全 文 ：第 32 卷 第 3 期 生 态 科 学 32(3): 290-297
2013 年 5 月 Ecological Science May. 2013
收稿时间：2012-09-20 收稿，2013-01-10 接受
基金项目：国家自然科学基金项目（41276154，41076093）
作者简介：江晓亮（1987—），男，硕士研究生，主要从事功能海域浮游细菌群落结构研究
*通讯作者：王朝晖，twzh@jnu.edu.cn

江晓亮, 王朝晖, 王剑, 熊毅俊, 林朗聪. 大亚湾海域可培养细菌鉴定及系统发育分析[J]. 生态科学, 2013, 32(3): 290-297.
JIANG Xiao-liang, WANG Zhao-hui, WANG Jian, XIONG Yi-jun, LIN Lang-cong. Identification and phylogenetic analysis of
culturable bacteria in Daya Bay[J]. Ecological Science, 2013, 32(3): 282-297.

大亚湾海域可培养细菌鉴定及系统发育分析
江晓亮, 王朝晖*, 王剑, 熊毅俊, 林朗聪
暨南大学水生生物研究所，广州 510632

【摘要】对大亚湾海域表层水体的可培养细菌进行分离，测定了分离培养细菌的 16S rRNA 基因 V3 区序列，并采用该研究中
的 35 个序列与从 GenBank 下载的 46 个序列构建了系统树，对细菌进行了分子鉴定。在 9 个站点的表层水体中共分离得到 70
株菌株，分属 35 个种。其中 α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）和放线菌纲（Actinobacteria）为分离菌株最多的两个菌纲，分
离率分别为 40%和 35.7%；而 β-变形菌纲（Betaproteobacteria）仅分离到 1 株（1.4%）。此外，还分离得到盖球菌属（Kytococcus）、
间胞囊菌属（Intrasporangium）等非常见菌株。大亚湾海域细菌的 Shannon-Wiener`s 多样性指数为 3.21。大亚湾海域表层水体
可培养细菌丰富的种类多样性以及较高的 α-变形菌分离率，说明了该海域具有良好的水质，同时也是潜在的微生物菌种资源库。
关键词：大亚湾；可培养细菌；16S rRNA 基因；系统发育分析
Doi：10.3969/j.issn.1008-8873.2013.03.005 中图分类号： 983 文献标识码：A 文章编号：1008-8873（2013）03-290-08
Identification and phylogenetic analysis of culturable bacteria in Daya Bay
JIANG Xiao-liang, WANG Zhao-hui, WANG Jian, XIONG Yi-jun, LIN Lang-cong
Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Abstract: Culturable bacteria were isolated from surface seawater in Daya Bay, and identified by means of 16S rRNA gene V3 region
sequences. A phylogenetic tree was constructed using 35 sequences in this study and 46 sequences from GenBank. Seventy bacterial
isolates were isolated and cultured from surface water of 9 stations in Daya Bay, which were classified into 35 categories. Within them,
40% belonged to Alphaproteobacteria, 35.7% to Actinobacteria, and 1.4% to Betaproteobacteria. Meanwhile, two genera, Kytococcus
and Intrasporangium, which were rarely reported, were also isolated. The value of Shannon-Wiener`s index was 3.21, indicating a
diversity of bacteria in Daya Bay. The high diversity of the culturable bacteria and abundance of Alphaproteobacteria suggested the
good water quality and the potential microbial resources in Daya Bay.
Key words: Daya Bay; culturable bacteria; 16S rRNA gene; phylogenetic analysis
3 期 江晓亮, 等. 大亚湾海域可培养细菌鉴定及系统发育分析 291
1 引言（Introduction）

