包括基因的编码序列和调控序列，如启动子、
核糖体结合位点和终止子等。由麻省理工学院于
2003 年成立的标准生物元件库（Registry of Standard
Biological Parts）目前收集了 3 400 件基因元件，用
于组装生物装置和生物系统。这些标准的基因元件
来源于学术研究机构、科学家个人和每年参加国
际遗传工程机器设计竞赛（International genetically
engineered machine competition，iGEM）的学生团队。
其中的每个生物元件都有自己的编码，还包括其序
列、创建者、功能及使用者等信息。这些信息都是
公开的，可供免费使用。
2.3 生物功能元件的组装
合成生物学的特点在于，可以对标准化功能元
件进行组装，以获得不同功能的装置和系统等。但是，
由于生命系统的复杂性及人类认知的局限性，合成
生物学往往不能像电气工程等其它现代工程学科一
样，将特定功能的基因元件进行简单的组装，就可
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.4136
以获得预期的结果［16］。在此过程中，需要对元件与
元件之间、元件与装置之间以及装置与装置之间进
行适配和优化 ；同时，元件、装置与底盘之间的兼
容性也是重要的影响因素。在此过程中，高通量的
测试方法和系统生物学的分析方法等都是进行适配
和优化的有效方法。利用计算机辅助的动态模拟，
在构建之前对系统进行建模、预测和优化，这样可
以减少系统测试的工作量，加快构建的速度［9］。如
可以对各种组学数据进行整合、构建接近真实的生
物系统模型、预测系统的功能及对环境扰动的响应，
从而给出优化方案。
3 无细胞合成生物学
合成生物学试图使用工程学方法来缩短设计 -
构建 - 验证的工作周期，因为目前人工构建细胞的
方法工作量极其巨大，且成本较高［17］。另一方面，
人们对复杂生命活动认知的局限性，原有部分和合
成（外来）部分之间的干扰，合成途径的动态监
控，这些都是目前胞内合成生物学（in vivo synthetic
bilogy）所面临的挑战［16］，如表 1 所示［18］。由于不
需要为细胞提供生长所需的辅助环境，无细胞合成
生物学（cell-free synthetic biology）为解决上述问题
提供了有力的支撑。无细胞合成生物学研究的是，
不需要完整活细胞的条件下进行的复杂的生物学反
应过程，这些过程是在体外进行的［19，20］。相对于胞
内合成生物学，无细胞合成生物学的特点是，它是
一个开放的反应体系。相对于胞内合成生物学，无
细胞合成生物学具有许多优势，如表 1 所示［21］。
作为基础研究和应用研究工具，无细胞合成生
物学已被研究了数十年，然而直到现在无细胞合成
生物学用于工业生产才具有商业可行性，包括医药、
代谢产物和非天然产物［22，23］。无细胞体外反应体
系可以划分为粗提物无细胞反应体系（Crude extract
表 1 胞内合成生物学所面临的挑战
胞内合成生物学所面临的挑战 无细胞合成生物学的相对优势
对细胞生命活动认知的局限性
细胞设计、构建、优化等的周期长、通量低
细胞元件的控制问题
合成途径的动态监控问题
细胞原有部分与合成（外来）部分之间的干扰问题
在低附加值产品中应用的费效比问题
高效、普适细胞系统的问题
底物添加、产物移除、快速取样和实时监测更加简便
直接添加酶和辅因子等对代谢流和代谢调控进行控制
没有细胞自身基因组，不会出现不需要的代谢调控
省却细胞生存所需的环境，系统的构建和优化更加灵活
cell-free systems，CECFs）和合成酶途径（Synthetic
enzymatic pathways，SEPs）［17］。在选择反应体系时，
首先考虑的因素是需要保留的细胞“看家”功能（如
持续提供能量）。构建 SEPs 所面临的主要挑战是人
们对基础生物学功能认知的局限性 ；而 CECFs 则经
常发生不想要的反应或者产生某些未知产物。时间
和成本也是需要考虑的因素。例如，在无细胞蛋白
质合成过程中，重构 SEP 需要涉及能量代谢、呼吸、
转录、翻译和蛋白质折叠等，对于大多数商业应用，
蛋白质的折叠都是价格高昂的。尽管 SEPs 和 CECFs
的应用有所重叠（图 1），但依然需要谨慎权衡二者
之间的平衡［17］。以下为无细胞合成生物学的主要
应用。
3.1 蛋白质合成
无细胞蛋白质合成（Cell-free protein synthesis，
CFPS）是无细胞合成生物技术最常见的应用。CFPS
系统可以利用酶转化细菌、植物或者动物细胞提取
物。当在系统中提供必要的氨基酸和能量等时，这
些活化的生物催化剂就可以催化氨基酸向多肽的
聚合。大肠杆菌 CFPS 系统高效的蛋白质合成能力
（>1 g/L），使得商业化生产个性化蛋白质药物［24］、
疫苗［25］和难以胞内合成的蛋白质（如水解酶类）［26］
