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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):122-128
收稿日期 ：2015-05-19
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31260031），江西省科技重大专项基金项目（2014ACF60002），中科院开放基金项目（2014AEM003）
作者简介 ：彭晗，女，硕士，研究方向 ：昆虫病毒学 ；E-mail ：penghan0830@163.com ；王洪秀为本文并列第一作者
通讯作者 ：靳亮，男，博士，研究方向 ：昆虫病毒学 ；E-mail ：Jinliang079@163.com
万翠香，女，博士，副教授，研究方向 ：应用微生物学 ；E-mail ：cuixiangwan@ncu.edu.cn
马尾松毛虫质型多角体病毒非结构蛋白 p44 在 Bac-to-
Bac 系统中的表达和亚细胞定位
彭晗1  王洪秀2  王金昌3  关丽梅3  靳亮3  万翠香1
（1. 南昌大学生命科学与食品工程学院，南昌 330077 ；2. 江西省农业科学院农业应用微生物研究所，南昌 330200 ；
3. 江西省科学院微生物研究所，南昌 330029）
摘 要 ： 为探寻马尾松毛虫质型多角体病毒（DpCPV 1）p44 蛋白的功能，构建了 DpCPV 1 基因组 S8 片段的原核表达体系，
表达纯化蛋白后免疫家兔制备了多克隆抗体。利用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统，构建了 3 种重组的杆状病毒质粒（Bacmid-p44、
Bacmid-p44-eGFP 和 Bacmid-eGFP）。转染昆虫细胞 Sf9 进行表达，通过 Western blot 检测和蛋白的亚细胞定位观察。Western blot 检
测结果显示，Bacmid-S8 在昆虫细胞 Sf9 中表达实际蛋白的大小为 35 kD，比在原核系统中表达的蛋白（44 kD）略小 ；利用激光共
聚焦显微镜观察 p44-eGFP 的融合蛋白的亚细胞定位发现，融合 p44 的绿色荧光蛋白（eGFP）主要聚集在细胞质中，而未融合的
eGFP 则分布于整个细胞，说明 DpCPV 1 的 p44 蛋白定位于细胞质中。
关键词 ： 马尾松毛虫质型多角体病毒 ；多克隆抗体 ；真核表达 ；细胞定位
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.020
Expression of Dendrolimus puntatus Cytoplasmic Polyhedrosis Virus
（DpCPV1）Non-structural Protein p44 in Bac-to-Bac System and
Localization in Infected Cells
PENG Han1 WANG Hong-xiu2 WANG Jin-chang3 GUAN Li-mei3 JIN Liang3 WAN Cui-xiang1
（1. School of Life Sciences and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330077 ；2. Institute of Agricultural Applied
Microbiology，Jiangxi Agricultural Academy of Sciences，Nanchang 330200 ；3. Institute of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，
Nanchang 330029）
Abstract: In order to study the function of the Dendrolimus puntatus cytoplasmic polyhedrosis virus（DpCPV1）protein p44，PCR
primers were designed according to the sequence of genome segment S8，the prokaryotic expression vector for genome segment 8 of DpCPV1
