全 文 ：第 33卷 第 2期 生 态 科 学 33(2): 213−219
2014 年 3 月 Ecological Science Mar. 2014

收稿日期: 2013-10-18; 修订日期: 2013-12-20
基金项目: 真眼点藻(Eustigmatos sp.)的金藻昆布糖代谢转变及其对三酰甘油积累驱动的氮调控机理研究(31170337); 微藻高效规模化培养及生物燃料
清洁制备技术(21013AA065805); 广东省低碳专项(2011-051)
作者简介: 程秀颀(1990—), 女, 硕士研究生, 主要从事藻类生物技术研究, E-mail: 405443201@qq.com
*通信作者: 张成武, 主要从事微藻资源的开发与利用的研究, E-mail: tzhangcw@jnu.edu.cn

程秀颀, 高保燕, 万凌琳, 等. 不同硝酸钠浓度对大真眼点藻生长和脂产量的影响[J]. 生态科学, 2014, 33(2): 213−219.
CHENG Xiuqi, GAO Baoyan, WAN Linglin, et al. Effects of sodium nitrate concentration on the growth and lipid production of
Eustigmatos magnus[J]. Ecological Science, 2014, 33(2): 213−219.

不同硝酸钠浓度对大真眼点藻生长和脂产量的影响
程秀颀, 高保燕, 万凌琳, 李爱芬, 张成武*
暨南大学水生生物研究中心 广州 510632

【摘要】 以大真眼点藻(Eustigmatos magnus)为研究材料 , 改良 BG-11 作为基础培养基 , 设置四种 NaNO3 浓度 , 利用
Ø3 cm 的玻璃柱状光生物反应器对该藻进行培养, 通过一系列生理指标的测定来探讨不同 NaNO3浓度对大真眼点藻生长
和脂积累的影响。实验结果表明: 最适宜该藻生物量积累的 NaNO3 浓度为 9 mmol·L–1, 此条件下生物量达到 11.31 g·L–1;
通过脂组分分级, 结果显示 3.6 mmol·L–1 实验组的总脂含量和中性脂含量均为最高, 总脂含量为 60.21%(干重百分比),
中性脂含量为 92.99%(总脂百分比); 主要脂肪酸组分为棕榈酸、棕榈油酸和油酸, 三者含量总和占总脂肪酸含量的 55%-
87%; 9 mmol·L–1实验组的总脂单位体积产率最高为 0.29 g·L–1·d–1, 6 mmol·L-1实验组的中性脂产率最高, 达到 0.26 g·L–1·d–1。总体
来看, 9 mmol·L–1 实验组和 6 mmol·L–1 实验组的产油能力相当, 但若要进行工业化生产, 则 6 mmol·L–1 为产油脂的最适
浓度。

关键词：大真眼点藻; 生物量; 总脂含量; 中性脂含量; 脂肪酸组成; 单位体积产率
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2014.02.002 中图分类号：Q175 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2014)02-213-07
Effects of sodium nitrate concentration on the growth and lipid production of
Eustigmatos magnus
CHENG Xiuqi, GAO Baoyan, WAN Linglin, LI Aifen, ZHANG Chengwu*
Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Abstract: The effects of sodium nitrate concentration on the growth and the physiological characteristics of Eustigmatos
magnus, which was cultured in the column photobioreactors (3 cm in diameter) with the BG-11 medium were investigated.
The results showed that the optimum sodium nitrate concentration for the growth of E. magnus was 9 mmol·L–1 and the
highest biomass was 11.31 g·L–1. Neutral lipid, glycolipid and phospholipid were partitioned from total lipid of this alga
through C18 cartridge. Under the sodium nitrate concentration of 3.6 mmol·L–1, the total lipid content reached 60.21%(% dry
weight) and the neutral lipid content reached 92.99%(% total lipid), respectively. Both of the values were higher than the
other three groups. In addition, the main components of fatty acid were palmic acid, palmitoleic acid and oleic acid, while the
sum of their contents achieved 55% to 87% (% total fatty acid). The optimal concentration of sodium nitrate for the
volumetric productivity of total lipid was 9 mmol·L–1 and the value was up to 0.29 g·L–1·d–1, meanwhile the maximum
volumetric productivity of neutral lipid ran up to 0.26 g·L–1·d–1 under the concentration of 6 mmol·L–1. Considering the cost
of sodium nitrate, 6 mmol·L–1 is the most economical concentration for commercial production.
Key words: Eustigmatos magnus; biomass; total lipid content; netural lipid content; fatty acid composition; volumetric productivity
214 生 态 科 学 33 卷