成为可能。
3.2 代谢产物合成
在过去的研究中，人们开始意识到完整的代谢
途径也能够在 CECF 系统中实现，包括中心代谢、
2015,31(4) 137吕永坤等：合成生物学技术研究进展
三羧酸循环和氧化磷酸化等。根据这一思路，人
们正在努力通过控制 CECF 生产代谢产物。Panke
等［27］设计的 CECF 多酶催化系统，以葡萄糖为底物
合成二羟丙酮磷酸（DHAP）。由于 DHAP 的不稳定
性，可以直接向反应体系中添加丁醛和兔肌肉醛缩
酶，将 DHAP 转化为一种稳定形式。相对于 CECFs，
SEPs 系统多用于小分子的生产［28］。SEPs 的优势在
于理性设计生物合成网络时的灵活性。Wang 等［29］
以纤维二糖为底物，通过一个 12 个酶的 SEP 系统
合成了 NADPH 形式的氢。其中的纤维素二糖主要
由酶解纤维素和稀酸预处理生物质水解物得到。在
有酸处理的水解物存在的情况下，大肠杆菌是不能
生长的。这一应用实例显示了无细胞合成技术的优
势，即不需要满足细胞生长的需求。
3.3 基因元件的构建
相对于在体内构建基因元件，体外方法具有独
特的优势 ：反应条件的可控性和可预测性 ；大量的
已知部件加快原型构建的速度 ；体外基因元件可以
转化为真正的基因模块。得益于体外基因元件构建
的快速发展，原型构建可以在 1 个工作日内完成 ；
由 4 个基因开关组成的原型则可以在 8 h 内完成［30］。
人们开发了诸多无细胞元件，包括逻辑门、存储单
元和振荡器。其中，逻辑门包括 AND、OR、NOR、
XOR、NAND 和 NOT 等；存储单元有 1-输入双推和 2-
输入开关，以及诸多振荡器。这些无细胞基因元件
可以用于组装最小人工细胞和细胞样微装置［18］。
3.4 扩展生命的化学结构
非天然氨基酸（Unnatural amino acid，uAA）掺
入是无细胞合成生物学的又一强大工具，因为其允
许其他的化学成分掺入到蛋白质中，从而可以扩展
生命的化学结构。目前有两种途径可以实现 uAA 的
掺入［31，32］。（I）残基置换法 ：天然氨基酸类似物
能够被细胞内原有机制所识别，从而可以将天然氨
基酸置换为相应的氨基酸类似物。该方法需要营养
缺陷型宿主，且仅限于天然氨基酸类似物。（II）密
码子重置或终止密码子消除法 ：该方法依赖于突变
氨 酰 基 -tRNA 合 成 酶 /tRNA 对（Mutated aminoacyl-
tRNA synthetase/tRNA，aaRS/tRNA）与 uAAs 的正交
氨酰化，运送 uAAs 至蛋白质并被掺入。这两种方
法均在无细胞合成系统中获得了成功。将新的化学
物质引入蛋白质的特定位点具有很多种重要的应用，
包括将药物连接到抗体上用于临床治疗［33］，将蛋白
质按特定方向固定到非生物材料表面［34］，生产功能
性病毒样颗粒［35］，探针和标记物掺入［36］等。
另一方面，研究者通过开发新的核酸来扩展遗
传密码子表［20］。其中，Benner 等通过重新定位胞嘧
啶和鸟嘌呤中氢键的供体和受体，获得了新的碱基
对［异胞嘧啶 ：异鸟嘌呤（iso-C ：iso-G）］。这导致
了第 65 个密码子——反密码子对的出现，从而可以
使 uAAs 在蛋白质体外合成过程中高效掺入。Benner
等［37］ 对其工作进行了进一步的优化，创造了人
工 扩 展 遗 传 信 息 系 统（Artificially expanded genetic
information system，AEGIS）。通过重置碱基上氢键供
体和受体基团，将碱基数量由 4 个增加至 12 个。其
中，碱基 Z 和 P 成为研究的焦点，二者不易受到氧
化和差向异构的影响。在 6 碱基遗传密码子表（G∶C、
A∶T、Z∶P） 的 基 础 上，Benner 等［38］ 进 一 步 通
过 PCR 反应扩增出了各种各样的序列，其中包括
多个连续非天然 Z 和 P 的序列。这是令人激动的成
果，它说明这种拥有 216 种可能密码子的非天然的
遗传密码子表（ATGCZP）有可能被用于在体外合成
生命［20］。
4 最细小基因组和最小细胞
构建人工细胞的关键是获得最小基因组。最小
基因组指的是在最优生存条件下，细胞维持生存所
需要的最小的基因集合［39］。最小基因组可以作为特
定功能的基因的载体被转移到细胞底盘中，最终构
建具有特定功能的最小人工细胞。细胞底盘指的是
ᰐ㓶㜎ਸᡀ⭏⢙ᢰᵟ ᰐ㓶㜎㋇ᨀ⢙փ㌫CECFsਸᡀ䞦䙄ᖴSEPs ሿ࠶ᆀ⭏ӗˈԓ䉒ᐕ〻㳻ⲭ䍘ǃཊ㛭ਸᡀˈ䶎ཙ❦≘ส䞨᧪ޕ
无细胞合成生物技术可分为两类 ：无细胞粗提物体系（crude extract cell-free
systems，CECFs）和合成酶途径（synthetic enzymatic pathways，SEPs）；线条
的粗细表示的是发表论文的数量，并不代表相应技术在该领域的实际应用
量或者应用潜力
