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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):184-189
羧肽酶 G2（carboxypeptidase G2，CPG2）是羧
肽酶 G 家族成员之一，最初是从假单胞菌属（Pseu-
domonas）菌株 RS-16 中分离获得［1］。羧肽酶 G 可水
解叶酸及其衍生物的 C 端谷氨酸残基［2-4］。CPG2 在
物理特性与动力学特征上与羧肽酶 Gl（CPGl）类似，
但其对 MTX 的亲和力要高于 CPGl。
CPG2 全序列为 415 个氨基酸，其中包含一个
25 个氨基酸的信号肽序列和 390 个氨基酸的成熟
蛋白序列。CPG2 活性分子为同源二聚体，分子量
83 kD-84 kD，催化活性需 Zn2+。最初 CPG2 的制备
是 RS-16 发酵而来，表达量仅为 200-300 U/L，且
CPG2 表达量低于菌体总蛋白的 0.1%，不能满足研
发的需要［5，6］。因此，用基因工程的方法生产重组
羧肽酶 G2 是另一选择。
CPG2 分子无糖基化和二硫键，用原核系统表
达是首选。近年 CPG2 基因已用基因工程的方法表
达重组 CPG2［7，8］。在原核系统中表达量最高可占菌
体总蛋白的 20%［7，9，10］。CPG2 必须以二聚体形式
收稿日期 ：2015-07-02
作者简介 ：李树刚，男，博士生导师，研究方向 ：生物医学工程 ；E-mail ：kerunlsg@126.com
重组羧肽酶 G2 的原核表达、纯化及活性分析
李树刚1 王勇1 张伟1 辛渝1 但国平1 柴新娟1 龚会英1 于廷和2
（1. 重庆科润生物医药研发有限公司，重庆 401121 ；2. 重庆医科大学附属第二医院，重庆 400010）
摘 要 ： 在原核表达系统中实现羧肽酶 G2（Carboxypeptidase G2，CPG2）的表达，并对 CPG2 进行了纯化和活性测定。通
过 PCR 扩增得到编码 CPG2 的基因片段，利用基因重组技术构建原核表达质粒 pET-30a-CPG2，在 Escherichia coli 中进行诱导表达，
菌体经超声破碎后利用金属螯合亲和柱和阴离子交换层析柱对目标蛋白进行纯化。目的蛋白能够以可溶形式表达，SDS-PAGE 和
Western blotting 检测有特异的蛋白表达条带。纯化的 CPG2 有降解氨甲喋吟（MTX）活性，酶活力达到 400 U/mg。
关键词 ： 羧肽酶 G2 ；原核表达 ；纯化 ；氨甲喋吟
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.029
Prokaryotic Expression，Purification and Activity Analysis of
Recombinant Carboxypeptidase G2
LI Shu-gang1 WANG Yong1 ZHANG Wei1 XIN Yu1 DAN Guo-ping1 CHAI Xin-juan1
GONG Hui-ying1 YU Ting-he2
（1. Chongqing Kerun Biopharm R&D Co.，Ltd.，Chongqing 401121 ；2. The Second Affiliated Hospital， Chongqing Medical
University， Chongqing 400010）
Abstract: This work is to express carboxypeptidase G2（CPG2）in prokaryotic expression system，purify it and detect its activity in
vitro. The gene fragment encoding CPG2 was amplified by PCR，and the prokaryotic expressed plasmid pET-30a-CPG2 was constructed by gene
recombinant technology，then it was transformed into Escherichia coli BL21（DE3）for the expression with induction. The target protein from
grounded cells was purified by metals chelating affinity chromatogram and anion-exchange chromatography. Majority of the fusion protein was
expressed in soluble form，and its specificity was confirmed via SDS-PAGE and Western blotting. The preliminary experimental result showed
that the recombinant protein degraded MTX，and the specific activity reached 400 U/mg.
