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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):44-51
随着生物化学与分子生物技术的快速发展，
RNA 的 生 物 功 能 被 越 来 越 多 地 发 现 与 报 道， 如
microRNA（miRNA）［1，2］、small interfering RNA
（siRNA）［3，4］和 nanostructure RNA［5，6］等几类 RNA
的研究均取得了突破性进展。同时，大量开展 RNA
相关研究从质和量两方面对 RNA 的合成技术提出了
更高的要求。
RNA 材料的合成方式包括化学合成和酶法合成
收稿日期 ：2015-05-19
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31201327，31301420）
作者简介 ：王静，女，博士，研究方向 ：核酸化学与生物技术 ；E-mail ：wodejia_sun@126.com
通讯作者 ：梁兴国，男，博士，研究方向 ：核酸化学与生物技术 ；E-mail ：liangxg@ouc.edu.cn
酶法合成 RNA 的相关技术研究进展
王静  潘孝明  刘宇  梁兴国
（中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛 266003）
摘 要 ： 近些年来 RNA 相关研究发展迅速，从质和量两方面对 RNA 合成技术提出了更高的要求。RNA 合成方法包括化学
合成和酶法合成两种。目前已商业化的 RNA 化学合成法能够实现长度小于 90 个碱基的 RNA 合成，但合成费用相对较高，使许多
研究难以展开。相对于化学合成，酶法合成具有效率高、条件温和的特性，能够合成长序列，是一种高效、低耗的 RNA 合成方案。
酶法合成的技术流程包括转录和加工两步，其中转录的模型主要分为线性转录和滚环转录两种，不同的模型产生的初始转录产物
特性不同，需要采用相应的加工方式对其进行处理才能获得准确的目的 RNA 产物。近年来研究者们不断地研究探索 RNA 的酶法
合成，发现并构建了多种转录模型和初始转录物的加工方案，将从酶法合成 RNA 的转录模型和加工技术的原理、特点和问题等方
面进行概述，以期为后续酶法合成 RNA 的进一步研究和选择性应用提供参考。
关键词 ： RNA ；酶法合成 ；线性转录 ；滚环转录 ；特异位点剪切
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.008
Research Progress on Enzymatic Synthesis of RNA
WANG Jing PAN Xiao-ming LIU Yu LIANG Xing-guo
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003）
Abstract: With the rapid development of RNA related studies，RNA synthesis technology is further challenged from two aspects
of quality and quantity. At present there are mainly two methods for RNA synthesis，chemical synthesis and enzymatic synthesis. By the
commercialized chemical way，the synthesis of RNA with < 90 bases is achieved ；however，the cost of the synthesis is relatively high，
which leads the initiation of many researches in difficulty. Compared to the chemical way，the enzymatic synthesis presents the characteristics
of the high efficiency and mild reaction conditions，and by it a long sequence of RNA can be synthesized，thus，it is an efficient and low-
cost measure for RNA synthesis. The enzymatic production of RNA is in two steps，transcription and processing of initial transcripts. The
transcription may be further classified into the linear transcription and the rolling circle transcription model，with which the characteristics
of initial transcripts vary，and the corresponding processing methods should adapted to the varied initial transcripts，thereby，the accurate
target RNA products may be obtained. Recently，as the exploration of enzymatic synthesis continues，many novel transcription and processing
strategies have been developed. In this review，the mechanisms，characteristics and problems of the transcription models and processing
methods in enzymatic synthesis were summarized，aiming at providing the references for further study and selective utilization of enzymatic
synthesis of RNA.