海洋细菌，作为海洋生态系统的生产者和分解
者，在海洋生态系统的物质循环、能量流动、海洋
环境的稳定起着重要的作用[1, 2]，其数量和群落结构
可以反映海洋水体的营养水平、受污染程度，并可
对海洋环境具有一定的指示作用[3, 4]。在传统的研究
海洋细菌的培养法中，细菌的菌株形态特征可因环
境的不同而有所差异，因此无法对菌株进行准确鉴
定。随着分子生物学技术的发展，人们对海洋细菌
的研究开始转向基于 16S rRNA 基因序列测定的分
子方法[5, 6]，但因引物的偏向性，使 PCR 无法等同
扩增出所有细菌的目标序列，导致一些细菌序列的
遗漏。但是如果单单采用传统的形态学方法对细菌
进行分类鉴定，可能会由于资料的缺乏以及分类技
能的不熟练而导致分类错误。而将传统的培养法和
分子生物学方法相结合，能很好地解决这些问题。
大亚湾，是广东省重要的养殖基地,随着养殖面
积的不断增加以及其他人类活动的影响，导致海洋
环境出现了局部污染[7]。加之大亚湾和岭澳两座核
电站对冷却水排放，中海壳牌南海石化项目落户于
大亚湾以及船舶的频繁来往，导致大亚湾水体环境
错综复杂，海洋浮游细菌群落结构受到不同程度的
影响。陈明霞等[8, 9]对深圳海域弧菌的种类和数量进
行了分析，揭示了弧菌优势种类的季节性分布特征；
Jiang et al. [10]对大亚湾海域弧菌的动态变化进行了
研究，发现溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和肠炎
弧菌（Vibrio parahaemolyticus）为主要优势种；李
和阳等[9]对大亚湾海域的大辣甲岛附近的水域细菌
总数进行的评估，发现细菌总数可反映大范围海域
的水质状况。这些研究结果初步揭示了大亚湾某些
类别细菌群落结构以及细菌丰度，但并不能反映大
亚湾细菌的群落结构特征。本研究对大亚湾海域表
层海水中的可培养细菌进行分离，测定了细菌的
16S rRNA 基因 V3 区序列，并对其进行系统发育分
析。旨在了解大亚湾海域可培养细菌群落结构状况，
为大亚湾海域细菌的多样性分析提供科学依据，同
时也可丰富大亚湾微生物资源。

2 材料与方法 (Materials and methods )

2.1 样品采集
在大亚湾海域设置 9 个采样点（图 1），于 2012
年 6 月 1 日用 1 L 采水器采集了离表面 0.5 m 的表层
水样，样品放在冰壶中保存，在采集后 5 h 内运抵实
验室。

2.2 细菌的分离与培养
采集的样品混匀后吸取 1 ml 加入到盛有 9 ml 已
灭菌的海水试管中，反复吸打数次混匀，按同样步骤
稀释，得到 7 个不同的浓度梯度，分别为 10-1、10-2、
10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。将 10-4-10-7 四个浓度均
匀涂布于含 2216E 固体培养基的平板上，平板于恒温
培养箱 28 ℃培养，培养 5-7 天后对单菌落进行分离
纯化 2-3 次。
114°320"E
114°320"E
114°240"E
114°240"E
114°160"E
114°160"E
22
°3
2
0"
N
22
°3
2
0"
N
22
°2
4
0"
N
22
°2
4
0"
N
▲
▲
▲
▲
▲
▲
▲
▲
▲
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7 S8
S9
广州
香港●
●
深圳
Km
0 70 140
●
●
●
●
澳头镇
大鹏镇
大亚湾核电站
岭澳核电站

图 1 大亚湾采样点分布图
Fig. 1 Location of sampling stations in Daya Bay

2.3 单菌落 rRNA 基因 16S V3 区的 PCR 扩增
用灭菌的牙签挑取单菌落于含 100μl 去离子
水的离心管中，沸水浴 7 min，-20 ℃ 7 min，反复
循环 3 次后，10000 rpm/min 离心 10 min，吸取上清
液 4μl作为PCR模板。采用原核生物通用引物 341F
(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 907R (5′
-CCGTCAAATCMTTGAGTTT-3′)对细菌 rRNA 基
因 16S V3 区的保守序列进行 PCR 扩增，扩增体系
为 30μl，扩增体系中各组分含量为别为：10×buffer
3μl，dNTP 1μl，上下游引物各 0.3μl，Taq DNA
聚合酶 0.4μl，DNA 液 4μl，ddH2O 21μl。PCR
扩增反应程序：95 ℃ 4 min，(95 ℃ 30s，57 ℃
30s，72 ℃ 40s) × 32 个循环，72 ℃ 7 min，4 ℃
生 态 科 学 Ecological Science 32 卷 292
∞。扩增产物用 1%琼脂糖凝胶进行检测，用 10 000×
的 gelgreen 进行染色。PCR 扩增产物由深圳华大基
因科技有限公司测序，测序长度在 550 bp 左右。