图 1 无细胞合成生物学的分类及应用
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.4138
包含代谢系统的容器或分隔的空间，其中不包括遗
传信息或基因组。如果将基因组视为细胞的软件系
统，则底盘指的是细胞的硬件系统。最小细胞指的
是，一定环境条件下，能够维持生命活动的最小细
胞单元，也可以理解为由最小基因组控制的自主复
制细胞［39］。最小细胞不仅具有重要的应用价值，而
且可用于研究地球生命的起源。值得注意的是，最
小基因组和最小细胞均为相对的概念，因物种及其
生存环境不同而异［40］。例如，当对两个细菌的基因
组进行比较时，得到的最小基因组由 256 个基因组
成 ；当对 100 个基因组进行比较时，最小基因组的
基因数减少至 63 ；当对 1 000 个基因组进行比较时，
最小基因组的基因数为 0［41］。又如，寄生或共生微
生物的某些基本生命活动（如氨基酸、维生素合成
等）相关的功能基因在进化过程中被简化掉了，因
为这些微生物可以从寄主中直接获取这些物质 ；另
一方面，与其同源的非寄生微生物则保留有这些功
能基因［42］。
最小基因组的研究方法包括比较基因组学方
法、转座子饱和突变法、反义 RNA 技术、单基因特
异性突变法和基因组简化法等［40］。这些方法均存在
不足之处，目前无明确、统一的研究结果。在最小
基因组研究初期，人们期望通过扩大研究的物种范
围，获得一个相对于所有物种通用的最小基因组。
然而，这种普适最小基因组可能并不存在［39］。有以
下几方面的原因。（1）在比较基因组学研究中，当
物种及其环境多样性足够大时，人们所获得的最小
基因组的基因数为 0，即并不存在所有物种必需基
因的交集［41］。（2）某些生命必需的功能，在不同物
种中由非同源的基因所编码，在同一物种中也可能
由多个基因发挥同一功能。如短 RNA 残留物的降
解被认为是必需功能，该功能由 nanoRNases 负责。
nanoRNases 在不同物种中有不同的来源（orn 来源于
Escherichia coli，nrnA 和 nrnB 来源于 Bacillus subtilis，
nrnC 来 源 于 Bartonella birtlesii）， 且 orn 与 nrnA 或
nrnB 在序列上几乎没有相似性［43］；在 Bacillus subt-
ilis 中则由两个不同基因（nrnA、nrnB）所编码，其
中一个基因的失活不能导致细胞的死亡，因此可能
被误认为非必需基因 ；而在 E. coli 中，nanoRNases
只 能 由 orn 编 码， 因 此 无 疑 是 必 需 的。（3） 理 论
上，通用最小基因组概念的前提是所有生命起源于
一个“最晚出现的共同祖先”（last universal commen
ancestor，LUCA）［44］，即所有遗传信息起源于同一
套基因组。然而，LUCA 事实上是一个初始细胞的
群体，它们的基因组分别是古生菌、真细菌和真核
生物的遗传基础。基因组的发展是在细胞进化的后
期，在此之前已经出现了 DNA 复制、脂类合成和
RNA 降解相关的酶类的多样性［45］。（4）以必需基
因的集合作为最小基因组，那么最小细胞只能在最
优条件下生存，而不能持续生存，尤其是当环境条
件有所波动的情况下。
Acevedo-Rocha 等［39］分析认为，通用最小基因
组研究不成功的原因在于以必需基因的集合作为最
小基因组 ；并提出以持续基因（Persistent gene）的
概念来替代必需基因。持续基因指的是位于前导链
上优先表达的基因，在细胞的长期繁殖（必需基
因的功能）或细胞的自我维持、修复中发挥作用。
基因组应当被划分为两部分 ：Paleome 和 Cenome。
Paleome 包括持续基因，与生长、复制、转录、翻译、
维持和衰老等关键功能有关。Paleome 由大约 500 个
持续基因组成，这些基因的功能包括 ：核心代谢，
氨基酸、核苷酸、辅酶、脂类合成，细胞分裂，氨
酰 -tRNA 合成，转录和翻译。Paleome 可被进一步
划分为持续必需基因和持续非必需基因。这些持续
非必需基因被认为是可以省却的，但实际上其与细
胞的维持与压力响应有关，消除后将导致细胞在环
境波动时死亡。Cenome 由非持续基因组成，这些基
因负责细胞对特定环境的适应。因此，Paleome 负责
细胞在最优条件下存活，而 Cenome 负责细胞在特
定自然条件下的长期生存。Cenome 在同一物种的不
同个体之间变换很大。例如，某 E. coli 的 1 500 个
非持续基因（Cenome）与 500 个持续基因（Paleome）
组成了该菌株的核心基因组（2 000 个基因），而所
有 E. coli 菌株的 Cenome 共包括 18 000 个基因［46］。
基因持续的概念在合成人工细胞时非常重要，