was constructed，and the polyclonal antibodies were prepared by immunizing rabbits with the purified expressed protein. Three recombinant
plasmids（Bacmid-p44，Bacmid-p44-eGFP and Bacmid-eGFP）were constructed using Bac-to-Bac Baculovirus expression system.，and they
were transfected into insect cell Sf9 for the expression. The detection and subcellular localization of the protein were determined by Western
blot. The results from Western blot showed that the actual expressed protein of Bacmid-S8 in Sf9 was 35 kD，smaller than the one（44 kD）
expressed in the prokaryotic expression vector. The subcellular localization of fusion protein of p44-eGFP was determined by laser scanning
confocal microscope，and the fused green fluorescent protein（eGFP）of p44 concentrated in the cytoplasm of the cells，while infused eGFP
distributed throughout the whole cell，indicating that p44 protein of DpCPV1 was localized mainly in the cytoplasm of the cell. This work was
the first study of having the eukaryotic expression of DpCPV1 S8 and subcellular location of it in insect cells，
Key words: Dendrolimus puntatus cytoplasmic polyhedrosis virus ；polyclonal antibody ；eukaryotic expression ；cellular localization
2016,32(3) 123彭晗等：马尾松毛虫质型多角体病毒非结构蛋白 p44在 Bac-to-Bac 系统中的表达和亚细胞定位
昆虫质型多角体病毒（cypovirus，CPV）属于
呼肠孤病毒科，质型多角体病毒属。根据病毒基因
组 dsRNA 片段在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中电泳
图谱的差异，目前 CPV 已被分为 20 个电泳型［1，2］。
马尾松毛虫质型多角体病毒（dendrolimus punctatus
cytoplasmic polyhedrosis Virus 1，DpCPV 1）属于 1 型，
该病毒基因组 S8 片段编码一个由 390 个氨基酸组成、
分子量为 43.78 kD 的非结构蛋白（p44），是我国的
特有种类，于 1973 年首次分离得到［3］。
随着结构生物学与信息处理等新技术的运用与
发展，包括 X 射线晶体衍射、低温电镜与三维重构
技术，质型多角体病毒结构学研究方面已取得突破
性进展［4］。Yu 等［5］利用低温电子显微镜技术在分
辨率上研究了衣壳蛋白的三维结构，在与基因组直
接作用的区域中观察到螺旋与 β 发卡结构之间的构
象改变，同时发现了特有的加帽结构和释放通道。
Cheng 等［6］通过低温电子显微镜研究发现，CPV 的
五聚体塔状蛋白的酶区域是拓扑结构高度保守并且
有 5 个连接着鸟苷酰基转移酶和甲基转移酶区域的
独特的通道 ；通过氨基酸序列推理，LPP 是由 S7 片
段编码 P50 蛋白修饰后得到的。Yang 等［7］研究发