1 前言
随着传统能源的耗尽, 寻找一种可再生的环境
友好型能源成为当下亟待解决的问题。目前, 能源
微藻逐渐成为新型替代能源研究的热点。微藻是一
类在自然界中起源较早、分布较广、种类和数量最
大的光合自养型低等植物, 它们能够释放氧气、将
无机物转化为有机物, 并且在一定的条件下积累油
脂, 从而可以用来生产生物柴油[1–2]。
研究表明, 微藻油脂的积累与培养条件密切相
关, 包括营养盐的浓度(主要是氮和磷)[3–5]、光照强
度[6–7]、培养温度等[8–9], 而培养基中氮的浓度对微藻的
生长、油脂积累以及脂肪酸组成的影响尤为显著[10–12]。
目前研究的微藻培养氮源主要有硝酸盐、尿素和铵
盐, 而最常用的为硝酸盐。关于氮源对微藻生长、总
脂含量及脂肪酸组成的影响有很多报道, 张敬键[13]
测定了四个硝酸钠浓度下多形拟绿球藻(Pseudochlo-
rococcum polymorphum)和模式拟绿球藻(Pseudochlo-
rococcum typicum)的生长及总脂含量, 结果表明两
种绿藻在低氮条件下的干重均较高且总脂含量随氮
浓度的降低而呈现增长的趋势。Margret 等[14]在不同
氮浓度条件下对两株绿藻和四株蓝绿藻进行分批培
养, 研究结果表明, 六株藻的生物质浓度均随氮浓
度的增加而增加; 两株绿藻在低氮条件下总脂含量
较高且主要组成为中性脂, 脂肪酸组成以棕榈酸和
油酸为主, 而在高氮条件下总脂含量明显降低且主
要组成为极性脂, 脂肪酸组成以 C16和 C18 不饱和脂
肪酸为主; 氮浓度对四株蓝绿藻的总脂组分和脂肪
酸组分并无明显影响。上述结果表明, 氮浓度对不
同藻株的生长影响存在较大差异。真眼点藻纲为异
鞭藻门中新独立出来的黄绿色单细胞藻类, 广泛分
布于淡水、半咸水、海水和土壤中, 其叶绿体外部
含有一个眼点[15], 关于本纲藻类的报道还比较少,
因此, 本研究选择一种形态结构上具有代表性的大
真眼点藻(Eustigmatos magnus)为实验材料, 探讨了
不同硝酸钠浓度对其生长、总脂含量、总脂组分以
及脂肪酸组成的影响, 以期为能源微藻的研究及培
养条件的优化提供一定的理论依据。
2 材料与方法
2.1 藻种
大真眼点藻(E. magnus), 由暨南大学水生生物
研究中心微藻能源实验室保藏。
2.2 实验设计和培养条件
以改良 BG-11 培养基为基础, 设置四种 NaNO3
浓度, 分别为 18 mmol·L–1、9 mmol·L–1、6 mmol·L–1、
3.6 mmol·L–1, 培养反应器为 Ø3.0 cm×60 cm 玻璃柱
状光生物反应器。低速离心收集藻细胞, 接种初始
浓度为 OD750=0.50±0.01, 各处理组均通入含 1%
CO2 的空气, 光照周期为 24 小时持续单侧光照, 光
照强度为300 μmol·m–2·s–1, 温度为(25±1) , ℃ 培养周
期为 18 d。每个培养浓度设置 5 个平行实验。
2.3 生物量的测量方法
将孔径为 0.45 μm 的混合纤维滤膜置于 105 ℃
的烘箱中烘干至恒重, 称重后记为W1, 取5 mL藻液
抽滤, 然后再将滤膜置于 105 ℃的烘箱中烘干至恒
重, 记为 W2, 由此可得生物量的计算公式为: 生物
量( g·L–1)= 1000 × (W2–W1)/5。称重时需先将滤膜置
于干燥器中冷却至室温。
2.4 藻粉的制备
取一定量的藻液, 3500 r·min–1 离心 3 min, 用蒸
馏水洗涤后再次离心, 收获藻泥后采用冷冻干燥机
(VirTis wizard2.0 型)冷冻干燥 24 h。放入–20 ℃冰箱
保存待用。
2.5 总脂含量的测定
参考 Khozin-Goldberg 等 [16]的方法并进行改
进。取 80—100 mg 藻粉置于带转子的螺口玻璃离心
管中, 加入 2 mL 二甲基亚砜-甲醇混合液(V:V=1:9),
50 ℃水浴 1 h; 然后在冰浴下磁力搅拌抽提 1 h,
3000 r·min–1离心, 转移上清液到另一小瓶中。剩余
藻渣再加入 4 mL 正己烷-乙醚混合液(V:V=1:1), 于
冰浴下磁力搅拌抽提 1 h, 3000 r·min–1离心, 转移上
清液至上述小瓶中。以上操作重复一遍。在上述合
并抽提液中加入 4 mL 纯水使四者体积比例为
1:1:1:1, 振荡分相, 移取有机相转移到另一小瓶中,
在通风橱中用氮气吹至较小体积, 将浓缩液转移至
预先称重过的 1.5 mL 的塑料离心管中, 用氮气吹干
至恒重, 充氮气后在–20 ℃保存。计算公式为: 总脂
含量(%DW)=(M2–M1)/烘干后藻粉重量(其中: %DW
为藻粉干重百分比, M2 为装有脂肪提取物的离心管
重量, M1 为净离心管重量)。
2.6 总脂组分分析
参考 Alonzo 和 Mayzaud[17]的方法并进行改进。
2 期 程秀颀, 等. 不同硝酸钠浓度对大真眼点藻生长和脂产量的影响 215