Key words: CPG2 ；prokaryotic expression ；purification ；MTX
2016,32(3) 185李树刚等：重组羧肽酶 G2 的原核表达、纯化及活性分析
存在才具有完全的生物学活性［11］。所以，在大肠杆
菌中以可溶形式表达 CPG2 并能够自发形成二聚体，
是大肠杆菌表达 CPG2 必须考虑的因素。
为了进一步提高 CPG2 的表达水平，获得有活
性的目的蛋白，满足研发的需要，实验通过基因工
程的方法在大肠杆菌中高效表达 CPG2 蛋白，并对
其酶学活性进行初步研究，旨在为 CPG2 的临床应
用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 和 载 体 Escherichia coli DH5α 和 BL21
（DE3）、表达载体 pET-30a 为本公司保存。
1.1.2 工具酶、引物和试剂 限制性内切酶、T4
DNA 连 接 酶 和 Taq 酶 等 购 自 大 连 TaKaRa 生 物 工
程 有 限 公 司 ；PCR 引 物 由 上 海 Sangon 公 司 合 成 ；
PCR 产物纯化试剂盒、DNA marker、蛋白质 marker、
YNB、生物素、酵母粉、蛋白胨、卡那霉素、EZ-10
Spin Column DNA Gel Extraction Kit、鼠抗 His 单克隆
抗体（一抗）、羊抗鼠 HRP-IgG（二抗）、牛血清白
蛋白（BSA）购自上海 Sangon 公司 ；其他化学试剂
均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物及基因合成 根据 GenBank 登录的 CPG2
基因序列（登录号 ：M12599）进行基因合成（上海
生工完成）。设计一对扩增 CPG2 cDNA 的特异性上
下游引物，上游引物 CPG2-F 中引入 Bgl II 酶切位点，
下游引物 CPG2-R 引入 Not Ⅰ酶切位点，引物由上
海 Sangon 合成（表 1）。
表 1 扩增目的基因 CPG2 的 PCR 引物
引物名称 引物序列（5-3） 大小 /bp
CPG2-F
TGAAGATCTGGACGACGACGACAA-
GCAGAAGCGCGACAACGTG
43
CPG2-R
ATAGTTTAGCGGCCGCTCACTTACC-
TGCACCCAGATC
37
注 ：划线部分为酶切位点
1.2.2 pET-30a-CPG2/BL21（DE3）原核表达菌株的
构建和鉴定 以人工合成的 CPG2 为模板，CPG2-F
和 CPG2-R 为引物，PCR 扩增该序列，引入 Bgl II
酶切位点、肠激酶切割位点（DDDDK）和 Not I 酶
切位点。1% 琼脂糖凝胶电泳后，切胶纯化回收。将
纯化的目的基因片段与 pET-30a Bgl II 和 Not Ⅰ酶切
回收后，16℃连接过夜，转化 DH5α 感受态细胞，
提取质粒后双酶切鉴定，证明目的基因片段已正确
插入 pET-30a 载体 ；质粒经上海 Sangon 测序，测序
正确的重组质粒命名为 pET-30a-CPG2。重组质粒转
化 BL21（DE3）。
1.2.3 CPG2 在 E.coli BL21（DE3）中的重组表达
挑取工程菌 pET-30a-CPG2/BL21（DE3）接种到 20
mL LB（Kan 50 μg/mL）液体培养基中，37℃，250
r/min，培养过夜。次日，按 1% 的比例接种母液到
200 mL LB（Kan 50 μg/mL）液体培养基，37℃，250
r/min 培养，OD600 达到 0.6 后，加入 IPTG 至终浓度
为 0.4 mmol/L，30℃继续诱导表达 4 h。将摇瓶置于
冰上 5 min，5 000×g，4℃，离心 5 min 收集菌体。
1.2.4 CPG2 蛋白纯化 发酵液菌体按 1∶5（W/W）
悬 浮 于 裂 解 液（20 mmol/L Tirs-HCl，0.2 mmol/L
Zn2+，pH8.0） 中， 超 声 破 壁，8 000 r/min 离 心
5 min 收 集 上 清 ；破 菌 液 上 清 上 样 于 经 0.2 mol/L
NiSO4 处理并以 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）平衡的