Key words: RNA ；enzymatic synthesis ；linear transcription ；rolling circle transcription ；site-specific cleavage
2016,32(3) 45王静等：酶法合成 RNA的相关技术研究进展
两种。RNA 的化学合成是按照 3 → 5 磷酸二酯键
的方向依次连接核苷酸，需采用特定的化学试剂对
相应的基团进行适当的加保护和去保护来完成。核
酸化学合成起始于 20 世纪前期［7］，并已在 30 年前
实现了自动化，可满足长度小于 90 个碱基的 RNA
合成。此外，化学合成可以实现 RNA 的化学修饰，
目前仍是一种广泛应用的 RNA 合成方法。但由于
核糖核苷糖环的 2-OH 和 3-OH 反应活性近似，导
致特定官能团加保护和脱保护困难［8］，合成收率随
序列长度增加而显著降低［9］。另外，由于化学合成
需要采用固相合成法，合成规模难以扩大，无法满
足核酸类药物的研发与制备要求，许多报道也提出
当前化学合成技术不能满足快速增长的 RNA 研究的
需求［10，11］。
酶法合成 RNA 是在 RNA 聚合酶（RNA polym-
erase，RNAP）体外转录基础上建立的生物制备方法，
现已建立了多种模型［12-14］。相对于化学合成的固相
合成模式，酶法合成更易于实现较大规模生产，适
合进行一些核酸类药物的生产，是一种发展前景良
好的 RNA 合成方法［9，15］。但酶法合成一般较难实
现 RNA 的修饰，仍然有许多技术问题需要解决。深
入了解 RNA 酶法合成相关技术的原理和特性，将有
助于上述问题的解决。到目前为止，国内外期刊鲜
有酶法合成 RNA 的相关综述报道。本文就 RNA 酶
法合成的转录模型和加工技术的机制、设计和特点
等方面进行概述，以期为后续 RNA 酶法合成的研究
及其应用范围的拓展提供参考。
1 RNA 酶法合成简介
酶法合成 RNA 的制备流程包括转录和加工两
个核心部分，转录过程要求合成多拷贝，加工过程
要求终产物序列同所需的序列完全一致。转录是酶
法合成的基础，具有效率高、反应条件温和的特点，
所使用的 RNA 聚合酶主要包括 T7 和 SP6 两种噬菌
体 RNA 聚合酶。在 DNA 双链模板转录模型中，这
两种 RNA 酶识别各自的启动子，在最适条件下可以
获得相对 DNA 模板几百倍甚至几千倍的 RNA 转录
产物［12，15］。但高效的转录要求起始转录的前三位碱
基富含嘌呤，特别是 +1 位必须是鸟嘌呤［16］。T7 和
SP6 RNA 聚合酶还会在完成模板编码的转录产物合
成后继续在其 3 端添加 1-3 nt 任意碱基，造成产物
3 端异质［13］。不同的转录模型形成的初始转录物不
同，线性转录模型产生的是模板编码的 RNA 产物单
体 ；滚环模型产生的是模板编码的 RNA 首尾串联而
成的聚合物。因此，要得到目的产物，两种模型转
录初始产物都需要在后续加工过程中通过特异性水
解酶对其进行切割。本综述分别从转录和加工两个
方面分别进行论述。
2 RNA 酶法合成中的转录模型
2.1 线性转录模型
根据转录模板的类型，转录大致可以分为线性
转录和滚环转录两种，它们具有不同的启动子依赖
性、转录效率、特性及问题［12-14］。线性转录模型是
指以线性的 DNA 单链或双链为模板进行转录，根据
模型中启动子的存在与否，又可以分为启动子 - 线
性转录模型和无启动子 - 线性转录模型两类。
最早的启动子 - 线性转录模型由 Melton 等［12］
在 1984 年构建，该模型在 SP6 RNA 聚合酶的作用
下能够转录 100-6 000 个碱基长度的 RNA。随着分
子生物技术的进步，该方法也得到改进和完善，成
为一种常规的转录方案，具体的技术方案如图 1 所
示 ：（1）将用于转录的双链模板插入到载体的多克
隆位点，要求插入片段连接在相应启动子的下游和
相应酶切位点之间 ；（2）重组质粒转化大肠杆菌感
受态细胞，测序鉴定筛选阳性克隆，提取阳性克隆
的重组质粒 ；（3）采用限制性内切酶在插入片段的
下游切割，使载体线性化 ；（4）采用 T7 或 SP6 RNA
聚合酶进行转录［17-19］。对于双链 RNA 的制备可以
通过将转录模板插入双反向的启动子之间和特异酶
切位点之间，进行两向的线性转录而实现。2013 年，
Rouhana 等［20］采用该方法制备了双链 RNA，并以
此作为材料对涡虫进行 RNAi 研究。以质粒构建的
启动子 - 线性转录模型已经广泛应用在许多转录或
基因表达的相关研究中［21-23］，一般涉及的 RNA 产
物较长，对产物末端准确性要求不高，不需要后续
的加工处理即可使用。