因为按照必需基因概念构建的细胞只能在最优的环
境条件下存活 ；而按照持续基因概念设计的细胞则
可以在特定环境下长期生存，并能应对环境的波
动。根据持续基因概念合成人工细胞应当包括如下
步骤 ：（1）对细胞需要应对的环境条件进行评估 ；
2015,31(4) 139吕永坤等：合成生物学技术研究进展
（2）根据环境条件对细胞进行理性设计，包括去除
部分非持续基因、添加特定功能的基因，得到由
paleome、简化的 cenome 和特定功能基因组成的人
工基因组 ；（3）基因的合成与扩增 ；（4）人工基因
组在 Saccharomyces cerevisiae 中组装 ；（5）人工基因
组转移到合适的底盘中（图 2）。
回文重复序列（Clustered regularly int-erspaced short
palindromic repeats，CRISPR）/Cas9 系统使得人们能
够高效、便捷且廉价地对基因组进行精确编辑。研
究者既可以通过常规的分子生物学手段在较短的时
间内构建这些系统，也可以购买商业化的试剂盒或
者向生产商购买订制的产品。
5.1 ZFN和TALEN
ZFN 是第一个使用定制 DNA 结合结构域的核酸
内切酶。ZFN 是异源二聚体，其中每个亚基含有一
个锌指结构域和一个 FokI 核酸内切酶结构域。Cys2-
His2 锌指结构域是真核生物中最常见的 DNA 结合
基元。每个锌指结构域在其保守的 ββα 构型中包含
30 个氨基酸，其中 α 螺旋表面的氨基酸识别基因组
DNA 上 3-4 个连续的核苷酸序列。经过设计和改造
的锌指结构域已经可以识别所有 64 个核苷酸三联
体 ；另一方面，锌指结构域可以由连接肽串联，从
而可以识别 9-18 nt 的 DNA 序列。经过上述改造，
锌指蛋白理论上可以识别任意基因组上的任意目标
序列［50，51］。Fok I 为非特异性核酸内切酶，但锌指
结构域赋予其切割位点的特异性 ；Fok I 结构域必
须二聚化才有活性，确保必须存在两个相邻的 DNA
结合事件才能实现双链断裂，从而增加了切割特异
性。在双链断裂后，细胞试图修复它。最简单的方
法 是 非 同 源 末 端 接 合（Nonhomologous end joining，
NHEJ），其中细胞基本上磨平断裂 DNA 的两端，再
将其彼此拉近，这往往产生移码。另一种方法是同
源定向修复（Homology-directed repair，HDR）。细胞
试图利用另一条染色体上对应的 DNA 序列作为模板
来修复断裂。也可以通过提供特定的外源模板，对
断裂位点进行编辑。
TALEN 也是二聚的转录因子 / 核酸酶，由转
录 激 活 因 子 样 效 应 物（Transcription Activator-like
Effector，TALE） 与 FokI 内 切 酶 结 构 域 融 合 而 成。
TALE 是植物病原菌 Xant-homonas 的天然蛋白，其
DNA 结合结构域由一系列结构重复而成。每个重复
结构包括 33-35 个氨基酸，且只能识别 1 个碱基。
与锌指结构域一样，TALE 也通过重复结构的串联来
识别特定的 DNA 序列 ；且通过不同的串联组合，研
究人员可靶定他们想要的任何序列［52］。TALE 重复
⨶ᙗ䇮䇑 ⡷⇥ਸᡀ䞯䞂䞥⇽ѝ㓴㻵〫Ἵࡠਸ䘲Ⲵᓅⴈѝ
黑色 DNA 表示 paleome ；红色 DNA 表示 cenome ；蓝色 DNA 表示特殊功能
基因
图 2 特定环境下具有特殊功能的最小细胞的合成策略
5 基因组编辑方法
在许多研究中，人们发现质粒分离、质粒上基
因表达的不精确性以及质粒保持造成的代谢负担等
问题随着质粒拷贝数的增加而加剧［47］。在基因组上
整合表达显然可以解决这些问题，且避免了抗生素
和诱导剂等的使用［48］。由于细胞系统几乎所有的功
能都由基因组编码，因此理论上基因组编辑可以重
构生命系统［49］。在合成生物学的应用中，基因组
编辑是异源合成途径的重构及模块优化的基本操作
手段。传统的定点重组酶系统如 Cre/lox、PFlp/FRT
和 φC31 等 能 够 实 现 对 基 因 组 的 编 辑， 然 而 这 些
方法存在诸多不足，如重组效率低，筛选过程复
杂，存在不利突变的可能性等。近年来出现的锌
指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）、转录激活
因子样效应生物核酸酶（Transcription activator-like
effector nucleases，TALEN）和成簇的规律间隔的短
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.4140
结构的串联可以在数天内快速构建［53］。限于三联核
酸识别模式，ZFN 构建困难且成本较高，而 TALEN
和 CRISPR/Cas 系统在这方面则具有相对优势。