现 ：当 CPV 病毒粒子进行转录时，衣壳蛋白 VP1A、
VP1B 和塔状蛋白 VP3 构象发生变化，衣壳空间扩
大和塔状蛋白周围通道的加宽，使得基因组 RNA 从
紧凑的病毒粒子衣壳更加灵活的转录和输出。
相对 CPV 结构蛋白的深入研究，CPV 非结构
蛋 白 的 研 究 相 对 缓 慢。 文 力［8］、 张 万 菊［9］ 等 对
DpCPV 1 基因组中的第 9 片段（S9）的编码序列进
行了 cDNA 克隆和序列测定，并对 NS5 蛋白的表
达和功能进行了初步分析。汪洋等［10］研究发现由
DpCPV 基因组第 9 片段编码的非结构蛋白 NS5 蛋白
在感染昆虫细胞时，定位在昆虫细胞的细胞膜上。
段兵［11］和胡建芳等［12］对马尾松毛虫 CPV 基因组
第 8 片段进行序列分析和原核表达。凝胶迁移阻抑
分析（EMSA）显示，由 CPV 基因组第 8 片段编码
的 p44 蛋白具有序列非特异性的 ssRNA 结合活性，
不与 dsRNA、ssDNA、dsDNA 结合 ；进一步研究发
现 p44 氨基酸序列 116-197 aa 之间的区域（富含谷
氨酸区域）为单一的 RNA 结合区域［13］。
目前，质型多角体病毒 S8 片段编码的非结构蛋
白 p44 蛋白的真核表达和昆虫细胞上定位研究还未
见报道。本研究利用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统，
构建重组 Bacmid-S8-eGFP 和 Bacmid-S8，将 DpCPV
1 S8 片段和绿色荧光蛋白基因（eGFP）以 C 端融合
的方式在昆虫 Sf9 细胞中进行融合表达及细胞定位，
旨在为下一步非结构蛋白 p44 在 CPV 复制过程中的
功能研究提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系、菌种及质粒 草地贪夜蛾（Spodoptera
frugiperda）细胞系 Sf9 由中国科学院武汉病毒所昆
虫病毒基因工程学科组提供，于 27℃培养，生长培
养基为 Grace’s 昆虫细胞培养基（10% 胎牛血清）。
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21 和 DH10B
菌 株 均 为 本 实 验 室 保 存 ；载 体 pMD18-T vector 系
统、T4 DNA Ligase 及 其 buffer 购 自 宝 生 物 工 程
（ 大 连 ） 有 限 公 司， 载 体 pET-28a、pFastBacDual、
pFastBacDual-eGFP（GFP 片段插入在 Pst Ⅰ和 Hind
Ⅲ酶切为点之间）和 DpCPV 1 基因序列 S8 片段为
本实验室保存。
1.1.2 主要试剂 DM2000 DNA Marker 购自康为世
纪生物科技有限公司 ；DNA Marker Ⅲ购自东盛生物
科技有限公司产 ；预染蛋白 Marker 购自南京生兴生
物技术公司 ；异丙基 -β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）购
自武汉贝特生物公司 ；Ni-NTA His.BindTM Resins 购
自 Novagen 公司 ；其余药品均为国产分析纯以上。
转染试剂 lipofectin 购自 Invitrogen 公司（美国）；荧
光染料 Hoechst 33258 购自 Biosharp 公司（美国）；
PVDF 膜购自 Millipore 公司（美国）；PCR 纯化试剂
盒购自 Promega 公司（上海）；质粒提取试剂盒购自
Promega 公司（上海）。
1.1.3 引物合成 根据 DpCPV 1 基因组 S8 片段的
核苷酸序列，设计引物 ；除通用引物 M13F 和 M13R
（Cat. No. N530-02，Invitrogen 公司，美国）外，其
余引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合
成。引物列表，见表 1。
1.2 方法
1.2.1 以实验室保存的 DpCPV 病毒基因组 S8 为模
板，以 pTS8F、pTS8R 为引物，利用两步法进行 RT-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3124
PCR 扩增［14］。PCR 扩增的片段通过相应的酶切位点