1987 年，Milligan 等［13］直接用化学合成的两条
分别含有启动子信息和模板信息的 DNA 链经退火形
成双链模板（图 2-A），转录合成 12-35 nt 的 RNA，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.346
通过优化转录条件最终能够获得毫克级的产物。由
于该方法不需要载体的构建和转化等繁琐的操作，
所以简单易行，被广泛应用于相对较短的 RNA 序列
的制备［24，25］。
形成与非截短型双链模板同样的 RNA 产物，并且截
短的非模板链去除 -17 - -14 和 -4 - +2 位一个或数个
碱基后仍然可以发生转录。2002 年，Donzé 和 Picard
借助该模型建立了一个酶法合成 siRNA 的方案，并
成 功 地 运 用 到 哺 乳 动 物 细 胞 RNAi 的 研 究 中［26］。
2012 年，Cheong 等［27］ 联合该转录模型和 DNA-亲
和色谱建立了一种快速制备 RNA 样品的方法，合成
的 RNA 可以满足 X-射线、NMR 等分析要求。令人
意外的是，Sharmeen 和 Taylor［28］发现了两种无启
动子转录模型。其中一种是引物模型（图 2-C），由
一条短链 DNA 于模板链的 3 端退火，在完全无启
动子的情况下引发转录。另一种是无启动子且无引
物的单链 DNA 模板转录模型（图 2-D），令人费解
的是既没有启动子又没有引物的情况下，SP6 RNA
聚合酶能够仅以一条单链 DNA 寡核苷酸链为模板
进行转录，并产生与 DNA 寡核苷酸链相同大小的
RNA。但是这种模型的合成效率显著降低。1988 年，
Krupp［29］采用不同序列的寡核苷酸链实验该模型的
转录特性发现，这种转录可能会引发许多异质产物
的产生，不能保证从同一位点起始转录。由此可以
看出，在启动子存在的情况下，RNA 聚合酶会以
启动子转录的机制为主导，而在启动子缺失的情况
下，RNA 聚合酶可能是识别 DNA 的二级结构起始
转录信号，并以较低的效率完成之后的转录［30，31］。
此外，Milligan 等［13］在研究中发现了 T7 RNA
聚合酶转录产物存在 3 端异质的问题，这个缺陷
DNA⁑ᶯ ੟ࣘᆀᒿࡇ 䖭փ
DNA⁑ᶯᨂޕ䖭փཊݻ䲶ս⛩䲀ࡦᙗ޵࠷䞦䞦࠷ս⛩⢩ᔲս⛩࢚࠷ᖒᡀ㓯ᙗॆ䖭փ䖜ᖅ
RNA
图 1 质粒构建启动子 - 双链转录模型的转录流程
Milligan 等［13］还尝试构建了一种截短型启动
子 - 线性转录模型（图 2-B），其非模板链只含有 T7
RNA 聚合酶启动子 -17 - +1 位的碱基，而模板链与
非截短型的（图 2-A）相同。结果发现截短型能够੟ࣘᆀᒿࡇ-17
5˃
A
B
C
D
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-1 +1
-17 -1 +1
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图 2 几种线性转录模型
2016,32(3) 47王静等：酶法合成 RNA的相关技术研究进展
极大影响了酶法合成在 RNA 合成方面的应用。早
期 Moran 等报道提出 DNA 模板中引入不能与 NTP
形 成 碱 基 配 对 的 核 苷 类 似 物 修 饰， 可 能 诱 导 转
录在核苷类似物之前终止。他们研究了 3 种类似
物 ：4- 甲 基 吲 哚 β-脱 氧 核 糖 核 苷（4-methylindole
β-deoxynucleoside）、1- 萘基 α-脱氧核糖核苷（1-na-
phthyl α-deoxynucleoside）和 1- 芘基 α-脱氧核糖核苷
（1-pyrenyl α-deoxynucleoside），结果只有 4- 甲基吲哚
β-脱氧核糖核苷在一定程度有所改善，但仍未完全
抑制产物异质［24］。1999 年，Kao 等［32，33］发现 DNA
模板链的 5 端两个碱基进行氧甲基化修饰能够明显
降低未端含单个多余碱基的转录产物的产生，但是
对含两个多余碱基的产物没有改善。而 Sherlin 等［34］
酶法合成 tRNA 时对模板链 5 端两个碱基进行 2-O-
甲基化修饰，获得可用于 X-射线晶体分析的 RNA
样品。可见，对线性转录模型的模板适当修饰可以
使初始转录物更接近准确产物，降低后续加工的
压力。
2.2 滚环转录模型
1989 年，Krupp［12］发现一种 SP6 和 T7 RNA 聚
合酶的新型转录模型，即滚环转录（Rolling circle
transcription，RCT）（图 3-A）。该模型以一种单链