Ni2+Chelating Sepharose Fast Flow 鳌合层析介质，分别
以 50 mmol/L 和 100 mmol/L 咪唑（含 20 mmol/L Tris-
HCl，pH8.0）洗脱，目的蛋白集中于 100 mmol/L 咪
唑洗脱部分 ；收集的目的蛋白以截留分子量 l0 kD
离心超滤管超滤脱盐，置换缓冲为 25 mmol/L Tris-
HCl（ 含 0.2 mmol/L Zn2+，pH8.0），lowry 测 定 蛋 白
浓度，按每 1 mg 蛋白加入 0.5 U 肠激酶（50 mmol/L
Tris-HCl，2 mmol/L CaCl2，0.1% Tween-20，pH8.0）
在 4℃条件下酶切融合蛋白约 16 h ；酶切目的蛋白
上样于 25 mmol/L Tirs-HCl（pH8.5），0.2 mmol/L Zn2+
平 衡 的 Q-Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）， 用
25 mmol/L，Tris-HCl（pH8.5）缓冲液再冲洗 5-6 个
柱床体积后，用 50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）洗脱
杂蛋白，再以 0.1 mol/L Tris-HCl，pH7.5，0.2 mmol/L
Zn2+ 一次性洗脱目的蛋白，收集洗脱蛋白峰。SDS-
PAGE 检测分子量约为 42 kD，纯度大于 95%。
1.2.5 免疫印迹分析 纯化的带有 His 标签的融合
蛋白经 SDS-PAGE 分离后电转至 PVDF 膜上，用 5%
脱脂奶粉封闭 2 h，滴加鼠抗 His 一抗（1∶300）（上
海生工），4℃孵育过夜，TBST 洗膜 3 次，再滴加
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3186
HRP 标记的羊抗鼠抗体（1∶1 000）（上海生工），
37℃孵育 2 h，TBST 和 PBS 各洗膜 3 次，用滤纸吸
干膜表面。利用 DAB 试剂盒进行显色。
1.2.6 生物活性分析 取 2.82 mL 0.l mol/L Tris-HCl，
pH7.3，0.2 mmol/L ZnCl2， 加 入 180 μL 1 mmol/L 氨
甲蝶吟（MTX，中国药品生物制品检定所）。用蒸馏
水调零。快速加入 50 μL 标准品或待测样品（适当
稀释，含 0.03-0.06 U 羧肽酶），混匀，倒入比色杯
中于 320 nm 处测其吸光值，间隔 15 s 检测一次。记
录吸光值变化。
1.2.7 羧肽酶 G2 酶学性质的研究 （1）最适酶活反
应温度 ：实验在 pH7. 5，反应时间为 30 min 时分别
测 定 4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、
45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃及 75℃时的
酶活。（2）最适酶活反应 pH ：测定羧肽酶 G2 酶液
在不同 pH 值的缓冲液中酶活力，确定 pH 值对羧肽
酶 G2 酶活力的影响。温度为 37℃，反应时间为 30
min 时，分别测定 pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、
9.0 和 10.0 时的酶活性，以确定最佳反应 pH 值。
2 结果
2.1 表达载体pET-30a-CPG2的构建与鉴定
以人工合成的 CPG2 基因序列为模板，PCR 法
扩增该序列，并引入 Bgl II 和 Not Ⅰ酶切位点及肠
激酶酶切位点，回收 DNA 片段长度约 1 200 bp。将
Bgl II/Not Ⅰ酶切的 PCR 产物插入 pET-30a，成功构
建 pET-30a-CPG2 原核表达载体，并转化至 E. coli
DH5α 感受态细胞。菌落 PCR、质粒酶切图谱（图
1-A）及测序结果显示 pET-30a-CPG2 重组质粒构建
成功。
2.2 重组融合蛋白CPG2的表达
将 pET-30a-CPG2 表达载体转入感受态的 E. coli