5.2 CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas 是细菌和古细菌在长期演化过程中
形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵
的病毒及外源 DNA。CRISPR/Cas 通过将入侵噬菌体
和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应
的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，
从而提供免疫性［54］。目前，在基因组定向编辑方
面，运用最广泛的是源自于生脓链球菌（Streptococcus
hyogenes）的 Type II CRISPR/Cas9 系统。此系统的工
作原理是 crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基
配 对 与 tracrRNA（Trans-activating RNA） 结 合 形 成
tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9
蛋白在与 crRNA 配对的基因组序列靶位点剪切双链
DNA，形成双链缺口（Double strand break，DSB）。
然后细菌通过非同源重组 NHEJ 或同源重组 HDR 两
种方式修复 DSB［55］。近来，研究表明，通过人工设
计的 sgRNA（Short guide RNA）也可以引导 Cas9 对
DNA 的定点切割（图 3-A）［56］。
研究发现，Cas9 蛋白不具有特异性，只需要
一个特异识别基因组靶序列的 sgRNA，即能实现对
基因组靶序列核酸酶定向切割。人工合成的 sgRNA
一般包括 3 个部分（图 3-B）：靶序列互补配对区
（Base-pairing region，20 nt）、Cas9 蛋白结合区（Cas9
handle Region，42 nt）、 转 录 终 止 区（S. hyogenes
terminator，40 nt）。sgRNA 引导 Cas9 蛋白识别基因
组 上 的 PAM（Protospacer adjacent motif） 序 列（S.
hyogenes Cas9 识别序列为 NGG），并与 PAM 序列的
5 端 20 个核苷酸序列互补配对，然后 Cas9 蛋白在
PAM 序列上游 5 端第 3 个碱基处切割形成 DSB［57］。
由于 CRISPR/Cas 系统在基因组编辑上的高效、简便，
这一新技术目前被广泛使用，并已成功运用于肺炎
链球菌、大肠杆菌［58］、果蝇［59］、人类、小鼠、斑
马鱼等［60］物种的基因组编辑。
6 定向进化
虽然我们已经可以从头合成完整的细菌基因组
及部分真核生物基因组，然而对于生命系统的认知
依然有限，这使得我们在面对一些问题时并无太多
策略。如异源表达蛋白质溶解度低、热稳定性差，
合成途径中多个基因的协调性问题，在异源环境中
基因元件功能的优化，基因组优化以使合成生命获
得预设的表型等［61］。定向进化并不需要我们预先了
解太多生命系统的相关信息，从而成为解决这些问
题的有力工具。本节主要介绍定向进化在合成生物
学领域的应用及其新发展。
6.1 定向进化在合成生物学中的应用
定向进化指的是在实验室条件下创造突变，并
对突变文库施加筛选压力，从而筛选出具有期望表
型的突变体［62］。定向进化实验步骤包括创造随机突
变，将突变基因在合适的宿主中表达，以适当的筛
选条件筛选有利突变。重复上述步骤，经过不断的
循环有利突变在较短的时间内快速积累，并可被用
于后续操作以解决上述问题。定向进化可以在单分
子水平实施，也可以在合成途径和调控网络水平实
施，甚至在细胞整体水平实施以直接获取某些特定
表型［61］。
6.1.1 改善酶的催化特性 酶既是生命的基本元素，
也可被单独用于生物催化，来合成医药、化学品和
能源。能够在生产中应用的酶应当具有如下特性，
催化活性高、底物特异性强、稳定。定向进化非常
适合于提高酶的上述特性。PhlD 被用于藤黄酚的生
物催化合成，但 PhlD 的催化活性和稳定性均较差，
成为限制其应用的重要因素。通过序列分析，Zha
等［63］找到了 PhlD 的 52 个同源基因，并构建了容
量为 1.2×1011 的突变体文库。使用高通量筛选技术，
筛选到了酶活性和稳定性均提高的突变体。来源于
Methanococcus jannaschii 的 柠 苹 酸 合 酶（citramalate
synthase，CimA）在 E. coli 中表达活性较低。柠苹酸
途径能够使 L-异亮氨酸缺陷型 E. coli 在基本培养基
上生长，且细胞生长速率与柠苹酸途径的活性正相
关。根据这一原理对 CimA 在 L-异亮氨酸缺陷型 E.