2.4 菌株的分类鉴定
在 GenBank 上下载了 46 株相近序列，将本研
究中得到的 35 个序列与之进行比较，计算出相似性
与遗传距离。菌株间的相似度大于 97%表示相同的
种，在 93%-97%间表示相同的属，小于 93%表示不
同的属[11]。据此把序列相似度在 97%的来自不同站
位点的菌株视为同一分类单元。

2.5 系统发育树的构建
所测序列在 NCBI 上进行 Blastn 比对，下载相
似度最高的相关菌株的 16S rRNA基因 V3区序列，
用 MEGA 5.0 (Molecular Evolutionary Genetics
Analysis) 软件包聚类分析,根据 Kimura 两参数法
[12]计算进化距离，构建 N-J 系统树，自举值(bootstrap)
为 1000。

2.6 分析与计算
2.6.1 可培养细菌的多样性分析
以细菌的分离鉴定为依据，把分成的 35 个分类
单元按照 Shannon-Wiener`s 指数[13]（H）公式对细
菌多样性进行分析，多样性指数公式：
i
n
i
i PPH ln
1
∑
=
−=

式(1)中，n 为分类单元数目，Pi 为分类单元 i 的个
体占所有分离菌株的比例。
2.6.2 细菌的分离率
分离率为分离的某一类菌株数占分离的总菌株
数的百分比。

3 结果与分析 (Results and analysis)

3.1 菌株的分离鉴定
根据对大亚湾表层海水浮游细菌在 2 216 E 培
养基上的菌落形态的不同，从 9 个采样点中分离出
70 株细菌，测序所得序列长度在均 500 bp 左右。根
据各菌株 16S rRNA 基因 V3 区序列与 GenBank 中
已知序列的相似性，本研究中分离的 70 株细菌分属
于 35 个分类单元，同一单元的细菌归为一条序列，
共获得 35 条不同的序列，以 DYWn 进行编号（其
中 n 为 1-35 中的一个自然数）。
由图 2 可知，分离的菌株中，以α-变形菌纲
（Alphaproteobacteria）（28 株，14 条序列）和放线
菌纲（Actinobacteria）（25 株，9 条序列）为分离率
最高的两类菌株，其分离率分别为 40%和 35.7%；
γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）分离到了 11
株（9 条序列），分离率为 15.7；厚壁菌门（Firmicutes）
分离到 5 株（3 条序列），分离率为 7.1%；而β-变
形菌纲（Betaproteobacteria）仅分离到 1 株（1 条序
列）菌株，分离率为 1.4%。
表 1 列出了本研究中分离得到的菌株与
GenBank 中相似菌株 rRNA 基因 V3 区序列的相似
度，序列 DYW9（1 株）、DYW10（9 株）与鲁杰
氏菌属（Ruegeria sp.，NC008044）序列的相似度在
96%以上，可认为它们属于鲁杰氏菌属，该属菌株
共分离 10 株，共占总菌株数的 14.3%，是本研究中
分离率最高的一类菌株；其次是序列 DYW31（8
株）、DYW32（1 株），与节杆菌属（Arthrobacter sp.，
NC018531）相似度在 93%-97%，序列 DYW35（7
株）与粪短状杆菌（Brachybacterium faecium，
NC013172）相似度为 99%，两类菌株数分别占总菌
株数的 12.9%和 10.0%；而序列 DYW16（2 株）、
DYW17（1 株）与麦氏交替单胞菌（Alteromonas
macleodii，NC018692）序列的相似度为 99%、93%，
可认为隶属于交替单胞菌属；序列 DYW23（1 株）、
DYW24（2 株）与斯氏假单胞菌（Pseudomonas
stutzeri，NC009434）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas
aeruginosa，NC018080）序列的相似度为 99%、
100%，分别为斯氏假单胞菌和铜绿假单胞菌；序列
DYW26（1 株）、DYW27（3 株）和序列 DYW25
（1 株）与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium，
NC017138 和 NC014103）和短小芽孢杆菌（Bacillus
pumilus，NC009848）序列的相似度为 99%、96%
和 99%，可认为它们分别属于巨大芽孢杆菌、芽孢
杆菌属和短小芽孢杆菌；序列 DYW33（4 株）与藤
黄微球菌（Micrococcus luteus，NC012803）序列的
相似度为 100%，为藤黄微球菌。序列 DYW2（2
株）与人苍白杆菌（ Ochrobactrum anthropi ，
NC009668）序列的相似度为 100%，序列 DYW28
（1 株）与不动盖球菌（Kytococcus sedentarius，
NC013169）序列的相似度为 100%，可认为它们分
别是人苍白杆菌和不动盖球菌。但也有个别相似度
（1）
3 期 江晓亮, 等. 大亚湾海域可培养细菌鉴定及系统发育分析 293