酶切，连接到原核表达载体 pET-28a（pET28a-S8）。
将阳性重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞 BL21，1
mmol/L 的 IPTG 于 37℃诱导表达 4 h。收集菌体，经
超声破碎后离心，获得包涵体蛋白。用 8 mol/L 的
尿素溶液溶解包涵体蛋白，然后通过 Ni-NTA 树脂
柱进行蛋白纯化。将收集的洗脱流出液装入透析袋，
对含适量甘油的 0.01 mol/L PBS pH8.0 透析 48 h，每
4-8 h 更换一次 PBS 溶液。然后，将上述透析袋包
埋在聚乙二醇粉末中，对蛋白溶液进行浓缩。并为
下一步制备抗体做准备。
1.2.2 抗体制备 纯化的目的蛋白常规方法（淋巴
加皮下注射）免疫家兔，制备抗血清。实验兔、鼠
饲养，抗原注射及最终采血均委托武汉爱博泰克生
物科技有限公司进行。
1.2.3 重 组 Bacmid 病 毒 的 构 建 及 PCR 检 测 以
pFS8-1F、pFS8-1R 和 pFS8-2F、pFS8-2R 为 引 物，
以 pET28a-S8 载体为模板进行 PCR 扩增。将上述胶
回收的 S8 片段分别连接到 pFastBacDual 和 pFastBa-
cDual-eGFP 载体上。依照质粒提取试剂盒说明书中
介绍的方法，分别提取质粒。酶切鉴定阳性克隆子，
分别命名为 pFastBac-S8 和 pFastBac-S8-eGFP。
将 pFastBac-S8、pFastBac-S8-GFP 和 pFastBac-
Dual 空载体（用作对照）分别转座到含有 AcBacmid
和 helper 质粒的 DH10B 感受态细胞，涂布于 LA 培
养基平板［含 50 μg/mL 卡那霉素（kanamycin，Ka-
na），7 μg/mL 庆大霉素（gentamicin，Gm），10 μg/mL
四 环 素（tetracycline，Tetra），100 μg/mL 5 溴 -4- 氯
-3- 吲 哚 -β-D-乳 糖 苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-
D-galactoside，X-gal） 和 40 μg/mL 异 丙 -β-D-硫 代
吡 喃 半 乳 糖 苷（thiogalactopyranoside，IPTG）］， 于
37℃培养 24-48 h。检查平板上的蓝白斑，白斑即
重组 Bacmid 的菌落。挑取白色单菌落，接种于 5
mL LB 培养基，37℃振荡培养 14 h。取出 3 mL 于
10 000×g 离心 10 min，抽提重组 Bacmid 质粒。抽提
Bacmid 质粒的具体方法参考 Bac-to-Bac® Baculovirus
Expression Systems 手册的 3.5 节。
以上述提取的重组 Bacmid 为模板，以通用引
物 M13F 和 M13R 以及目的片段上两端的引物（表
1）进行 PCR 检测。鉴定正确的重组 Bacmid 分别命
名为 Bacmid-p44、Bacmid-p44-eGFP 和 Bacmid-Dual，
于 4℃冰箱中保存。
1.2.4 重组病毒转染昆虫细胞 Sf9 在 35 mm 的培
养皿中接种 5×105 的 Sf9 细胞，27℃培养过夜。在
生物安全柜中弃去上层培养基，加入 2 mL 无血清的
培养基室温放置 1 h。取 5 μg 重组 Bacmid 质粒以及
6 μL 脂质体（Invitrogen，美国），分别用无血清培养
基稀释至 100 μL，将两者混合。静置 15-40 min 后，
向脂质体和 DNA 的混合液中加入 800 μL 培养基，
混匀，移入 35 mm 培养皿中，培养 6 h。移去转染液，
添加 2 mL 含 10% 血清的培养基，混匀，培养 72 h
后倒置荧光显微镜下观察是否有荧光信号。离心回
收上清，即为 P1 病毒贮液，4℃避光保存。
按照 2×106 个细胞 / 孔的量将 Sf9 细胞转入 35
mm 的培养皿中，贴壁生长至少 1 h。每孔加入适量
的上述 P1 病毒贮液，27℃湿盒孵育 72 h。500×g
离心 5 min 取上清，即为 P2 病毒贮液。重复上述方
法扩增 P3 病毒贮液，用于重组 Bacmid 的高效表达。
1.2.5 Western blot 检测 取 P3 病毒贮液感染 Sf9 细
胞，72 h 后将细胞吹起，500×g 离心 5 min，取适