coli 中进行定向进化。经过 6 轮定向进化实验，得到
了 1 个活性提高且抗反馈抑制的 CimA 突变体。突
变体使正丙醇和正丁醇的生产效率分别提高了 9 倍
和 22 倍［64］。
6.1.2 非天然氨基酸掺入 当使用密码子重置法将
2015,31(4) 141吕永坤等：合成生物学技术研究进展
非天然氨基酸掺入蛋白质时，需要 3 个元件，即终
止 密 码 子、tRNA 和 氨 酰 -tRNA 合 酶（aaRS）［65］。
通过活性位点的改变，可以改变 aaRS 携带氨基酸的
特异性，从而实现非天然氨基酸的掺入。通过定向
进化，已经有 70 多种不同结构的非天然氨基酸掺入
到细菌、酵母和哺乳动物的蛋白质中［32］。虽然非天
然氨基酸的掺入可以使蛋白质的性质和功能发生变
化，但同时也常常导致蛋白质活性和稳定性的下降。
定向进化不仅可用于提高天然蛋白质的性质，也可
用于提高携带有非天然氨基酸的蛋白质的活性和稳
定性［66］。
6.1.3 基因表达水平调控 定向进化可以用于基因
表达水平改造，如通过改造启动子和构建操纵子来
调控基因表达。对组成型启动子 PL-λ 的衍生物进行
易错 PCR，获得突变体文库。将突变体亚克隆至报
告载体的绿色荧光蛋白 GFP 基因上游，并转化 E.
A
B
CRISPR/Cas9㺘䗮㌫㔏 cas9
sgRNA
sgRNA
sgRNAоCas9㓴㻵สഐ㓴㕆䗁⁑ᶯ਼Ⓚ䟽㓴䶦ᒿࡇӂ㺕䝽ሩ४2025 nt 㓸→ᆀ40 ntCas9㳻ⲭ㔃ਸ४42 nt䖜ᖅ䎧࿻ս⛩
HNH
RuvC
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sgRNAо䶦ᒿࡇӂ㺕䝽ሩ˗
Cas9࠷ࢢสഐ㓴ৼ䬮
NGG
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RuvC
HNH
Cas9
图 3 Type II CRISPR/Cas9 系统基因组编辑示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.4142
coli。通过筛选，获得了 22 个不同荧光信号强度的
突变体。以这些突变体来考察磷酸烯醇式丙酮酸羧
化酶对细胞生长和脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶对番茄
红素产量的影响。另外，定向进化手段改造启动子
也可以用于 S. cerevisae。为了同时调控多个相关基
因，而又不分别对各自的启动子进行改造，构建操
纵子是比较方便的手段之一。为了调控操纵子内多
个基因的表达水平，需要构建和筛选可调基因间区
（Tunable intergenic region，TIGRs）文库［67］。TIGR 包
括一系列控制元件，包括 mRNA 二级结构、RNA 酶
切割位点和核糖体结合位点（RBS）分隔序列（图 4）。
以红色荧光蛋白 RFP 和绿色荧光蛋白 GFP 作为报告
系统，TIGRs 可以使两个报告基因的相对表达强度
改变 100 倍。通过 TIGR 方法来平衡甲羟戊酸合成
途径中的 3 个基因的表达水平，可以使甲羟戊酸在 E.