表 1 分离自大亚湾海域的菌株与 GenBank 上相似菌株 16s rRNA 基因 V3 区序列的相似度
Table 1 The identities between strains isolated from surface seawater in Daya Bay and the nearest related sequences from
GenBank based on V3 region of 16S rRNA gene
序列编号
sequence
studied
目
Order
科
Family
最接近序列
The nearest related sequence (accession No.)
出现的站
位点
stations
相似度
Identity (%)
菌株数
No. of
isolates
DYW1 Caulobacterales Caulobacteraceae Caulobacter segnis (NC010338) 1,2 95-96 2
DYW2 Rhizobiales Brucellaceae Ochrobactrum anthropi (NC009668) 3,6 100 2
DYW3 Phyllobacteriaceae Mesorhizobium opportunistum (NC015675) 6 95 1
DYW4 Polymorphum gilvum (NC015259) 9 99 1
DYW5 Ketogulonicigenium vulgarum ((NC017384) 6 96 1
DYW6 Phaeobacter gallaeciensis (NC018286) 5 97 1
DYW7 Pseudovibrio sp. (NC016642) 5 100 1
DYW8 Roseobacter denitrificans (NC008209) 4 98 1
DYW9 Ruegeria sp. (NC008044) 1 96 1
DYW10
Rhodobacterales Rhodobacteraceae
Ruegeria sp. (NC008044) 3,4、6-9 >=97 9
DYW11 Erythrobacteraceae Erythrobacter litoralis (NC007722) 2,4,8 >=98 3
DYW12 Novosphingobium sp. (NC008048) 1,4 96 2
DYW13 Sphingobium japonicum (NC014013) 1 96 1
DYW14
Sphingomonadales
Sphingomonadaceae
Sphingopyxis alaskensis (NC008048) 1 99 2
DYW15 Burkholderiales Alcaligenaceae Pusillimonas sp. (NC015458) 3 95 1
DYW16 Alteromonas macleodii (NC018692) 5,8 99 2
DYW17 Alteromonas macleodii (NC018692) 7 93 1
DYW18
Alteromonadaceae
Marinobacter adhaerens (NC017506) 7 97 1
DYW19
Alteromonadales
Idiomarinaceae Idiomarina loihiensis (NC003910) 7 96 1
DYW20 Chromohalobacter salexigens (NC007963) 4 99 1
DYW21
Halomonadaceae
Halomonas elongate (NC013369) 4 95 1
DYW22
Oceanospirillales
Oceanospirillaceae Marinomonas mediterranea (NC015276) 7 92 1
DYW23 Pseudomonas stutzeri (NC009434) 1 99 1
DYW24
Pseudomonadales Pseudomonadaceae
Pseudomonas aeruginosa (NC018080) 2,7 100 2
DYW25 Bacillus pumilus (NC009848) 1 99 1
DYW26 Bacillus megaterium (NC017138) 1 99 1
DYW27
Bacillales Bacillaceae
Bacillus megaterium (NC014103) 4,8 96 3
DYW28 Actinomycetales Dermabacteraceae Kytococcus sedentarius (NC013169) 2 100 1
DYW29 Brachybacterium faecium (NC013172) 2,4-6 99 7
DYW30 Intrasporangiaceae Intrasporangium calvum (NC014830) 9 99 1
DYW31 Microbacteriaceae Microbacterium testaceum (NC015125) 4 99 1
DYW32 Arthrobacter sp. (NC018531) 1-2,5-9 93-95 8
DYW33 Arthrobacter sp. (NC018531) 4 97 1
DYW34
Micrococcaceae
Micrococcus luteus (NC012803) 1,6,9 100 4
DYW35