表 1 PCR 扩增产物所需引物列表
引物 方向 保护碱基及酶切位点 引物序列（5-3）
pTS8F 正向 CGC GGATCC（BamH Ⅰ） ATGACTACTAAACTTTTCAAGCA
pTS8R 反向 CC AAGCTT（Hind Ⅲ） CTCTGCCTCTAGAACGCC
pFS8-1F 正向 GG GGTACC（Kpn Ⅰ） ATGACTACTAAACTTTTCAAGCA
pFS8-1R
pFS8-2F
pFS8-2R
M13F
M13R
反向
正向
反向
正向
反向
CC CTCGAG（Xho Ⅰ）
AA CTGCAG（Pst Ⅰ）
CCC AAGCTT（Hind Ⅲ）
CTCTGCCTCTAGAACGCC
ATGACTACTAAACTTTTCAAGCA
CTCTGCCTCTAGAACGCC
TGTAAAACGACGGCCAGT
CAGGAAACAGCTATGACC
2016,32(3) 125彭晗等：马尾松毛虫质型多角体病毒非结构蛋白 p44在 Bac-to-Bac 系统中的表达和亚细胞定位
量细胞沉淀，加 50 μL 的 SDS-PAGE 上样 buffer，进
行 SDS-PAGE 电泳后转膜，以 p44 蛋白多克隆抗体
为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗兔的血清（武汉
博士德生物工程有限公司）为二抗，用 Western blot
法检测 p44 蛋白的表达。
1.2.6 p44 的亚细胞定位 用 P2 病毒贮液感染贴
壁 生 长 24 h 的 Sf9 细 胞（ 覆 盖 玻 底 培 养 皿 50%），
27℃ 培 养 24 h， 移 除 细 胞 培 养 基， 用 PBS（137
mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，
2 mmol/L KH2PO4，pH7.4）将细胞洗 1 遍，加入 4%
多聚甲醛（北京赛驰生物科技有限公司）（过滤除菌）
室温静置固定 15 min，再用 PBS（pH7.4）将细胞洗
1 遍 ；加入透化液［0.25% TritonX-100（上海索莱
宝生物科技有限公司）］，室温静置 10 min ；用 PBS
（pH7.4）洗涤细胞，加荧光染料 hoechst 33258 染核
5-10 min，然后用 PBS 洗 3 遍，再加入 1 mL PBS。
激光共聚焦显微镜（TCS SP2，Leica，德国）观察绿
色荧光分布情况。
1.2.7 序列统计分析与系统发育树构建 将 DpCPV
1 基因组 S8 片段，放入 NCBI 上进行 Blast 序列比对
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。根据已经公开
的 CPV 的 S8 片段进行比对，利用 Mega4.0 分析软件
进行聚类分析，并采用软件 ClustalW 和 PHYLIP3.67
的邻近法构建系统发育树，其核酸和氨基酸序列比
对的 bootstrapping 数值分别为 0.01 和 0.2。
2 结果
2.1 DpCPV 1基因组S8片段和其编码非结构蛋白
p44的系统发育分析
通过系统发育树分析，DpCPV 1 基因组 S8 片
段与舞毒蛾质型多角体病毒（LdCPV 1）基因组 S8
片段具有最高的序列同源性（99%），与另外两株
DPCPV（AY211092.1 和 AF389469.1）序列同源性均
为 98%；分别与 3 株家蚕质型多角体病毒（BmCPV 1）
Strain H、Strain I 和 Strain suzhou 对应片段的同源性
为 84%、83% 和 81%（图 1）。
DpCPV 1 S8 片段编码非结构蛋白 p44 的系统
发育树分析显示 ：p44 蛋白与 LdCPV 1、BmCPV 1
strain H 和冬尺蠖蛾质型多角体病毒（ObCPV 18）
的相应非结构蛋白氨基酸序列同源性分别为 99%、
85% 和 35%。另外，我们检测到了 p44 蛋白与 3 株
鞘脂菌属（Sphingobium）细菌的氨基脱氧分枝酸裂
解酶（aminodeoxychorismate lyase）有 27% 的氨基酸
序列同源性（图 2）。
图 1 DpCPV1 基因组 S8 片段的核酸系统发育树
图 2 DpCPV 1 非结构蛋白 p44 的系统发育树
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3126