未成环的 DNA（5-GCATATTTTAAAGTAATATCGTC-
CA-3）为转录模板，自其 3 端第一个 C 起始转录，
到 达 5 末 端 后 并 未 终 止， 而 是 以 DNA 的 3 端 为
模板继续转录，形成绕环，这是滚环转录的最初
模型。猜测可能的机制是链内部分氢键作用拉近
了模板链 3 末端与 5 末端，形成一个近似的连接
端和单链环。1995 年，Daubendiek 等［35］报道了一
类化学合成的单链环状 DNA 模板的转录模型，图
3-B 所示为其最初所用的 34 nt DNA 环状模板，该
模板环内无连续互补序列，几乎不可能形成双螺
旋的二级结构，最终能够合成 12-260 次绕环的转
录产物。之后，该研究团队探索了不同大小（63
nt/73 nt/83 nt）的环状 DNA，发现它们均能够实现转
录［31，36］。值得注意的是，这些转录的模板都没有启
动子序列。关于单环模板的转录起始机制尚无定论，
猜测在缺失启动子的情况下，双链上的突环、泡状
结构（bubble）、缺口（gap）和发卡（hairpin）结构
都有可能引发转录的起始［30，37，38］，DNA 单环的构
型如何引发 RNA 聚合酶起始转录还需进一步研究。
研究者已将该方法成功地应用到 RNA ladder 的制作、
纳米环载体的构建以及具有催化活性的 RNA 合成等
方面［31，36，39］。2015 年，Wang 等［40］建立了一种基
于滚环模型的 RNA 合成方法——滚环转录 - 特异位
点断联法（RCT-site-specific disconnection）（图 3-C），
该方法以目的 RNA 的互补 DNA 链为模板，首先以
T4 DNA 连接酶联合一条短链 DNA splint 将模板链连
接成环，并同时以该 splint 为引物引发高效率的滚
环转录，合成的初始 RNA 产物是目的 RNA 的多串
联产物，然后经后续特异位点切割处理，形成最终
产物。 ⁑ᶯ 䖜ᖅӗ⢙
KruppᨀࠪⲴ┊⧟䖜ᖅ⁑ර
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circle 1
C
B
A
circle 2
T7 RNA㚊ਸ䞦
T4 DNA䘎᧕䞦 ཊᤧ䍍Ѣ㚄RNAཊᤧ䍍Ѣ㚄RNA
ॆᆖਸᡀⲴ⧟⣦DNA⁑ᶯ NTPs
［12］
［35］
［40］
A ：Krupp 提出的滚环转录模型 ；B ：以化学合成的单链 DNA 环为模板的滚
环转录模型 ；C ：引物起始的滚环转录模型
图 3 滚环转录模型
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.348
3 初始转录物的加工技术
不同的转录模型产生的初始转录物特性不同。
对于启动子 - 线性转录模型，由于其具有转录起始 5
端富嘌呤依赖性和 3 端产物异质性，往往对模板进
行加长设计，转录后形成 5 和 3 端附含有外序列的
初始 RNA 产物，需将这些多余的序列切除。对于滚
环模型，它的初始转录产物是目标 RNA 的串联产物，
需要在 RNA 单体首尾连接处进行特异位点剪切。所
以，大部分初始转录物需用 ribozyme、DNAzyme 和
RNase H 等进行酶切处理，以获得准确的 RNA 产物。
3.1 Ribozyme 特异位点酶切
Ribozyme 在酶法合成 RNA 研究中的应用相对
较多。Wichłacz［41］小组为了解决转录终产物 3 异
质的问题，设计的模板链 5 端比目的产物长 7 nt，
采 用 trans-acting antigenomic delata ribozyme 识 别 并
剪切掉这 7 nt 多余序列。Price 等［42］在转录产物序
列前后分别设计了一个 hammerhead ribozyme，能够
对转录产物两端分别进行自剪切，从而获得准确的
RNA 产物，并应用到 RNA-蛋白复合体的结晶分析。
Walker［43］小组在启动子 - 线性转录模型的基础之
上，构建了一个可常规应用的质粒载体，在目的模
板的上下游分别插入一个 hammerhead ribozyme 和一
个 hepatitis delta virus ribozyme 相对应的模板，初始
转录产物左右两端的 ribozyme 分别发挥自剪切功能，
形成所需的 RNA 产物。这种方法需要的模板较长，
设计时需考虑较多，不适于大宗的 RNA 生产。更有
意思的是，Daubendiek 等［31］在滚环转录模型的应
用中将 ribozyme 设计到环形 DNA 模板中，获得的串
联转录物中的 ribozyme 能够进行特异位点自剪切而
形成 ribozyme 的单体。
3.2 DNAzyme特异位点酶切