6.2 定向进化的新进展
虽然定向进化是解决合成生物学问题的有力工
具，但是其也受到文库大小、筛选效率和进化实验
所需时间等因素的限制。不过，不断出现的新方法
已经可以用于缓解定向进化的这些限制，如智能文
库的构建、体内定向进化等。
6.2.1 智能文库构建 在突变体文库构建过程中，
传统的定向进化使用的是随机突变的策略。在随机
突变产生的大量突变体中，有利突变往往并不占多
数，但文库容量的增加又增加了筛选的难度。而
智能文库指的就是容量较小且富含有益突变的突
变 体 文 库。 重 构 的 进 化 适 应 途 径（Reconstructed
evolutionary adaptive path，REAP）分析是构建智能
文库的方法之一［68］。REAP 被用于扩展 DNA 聚合
酶的底物谱。通过分析一系列 DNA 聚合酶在进化过
程中的保守位点和可变位点，找到进行基因突变的
位点。通过对 93 个突变体的筛选，得到两个能够高
效利用新底物的突变体。相对于传统的随机突变文
库，从智能文库中筛选出有利突变的效率极大地提
高。当需要进化的对象的遗传信息未知时，可以使
用另一种被称为截短的宏基因组基因特异性 PCR 的
方法［69］。该方法将环境中的 DNA 按照功能进行筛选，
接着使用一套引物扩增其中具有一定同源性的基因，
从而得到一个具有功能和遗传特异性的突变体文库。
6.2.2 体内定向进化 体内定向进化策略可以简化
定向进化的实验操作，并减少人为因素的干扰。噬
菌体辅助持续进化（Phage-assisted continuous evolu-
tion，PACE）就是很好的例子［70］。在 PACE 实验中，
E. coli 持续流经一个装有复制性噬菌体的装置，复
制性噬菌体携带有目的基因。噬菌体要产生具有侵
染力的后代需要 pIII 蛋白质，而研究者将噬菌体合
成 pIII 蛋白质的能力与目标蛋白质的功能相偶联。
因此，当噬菌体感染流经的 E. coli，并编码具有功
能的目标蛋白质时，可以产生 pIII，进而产生具有
侵染能力的后代噬菌体 ；当噬菌体编码的蛋白质不
具有功能时，pIII 不能被合成，进而不能产生具有
侵染能力的后代噬菌体。期间，噬菌体持续受到突变，
并产生新的突变体。具有侵染能力的后代噬菌体不
断繁殖，而无侵染能力的后代噬菌体被洗出。最终，
TIGR᮷ᓃ E
E
Megaprimer PCR
TIGR
mRNA
mRNA
TIGR
RNase E
Gene CGene BGene A੟ࣘᆀ 䖜ᖅ 㓸→ᆀ࣐ᐕ㘫䈁 㘫䈁 㘫䈁
᫽㓥ᆀ
E 表示 Rnase E 切割位点
图 4 TIGR 法调控操纵子中多基因表达水平［67］
coli 中的产量提高 7 倍。
2015,31(4) 143吕永坤等：合成生物学技术研究进展
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图 5 PACE 原理示意图
有利突变随着具有侵染能力的噬菌体的富集而得到
富集（图 5）。
基于边突变边进化的原则，李寅等提出了基
于基因组复制工程的连续进化（Genome replication
Engineering assisted continuous evolution，GREACE）
的概念［71］。GREACE 的原理是通过在微生物细胞中
引入一系列经遗传修饰的 DNA 聚合酶校正元件，使
细胞进入一种高突变率的状态，从而在筛选压力条
件下加速进化过程。经过一段时间的进化后，将遗
传改造的校正元件从细胞中移除，这时细胞就能维
持其基因型的稳定，同时能将这种优势表型遗传下
去。
7 合成生物学的应用
最初合成生物学发展的驱动力来源于对可再生
性生物燃料的追求，人们期望通过合成自然界中不
存在的生物，来将大量存在的糖类和纤维素物质转
化燃料。现如今合成生物学的应用已经扩展至很多
领域领域，如生物燃料生产、天然产物合成、生物
医药、合成新物种等。
7.1 生物燃料
石化资源的不断枯竭及其燃烧产生的污染迫使
人们寻求新的可替代清洁能源，通过微生物大规模
生产生物燃料就是其中之一。如生物乙醇已经在部
分国家实现商业化应用，而丁醇、异丁醇、生物柴
油等物理化学性状更优的生物燃料的应用也在探索
中［72，73］。合成生物学使得人们可以将生物燃料的
合成代谢途径异位重构至性状优良的微生物中，如
Escherichia coli、Lactobacillus、Pseudomonas putida 和
Bacillus subtilis 等。相对于传统的生产菌，这些工程
菌具有很多优势，如生长迅速、营养要求简单、易
于遗传改造和代谢副产物少等［74］。不过，生物燃料
对微生物自身普遍具有毒害作用［75］，这也是人工合
成微生物在高效生产生物燃料的过程中所面临的最
大挑战。突变和遗传改造等策略已经被应用于构建
生物燃料耐受性菌株［76，77］，且生产过程表明其耐受
性明显提高。但是，人工合成微生物的生物燃料耐
受性机制并不十分清楚，这成为阻碍理性设计耐受
性更强微生物的最大障碍［74］。Kim 等［78］和 Lee 等［79］