2.2 DpCPV S8片段的分子克隆和抗体制备
以 pTS8F 和 pTS8R 为 正 反 向 引 物， 以 DpCPV
1 基因组 S8 片段为模板进行 RT-PCR 扩增，扩增
产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段大小
约 为 1 170 bp（ 图 3-A）。 将 S8 连 接 至 pET28a 载
体上，构建表达质粒。用 BamH Ⅰ和 Hind III 双酶
切验证正确后（图 3-B），命名为 pET28a-S8。经测
序，将鉴定正确的克隆质粒 pET28a-S8 转化大肠杆
菌 BL21，加 IPTG 诱导后离心收集菌体，进行 SDS-
PAGE 分析。结果（图 4）显示，检测到插入的 S8
片段的载体有相应蛋白的表达，蛋白大小约为 51
kD。因插入的 S8 片段后面携带了一个 His 纯化标签
（大小约 7 kD），所以实际插入 S8 片段表达的蛋白
大小为 44 kD，与 p44 蛋白大小相符。
通过 His 纯化标签经 Ni-NTA 纯化树脂纯化包
涵体的目的蛋白后，所得纯化蛋白免疫家兔，制备
p44 蛋白的多克隆抗体 anti-p44。
2.3 重组病毒载体构建
将 S8 片 段 克 隆 至 pFastBac-eGFP 和 pFastBac-
Dual 质粒上，构建载体。用 Xho Ⅰ和 Kpn Ⅰ双酶切
验证后，分别命名为 pFast-S8 和 pFast-S8-eGFP（图
5）。分别将 pFast-S8、pFast-S8-eGFP 和 pFastBacDual
（空载对照）转座到 DH10B 感受态细胞，经培养后
提取并鉴定正确的 Bacmid DNA（图 6）。
2000
bp
1000
750
500
250
4500
bp
3000
2000
1200
800
500
250
M1 1 M2 2
1170
bp
1170
bp
A B
M1 ：DL2000 DNA Marker ；1 ：S8 片段 RFPCR 产物 ；M2 ：Marker Ⅲ ；
2 ：pET28a-S8 的酶切产物
图 3 S8 原核表达载体的构建
M
51
kD
1 2 3
116.0
kD
66.2
45.0
35.0
25.0
M ：蛋白 Marker ；1 ：BL21-pET28a-S8 ；2 ：经 IPTG 诱导的 BL21-pET28a-S8 ；
3 ：纯化后的目的蛋白
图 4 SDS-PAGE 检测 p44 诱导表达结果
5000
bp
3000
2000
1000
500
250
100
M 1
1170
bp
M ：DNA Marker 5000 ；1 ：pFast-S8 的双酶切
图 5 酶切验证 pFast-S8
M 1
bp
10000
8000
5000
3000
2000
1500
1000
750
M ：DNA Marker10000 ；1 ：Bac-S8 的 PCR 结果
图 6 Bac-S8 的 PCR 验证
2.4 p44的真核表达的Western blot 检测
用构建的重组 Bacmid-S8 病毒转染 Sf9 细胞，经
SDS-PAGE 检测蛋白的表达情况（图 7-A）。然后以
anti-p44 为一抗，HRP 标记的羊抗兔血清抗体为二
抗，经 Western blot 检测 DpCPV 1 S8 编码蛋白 p44
2016,32(3) 127彭晗等：马尾松毛虫质型多角体病毒非结构蛋白 p44在 Bac-to-Bac 系统中的表达和亚细胞定位
在昆虫细胞 Sf9 内表达情况。结果（图 7-B）显示，
Bacmid-S8 感染的 Sf9 细胞（第 1 泳道）在 35 kD 处
有明显条带，而空白的 Sf9 细胞（第 3 泳道）和经
Bacmid-S7 感染的 Sf9 细胞（第 2 泳道）作为阴性对
照，未检测出条带。第 1 泳道检测到的条带是 p44
蛋白的真核表达蛋白，大小为 35 kD，但是比原核
表达的 p44 蛋白小了 9 kD。
blot 结果显示 DpCPV 1 S8 片段编码的非结构蛋白
p44 实际大小为 44 kD，与推测的蛋白分子量大小结
果一致。
采用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统，将 DpCPV
1 基因组 S8 片段单独插入以及 S8 片段与绿色荧光
蛋白基因（egfp）以 C 端融合的方式插入苜蓿银纹