Nocardioidaceae Nocardioides sp. (NC008699) 1,4 95-96 2
总计 70

生 态 科 学 Ecological Science 32 卷 294

与已知菌株序列相似度比较低的，如序列 DYW22
（ 1 株 ） 与 地 中 海 单 胞 菌 （ Marinomonas
mediterranea，NC015276）序列的相似度仅有 92%，
推 断 DYW22 可 能 是 海 洋 螺 菌 科
（Oceanospirillaceae）下的一个未知新属。

3.2 系统树和遗传距离分析
图 2 显示了本研究中的 35 个序列与 GenBank
上 46 株菌株的 16S rRNA 基因 V3 区序列构建的系
统发育树。从图 2 可以看出，这 81 条序列明显分为
5 个簇，分别为 α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌
纲、厚壁菌门以及放线菌门。其中 α-变形菌纲可分
为四个小簇，分别为柄杆菌目(Caulobacterales)、根
瘤菌目（Rhizobiales）、红杆菌目（Rhodobacterales）、
鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）4 个目。柄杆菌
目和鞘脂单胞菌目都以 100%的支持率形成一簇，
在 红 杆 菌 目 中 ， 序 列 DYW7 与 假 弧 菌 属
（Pseudovibrio sp.，NC016642）聚在一起，并独自成
一分支，余下的4条序列和GenBank上的4条序列相聚
后以 100%的支持率与序列 DYW9 形成一簇。分离得到
的放线菌门的细菌共8条序列（25株），由表1可知他们
分属于其中的 5 个科（表皮菌科(Dermabacteraceae)、
间 孢 囊 菌 科 (Intrasporangiaceae) 、 微 杆 菌 科
（Microbacteriaceae）、微球菌科（Micrococcaceae）、
类诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）），序列 DYW35
独为一科，图 2 也显示序列 DYW35 独自形成一簇，
说明它可能与其余 4 科在上一分类上出现分支，而
分类结果显示类诺卡氏菌科属于丙酸杆菌亚目
(Propionibacterineae)，而其余 4 科属于微球菌亚目
(Micrococcineae)。表 1 显示 DYW29 与 DYW28 同
属于表皮菌科，而图 2 则显示 DYW29 与 DYW32
聚成一簇，但因支持率都比较低（低于 50%），因
此 DYW29 的分类地位还有待进一步的确定。分离
得到的 γ-变形菌菌群隶属于其中的 5 科（交替单胞
菌 科 （ Alteromonadaceae ）、 源 洋 菌 科
（Idiomarinaceae）、盐单胞菌科（Halomonadaceae）、
海洋螺菌科（oceanospirillaceae）、假单胞菌科
（Pseudomonadaceae））7 属，虽然总菌株数不及 α-
变形菌纲和放线菌门，但相对种类比较多。β-变形
菌仅分离到 1 株，其序列与极小单胞菌属
（Pusillimonas sp.）及 Taylorella 属的序列以 100%
的支持率聚为一簇，说明其与极小单胞菌属和
Taylorella 属同隶属于伯克氏菌目（Burkholderiales）
的产碱菌科（Alcaligenaceae）。而分离的另一大类
厚壁菌门的 3 条序列均是芽孢杆菌属。