针对这一基础问题展开了研究，以期为提高生物燃
料耐受性提供更加理性的策略。
7.2 天然产物
来源于动物、植物、真菌和细菌的次级代谢产
物的性质与化学法合成的化合物差异很大。天然产
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.4144
物有着长期作为药物使用的历史，但是它们往往难
以得到单一的化合物，且来源有限。与高通量测序
技术及质谱分析技术等相结合，合成生物学将外源
的代谢途径引入易于遗传改造的模式微生物中，实
现了天然产物的高效生产。其中，代表性的天然产
物包括青蒿素、黄酮类化合物等。Keasling 及其团
队将青蒿中的紫穗槐 -4，11-二烯合酶基因（ADS）导
入大肠杆菌中表达，同时用酵母萜类合成途径代替
大肠杆菌萜类合成途径，首次在微生物体内合成出
青蒿素的第一个关键前体——紫穗槐 -4，11-二烯［80］。
而后他们又将 ADS 基因连同细胞色素 P450 单氧化
酶基因（CYP71AV1）及其还原酶基因（CPR）同时
导入酿酒酵母中表达，培育出世界上第一株生产青
蒿酸的酵母工程菌［81］。国内江南大学研究团队通过
人工合成、密码子优化及异源表达黄酮类化合物合
成相关基因，实现了多种黄酮类化合物在大肠杆菌
中的合成 ；通过模块化策略，使圣草酚的产量达到
107 mg/L［82］。
7.3 医药领域
合成生物学在医药领域的应用主要有体内文库
构建、药物发现、药物合成、药物输送和药物优化
等方面［83］。（1）体内文库构建 ：将待筛选的化合物
在细胞中表达，该文库可以随着细胞的培养而得到
保存和扩增。（2）药物发现 ：为了充分发挥体内文
库的优势，可以利用颜色信号或者可筛选的遗传表
型等胞内分析方法来检测和筛选阳性克隆。不断增
加的生物传感器可以作为检测工具。（3）药物合成：
通过合成代谢途径的异位重构，一些重要的天然产
物已经被成功合成，如萜类、聚酮化合物、非核糖
体多肽、生物碱等。合成生物学还可以对这些合成
途径进行精确调控。（4）药物输送 ：通过合成生物
学方法，可以理性设计微生物使其能够作为药物输
送的载体，且具有安全性。通过活体接种，这些携
带药物（如益生菌、抗肿瘤药物等）的微生物侵袭
特定的靶点（如肿瘤）［84］，在释放前药之后自毁。（5）
药物优化 ：蛋白质等药物的修饰可以使其具有更好
药效和更长半衰期，通过在大肠杆菌中构建翻译后
修饰系统，使得大肠杆菌能够生产经过特定修饰的
重组药物蛋白［85］。
7.4 新物种合成
2010 年，Gibson 等［3］将一个 1.08 Mb 的 Myco-
plasma mycoides 人工合成染色体转移到 M. capricolum
受体细胞中，创造出一个全新的 M. mycoides 细胞。
该细胞完全由人工合成的基因组控制，并具有预期
的表型特征，且能够自主复制。这被认为是第一个
人工合成细胞。不过，该细胞只能在最理想的环境
条件下存活和自主复制，而不是在真正的自然环境
中。关于真正的生命形式有不同的定义，因此，对
于合成生命也就有不同的看法。一般的观点认为，
单细胞生命不仅仅包括其自身的生化和生理特性，
还应当包括其所生存的环境条件，如主要的物质来
源和能量来源、渗透压、离子强度等［86］。自下而上
的细胞合成一般需要满足三方面的特征 ：遗传信息、
代谢和自组织。这三个特征对于具有自主复制和进
化功能的合成生命是必不可少的［87］。虽然目前尚不
能合成同时具有上述三个特征的生命形式，但合成
生物学已经分别在这三方面取得了一定的进展［86］。
8 展望
虽然合成生物学研究已经取得较大进展，且有
着很好的应用前景，但依然面临诸多挑战。2010 年，
Roberta Kwok 在 Nature 杂志上撰文认为，合成生物
学需要面对五大难题［9，16］：（1）大部分生物元件的
特征尚不明确，我们不清楚它们在不同底盘或者不
同实验条件下的表型特征，甚至不知道它们能用来
干什么 ；（2）功能回路的不可预期，即我们不能像
其他现代工程技术一样，将基因零件简单的组装起
来就能获得预期的功能 ；（3）系统过于复杂，即随
着系统的不断扩大，构建和测试变得非常困难 ；（4）
不兼容性，即外源的基因元件和底盘之间往往不兼
容 ；（5）变异对于系统的影响，胞内分子具有波动
性或噪音，这将影响细胞的功能，而这些随机变异
的积累将最终摧毁回路。生命是复杂而精密的系统，
从转录调控、翻译后修饰到代谢网络之间的协调，
以及细胞与细胞、细胞与外界环境之间的互动，这
些都需要在特定的时间和空间上发生。对于生命认
知的局限性是限制人们理性设计、构建和测试合成
生命的最大障碍。人们对于不同元件、装置和系统
的构建和测试，使得生物合成相关的数据迅速扩增。
2015,31(4) 145吕永坤等：合成生物学技术研究进展
对这些数据进行系统的整合，形成对生命系统较为
完整的认知，是需要解决的问题和合成生物学的发
展方向［1］。
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