BL21（DE3）宿主菌，涂布 LB 平板，经菌落 PCR
扩增出 1 200 bp 片段的菌落为阳性克隆（图 1-A），
双酶切重组质粒表明能获得阳性目的片段（图 1-B）。
将 pET-30a-CPG2/BL21（DE3） 经 37℃ 培 养 的 菌 液
OD600 达到 0.6-0.8 时，加入终浓度为 0.4 mmol/L 的
异丙基硫代 -β-D-半乳糖苷（IPTG），30℃诱导目的
蛋白表达，收集菌体，并进行 SDS-PAGE 检测。结
果（图 2）显示，与诱导前相比，IPTG 诱导之后在
43 kD 附近有一条明显的蛋白条带，与融合蛋白理
论分子量相当。菌体经超声波破碎后离心，分别取
上清和沉淀进行 SDS-PAGE 分析。结果（图 2）表明，
CPG2 以可溶的形式表达。
bp
5000
1500
1000
250
100
1A 2
bp
5000
3000
2000
1000
750
500
1 2B 3 4
A ：PCR 分析 BL21（DE3）阳性转化子，其中 1 ：DL5000 DNA marker，2 ：
pET-30a-CPG2/BL21（DE3）cDNA。B ：PCR 和 限 制 酶 酶 切 鉴 定 pET-30a-
CPG2，1 ：DL5000 DNA marker，2 ：Bgl II 酶切 pET-30a-CPG2，3 ：Not I 酶切
pET-30a-CPG2，4 ：Bgl II/Not I 酶切 pET-30a-CPG2
图 1 重组表达质粒 pET-30a-CPG2 和 BL21（DE3）阳性
转化子的鉴定
kD
97
66
45
35
27
20
14.4
M 1 2 3 4 ⴞⲴ㳻ⲭ
M：蛋白质分子量标准；1：诱导前全菌蛋白；2：诱导后全菌蛋白；3：包涵体；
4 ：破菌上清
图 2 CPG2 蛋白在大肠杆菌 BL21（DE3）中诱导表达的
SDS-PAGE 检测
2016,32(3) 187李树刚等：重组羧肽酶 G2 的原核表达、纯化及活性分析
2.3 CPG2重组蛋白的纯化与鉴定
菌体裂解后的上清，经过组氨酸亲和层析和阴
离子交换层析，并经 Sephadex G-25 凝胶过滤层析脱
盐、过滤除菌后就得到 CPG2 蛋白原液。通过该纯
化工艺，可以获得纯度大于 95% 的 CPG2 蛋白。纯
化过程中 CPG2 蛋白产物的纯度分析（图 3-A），目
的蛋白分子量约为 42 kD。Western blotting 结果（图
3-B）表明，CPG2 融合蛋白可与鼠抗 His 发生特异性
反应。
2.5 CPG2酶学性质的测定
2.5.1 最适反应温度 最适酶活反应温度在 pH7.5
的条件下、用 UV 法测定 4℃、16℃、25℃、30℃、
35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、
65℃、70℃和 75℃下的 CPG2 的酶活性，通过 3 次
平行试验，取平均值，绘制曲线如图 5。酶的最适
温度为 37℃，在温度为 30℃-40℃范围内，酶活性
保持在 80%-100%，当温度高于 55℃时，酶活性急
剧下降至 60%，到 60℃以后，酶活性急剧下降接近
为 0。
kD
97
66
45
35
27
20
14.4
kD
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
M2 11
M11 2 3 4 5 6 7 8 9 10A
B
M1 ：Protein Marker，Mid Range（97-14.4 kD）；M2 ：低分子量蛋白质 Marker
II（14.4-116kD）；1 ：出发样 ；2 ：穿透峰 ；3 ：洗脱峰 1 ；4 ：洗脱峰 2 ；5 ：
NaOH 洗脱 ；6 ：出发样（同 4 纯化样品）；7 ：穿透峰 ；8 ：洗脱峰 1 ；9 ：洗
脱峰 2 ；10 ：NaOH 洗脱 ；11 ：CPG2
图 3 融合蛋白 CPG2 的纯化结果（A）及 Western
blotting 检测（B）
2.4 CPG2重组蛋白的活性测定
用酶动力学方法对 CPG2 的活性进行了测定，
反应体系中最终加入酶量 0.1-1.0 U，检测 MTX 降
解率，以计算酶活性。定义 37℃条件下 1 min 内降