同 ribozyme 类似，DNAzyme 也可以进行特异性
剪切。DNAzyme 的序列组成包括一个活性中心和两
条用于识别底物的结合臂。目前应用于 RNA 加工
处 理 较 多 的 是 8-17 和 10-23 DNAzyme 两 种［44-47］。
Sohail 等［48］用 8-17 DNAzyme 定点剪切初始转录物 5
端多余序列，获得的目的 siRNA 可成功用于 MDA-
MB-231 人类乳腺癌细胞 I 型胰岛素样生长因子受体
（IGF1R）mRNA 的 RNAi 研 究。Cheong 等［27］ 借 助
于 DNA 亲和色谱建立了一种制备 RNA 样品的方法，
即转录后得到的初始转录物相对于目的产物序列 3
端含有一段多余序列，这段多余序列是与亲和色谱
柱结合的亲和标签，经过亲和分离纯化后采用 10-
23 DNAzyme 对其剪切加工，再经 DNase I 水解 10-
23 DNAzyme 获得目的 RNA 产物。但是，DNAzyme
的剪切特性具有序列偏好性且剪切效率差异较大，
譬如 10-23 DNAzyme 偏好剪切 5- 嘌呤 - 嘧啶 -3 之
间的磷酸二酯键（5…R ↓ Y…3，R=A 或 G，Y=U
或 C， 其 中 R 不 形 成 碱 基 配 对，Y 必 须 与 10-23
DNAzyme 形成碱基配对），而 8-17 DNAzyme 主要识
别 5…A ↓ G…3，断裂 A 与 G 之间的磷酸二酯键［49］。
所以核酶特异位点剪切的加工方法在通用性上有其
局限性。
3.3 RNase H 特异位点酶切
目前为止，还没有发现能够识别 RNA 序列的限
制性内切酶。RNase H 是一类核酸内切酶，能够水
解 RNA-DNA 杂合子中 RNA 的磷酸二酯键，而不水
解双链 RNA 或单链 RNA。而 1987 年，Inoue 等［50］
发现 RNase H 能识别双链 RNA-DNA 杂合子中 3 个
连续 2-O-甲基化修饰的核苷酸和连续 4 个无修饰的
核苷酸的序列，从而只切割 2-O-甲基化修饰和无修
饰核苷酸之间的磷酸二酯键。之后，氧甲基化修饰
的 DNA 被应用于辅助 RNase H 特异位点剪切，包括
RNA 转录产物的加工处理中［51］。Miller 等［52］设计
转录了一个 3 端加长 25 nt 序列的初始 tRNALys，3 产
物，采用氧甲基化修饰的 DNA 辅助 RNase H 对其
进行特异酶切，结果证明该方法酶切的产物与化学
合成的 tRNALys，3 大小一致。Wang 等［40］对该技术
中 DNA 氧甲基化修饰的参数进行了优化，结合滚环
转录和 RNase H 的特异位点酶切实现了 miRNA 的准
确合成，可得到 DNA 模板 4×103 倍以上的 miRNA，
是目前最具潜力的酶法合成 RNA 方案之一。
4 结语
高效、准确的 RNA 合成方式是 RNA 相关研究
的基础和根本，目前已有的转录和加工技术已经能
够合成准确的 RNA 材料，研究者可根据研究需求选
择合适的合成方案。相对于化学合成法，酶法合成
具有技术门槛低、成本低和反应条件温和等优势，
2016,32(3) 49王静等：酶法合成 RNA的相关技术研究进展
然而，在特殊碱基修饰和序列通用性两个方面仍难
以满足研究需求。就目前而言，对于特定碱基的基
团修饰基本上只能依赖于化学合成，酶法合成难以
实现。酶法合成的通用性相对较低，主要原因在于
不同目的 RNA 的转录起始效率和剪切效率都因序列
位点不同而存在较大差异，需要有针对性地进行设
计和优化，对于多种 RNA 的合成负担相对较大。因
此，应针对转录和加工过程中的序列反应特性进一
步研究。
此外，由于酶法合成需要进行加工处理才能获
得准确的 RNA 产物，相对增加了制备的成本和产物
降解的风险，根本问题还是在于 T7 和 SP6 RNA 聚
合酶的转录特性。2007 年，科学家们对一种海洋蓝
细菌的噬蓝藻体 Syn5 进行基因组测序、蛋白结构分
析［53，54］，成功纯化获得 Syn5 RNA 聚合酶，2013 年
报道发现该聚合酶具有较显著的转录优势 ：（1）对
转录初始碱基富嘌呤的偏好性明显低于 T7 RNA 聚
合酶 ；（2）不具有在准确转录产物 3 端添加任意碱
基的能力，能够形成准确的转录物［55，56］。这无疑是
一项重要的发现，但仍需对其转录的准确性进一步
验证。在酶法合成方面，分子技术仍有可能继续改
进其高效性和准确性，所以期待更为高效、低耗的
酶法合成技术为 RNA 合成提供新途径，使 RNA 相
关研究得以更广泛地展开。
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（责任编辑 狄艳红）