3.3 可培养细菌的多样性
分离细菌的 Shannon-Wiener`s 多样性指数为
3.21。

4 讨论 (Discussion)

本研究结果表明，大亚湾海域水体的α-变形菌
纲的分离率最高。研究人员对世界其他海域细菌的
研究发现，地中海沿岸表层水体[14]、东太平洋海域
[15]、太平洋中央海域[16]、北冰洋海域[17]以及北海海
域[15, 18]等细菌的优势群落均为α-变形菌纲。α-变
形菌通常被认为在寡营养水体里占优势 [19-21]，
Ling[22]对南海北部表层水体的细菌群落结构研究表
明，在硝酸盐和亚硝酸盐含量较低的水体里中，α-
变形菌纲的细菌较为丰富。因此在大亚湾海域分离
到较多的α-变形菌纲的细菌也在一定程度上说明
了大亚湾海域良好的水质。而在富营养水体里面，
β-变形菌纲更占优势[[22, 23]，而在大亚湾表层水体
里分离的β-变形菌纲菌株只有一株，进一步说明大
亚湾水质状况良好。γ-变形菌纲是大亚湾又一分离
较多的菌株，而其在世界其他海域也是优势群体
[24]。
芽孢菌属普遍存在于湖泊[25]、海洋[26, 27]、土壤
沉积物[28, 29]等各个环境中，易于分离。本研究中分
离得到的厚壁菌门的菌株全部为芽孢杆菌属，而芽
孢杆菌属对异养细菌和弧菌的生长和繁殖一定的抑
制作用[30]。本研究中，在大亚湾中并未分离到弧菌
属，可能与芽孢杆菌属的抑制作用有关。此外，在
大亚湾海域分离得到的玫瑰杆菌属（Roseobacter）、
鲁杰氏菌属、假单胞菌属、节杆菌属、微球菌属等
菌株是与烃类物质的降解有关[31, 32]。大亚湾海域拥
有国家一类对外开放的口岸—惠州港，而且南海石
化项目的建设与投产，导致水体石油等烃类物质含
量逐年上升[33]，导致了上述石油降价菌的出现。
本 研 究 中 还 分 离 得 到 了 一 种 海 源 菌 属
（Idiomarina），该菌株与热液海源菌（Idiomarina
loihiensis）的相似度较高（96%），说明它们为同一
种或者差异很小的同属菌类。由于大亚湾和岭澳核
3 期 江晓亮, 等. 大亚湾海域可培养细菌鉴定及系统发育分析 295

图 2 基于 16S rRNA 基因 V3 区目标序列与 Genbank 上已知相近的序列系统进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene V3 region of 35 sequences in this study and 46 nearest sequences
from GenBank
生 态 科 学 Ecological Science 32 卷 296

电站排水的运行，大亚湾海域的水温明显增加，特
别是核电站出口处的水温要比周围水温高３℃～５
℃[34]。因此该菌株的出现可能与核电站的冷却水的
排放有关，而且全球气候变化导致的高温也可能是
该菌株出现的重要原因。除此之外还有盖球菌属、
间胞囊菌属（Intrasporangium）均未见报道，它们
对海洋环境的指示作用尚是未知。而通过
Shannon-Wiener`s 指数计算得知大亚湾可培养细菌
的多样性为 3.21，比加拿大的雷索卢特湾[35]的香农
多样性指数（2.40）要高的多，说明大亚湾海域可
培养细菌多样性较高，种类比较丰富，同时也说明
还有很多的菌株我们都还未知，大量未知的微生物
资源有待发掘。
大亚湾海域中所包含的细菌种质资源丰富，限
于培养条件，能分离培养的细菌仅仅只是冰山一角，
若想对大亚湾海域细菌有更多的了解，需结合其他
方法，如变性梯度凝胶电泳（DGGE）、末端限制性
片段长度多态性（T-RFLP）技术、第二代测序等技
术结合，以获得对大亚湾海洋细菌多样性更全面的
了解。

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