解 1 μmol MTX 所需要的酶量为 1 个活性单位（U）。
经检测，CPG2 原液比活性为 400 U/mg。随着 CPG2
浓度的上升，MTX 的裂解率也随之上升，两者成呈
剂量依赖关系（图 4）。
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.03
A
U
⎸߿
0.04 0.05ṧ૱⍫ᙗU 0.06 0.07
图 4 CPG2 剂量 - 反应曲线
100
80
60
40
20
0
R
el
et
iv
e
ac
tiv
ity
/%
0 20 40ᓖć 60 80
图 5 温度对羧肽酶 G2 活性的影响
2.5.2 最适酶活反应 pH 在最适温度 37℃下用 UV
法分别测定 pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0
和 10.0 的缓冲体系下酶活性，通过 3 次平行试验，
取平均值，绘制 pH 曲线，酶活情况由图 6 可见。
3 讨论
本研究将 CPG2 连接至原核表达载体 pET-30a
上，采用 IPTG 诱导 CPG2 融合蛋白的表达。pET-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3188
30a 原核表达载体具有两个显著特点 ：一是含有 T7
启动子，可被宿主细胞提供的 T7 RNA 聚合酶识别，
T7 RNA 聚合酶的转录效率比大肠杆菌 RNA 聚合酶
高 5 倍，能够高效转录 mRNA，实现融合蛋白的高
表达 ；二是载体上携带 His·Tag 和 S·Tag，诱导表
达的 43 kD 标签蛋白对目的蛋白的结构及生物学活
性影响很小，His·Tag 为蛋白纯化提供了亲和位点，
而且两者之间有肠激酶酶切位点，便于纯化后将标
签蛋白切除［12-15］。
在蛋白纯化过程中，首先采用 Ni2+ 柱进行亲和
层析，之后的 SDS-PAGE 分析出现 43 kD 的蛋白条
带。重组蛋白的理论等电点 pI 为 6.5，所用缓冲液
pH8.0，选择 Q 柱进行阴离子交换层析，最终获得目
的蛋白的纯度大于 95%。
羧肽酶 G2 可水解 MTX 成无毒的非活性代谢物
2，4- 二甲基 -N10- 甲基蝶吟酸（DAMPA）和谷氨
酸，两者可以通过肝脏代谢提供一个非肾的 MTX 清
除通道，减轻肾脏毒性［16，17］。目前，临床上 MTX
高剂量化疗所致的毒副作用，通常采用亚叶酸钙进
行解救。亚叶酸钙与 MTX 竞争进入细胞、靶组织（骨
髓、胃肠道上皮），阻止 MTX 的作用，补偿 DNA 合
成代谢途径，从而达到缓解 HD-MTX 引发的不良反
应。MTX 浓度升高时需要更高浓度的亚叶酸钙，但
大剂量亚叶酸钙同样可解救肿瘤细胞，降低抗肿瘤
效果。通过水化和碱化尿液增强 MTX 的水溶性来降
低肾毒性，可将毒性影响范围降低到 1.5%，但仍会
发生因清除延迟而致全身毒性。CPG2 是目前被证明
用于 MTX 大剂量治疗的特异性解救药，其可特异迅
速裂解 MTX，且不透过血 - 脑屏障（BBB）和细胞膜，
因而不会抵消细胞内 MTX 的作用。MTX 裂解产物
可在肝代谢，因此 CPG2 治疗实际上间接提供了一
种肝解毒途径［18］。
CPG2 还 被 用 于 抗 体 导 向 酶 - 前 药 疗 法
（ADEPT）［19-21］。ADEPT 是利用抗体作为载体携带
前药的专一性活化酶，选择性地结合于肿瘤部位，
使前药可以区域特异性地在肿瘤组织内转化为活性
细胞毒分子，起到专一杀伤肿瘤的作用［22，23］。高纯
度的 CPG2 为上述研究的深入进行提供了可能性。
4 结论
成功构建了 CPG2 原核表达体系，并纯化获得
了纯度较高的蛋白，初步证明其具有预期的生物学
活性。下一步将重点围绕 CPG2 蛋白的体内外活性
开展深入研究。
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100
80
60
40
20
0
R
el
et
iv
e
ac
tiv
ity
/%
5 6 7
pH
8 9 10
图 6 pH 对羧肽酶 G2 活性的影响
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（责任编辑 李楠）