夜 蛾 核 多 角 体 病 毒（Autographa californica multiple
nucleocapsid NPV，AcMNPV）基因组中，获得重组
的杆状病毒质粒（Bac-S8 和 Bac-S8-eGFP），转染昆
虫细胞 Sf9 后进行 Western blot 检测和蛋白的亚细胞
定位的观察。Western blot 检测结果显示，Bac-S8 在
昆虫细胞 Sf9 中获得高效表达，但表达的 p44 蛋白
的大小为 35 kD，比原核表达的 p44 蛋白（44 kD）
略小。推测 DpCPV 1 S8 片段表达的蛋白 p44 在昆虫
细胞内发生了切割修饰，这种蛋白切割现象此前也
在 DpCPV 1 的其它片段表达的蛋白中发现过。如 Jin
等［15］将 DpCPV 1 感染甜菜夜蛾幼虫，取中肠样品
经 Western blot 检测发现，DpCPV 1 S7 片段编码的
蛋白 p50 在感染的第 3 天表达的蛋白大小为 50 kD，
在感染的第 5 天发现该蛋白发生切割修饰，修饰后
的蛋白大小为 31 kD，上述数据证实了 DpCPV S7 片
段在真核细胞内表达的蛋白发生了切割。因此，我
们推测 p44 蛋白在真核细胞内发生了降解或者被昆
虫细胞的某些酶切割或修饰。
用激光共聚焦显微镜观察 Bac-S8-eGFP 的融合
蛋白的亚细胞定位发现，融合 p44 的绿色荧光蛋白
A ：Sf9 细 胞 碎 片 的 SDS-PAGE 检 测 ；B ：S8 抗 体 的 Western blot 检 测 ；
1 ：Bacmid-S8 感染 Sf9 细胞收获 P2 后的细胞碎片 ；M ：蛋白 Marker ；2 ：
Bacmid-S7 感染 Sf9 细胞的细胞碎片 ；3 ：Sf9 细胞
图 7 p44 蛋白的真核表达 SDS-PAGE（A）及 Western
blot（B）检测
2.5 非结构蛋白p44蛋白的亚细胞定位
用 P3 代病毒感染昆虫细胞 Sf9 后 24 h，用激光
共聚焦显微镜观察蛋白的亚细胞定位情况。结果表
明，昆虫细胞 Sf9 被杆状病毒感染后，细胞核明显
增大，经荧光染料 Hoechst 33258 染洗后，紫色部位
为细胞核。融合了 p44 的 eGFP 的蛋白则主要聚集
在细胞质中（图 8-A），而未融合 p44 的 EGFP 均匀
地分布于整个细胞中（图 8-B），说明 S8 片段编码
的非结构蛋白 p44 主要定位于细胞质中。
3 讨论
本研究通过克隆 DpCPV 1 基因组 S8 片段到原
核表达载体 BL21 内，原核表达 p44 蛋白。经 SDS-
PAGE 电泳检测到诱导表达的蛋白大小约 51 kD，这
是因为在构建表达 S8 片段的后面添加了一个 His 纯
化标签，纯化标签的蛋白大小约 7 kD，因此 DpCPV
1 基因组 S8 片段原核表达蛋白的大小约 44 kD，与
p44 的蛋白大小相符。将 DpCPV 1 S8 片段原核表达
蛋白免疫家兔，制备了 p44 的多克隆抗体。Western
GFP Hoechst Overlap
A
B
A ：融合 p44 的 eGFP 的 Sf9 细胞 ；B ：未融合 p44 的 eGFP 的 Sf9 细胞
图 8 融合了 EGFP 的 p44 在昆虫细胞中的定位
kD
100
70
55
40
35
25
15
M1
35
kD
M 2 3
B
1 M 2 3
A
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3128
（eGFP）主要聚集在细胞质中，没有融合 eGFP 的
分布于整个细胞，说明 DpCPV 1 的非结构蛋白 p44
定位于细胞质中。类似的情况也发生在 DpCPV 1 S7
片段编码的结构蛋白 p50，Jin 等［15］研究发现 p50-
eGFP 同样定位于细胞的细胞质中。而 DpCPV 1 的
S9 片段编码的非结构蛋白 NS5，免疫荧光实验发现
NS5 蛋白定位于细胞的细胞质膜上并且跨膜结构域
位于蛋白质 N 端的 57-71 aa［16］。相关蛋白的定位研
究发现，为研究病毒的生命周期具有重要作用。
4 结论
本研究利用 Bac-to-Bac 系统首次对 DpCPV 1 S8
片段进行了真核表达和昆虫细胞的亚细胞定位，发
现 S8 片段能够定位到细胞的细胞质。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）