以上述方法提取的总脂为样品, 采用硅胶层析柱对
脂肪组分进行分析。先用三氯甲烷活化层析柱, 然
后用三氯甲烷溶解样品并加入到层析柱中, 分别用
三种试剂进行洗脱。洗脱顺序如下: 三氯甲烷洗脱
中性脂、丙酮-甲醇混合液(V:V=9:1)洗脱糖脂、甲醇
洗脱磷脂。将各组分用氮吹仪加热吹干, 吹干后加
入乙醚分别溶解, 再转移至称重过的 1.5 mL 的塑料
离心管中, 吹干至恒重后称其重量, 利用差量法计
算出中性脂、糖脂和磷脂的重量。
2.7 脂肪酸组成分析
参考 Bigogno 和 Khozin-Goldberg [18]的方法并
进行改进。称取 25 mg 冻干藻粉放入带转子的螺口
玻璃离心管中, 加入 2 mL 含有 2%H2SO4 的无水甲
醇-甲苯(V:V=9:1)混合液, 同时加入 25 μL 1% 的十
七烷酸(C17:0)作为内标, 充氩气后, 将离心管置于
磁力搅拌水浴锅中, 80 ℃恒温搅拌 1.5 h, 然后再分
别加入 1 mL 纯水和正己烷, 振荡后 3500 r·min–1离
心3 min, 将上层有机相转移到一小玻璃瓶用氮气吹
干, 加入 100 μL 正己烷密封待测。利用气相色谱-
质谱联用技术进行分析, 得到各脂肪酸组分占总脂
肪酸含量的相对百分比。
2.8 总脂单位体积产率和中性脂单位体积产率的
算法
总脂单位体积产率=ρ×ω1/T(ρ: 生物量; ω1: 总
脂含量; T: 培养天数)
中性脂单位体积产率=ρ×ω1×ω2/T(ρ: 生物量 ;
ω1: 总脂含量; ω2: 中性脂含量(%TL); T: 培养天数)
2.9 数据处理
测定结果采用平均值±标准偏差(Mean±SD)表
示, 所有数据的平均值和标准差都是三次重复的计
算结果。用 Excel 2003 和 Origin8.5 对数据进行分析
出理, 采用 SPSS13.0 中的单因素方差分析进行数
据差异性分析, 以 p<0.05 为显著水平差异。
3 结果与分析
3.1 不同 NaNO3 浓度对大真眼点藻生长的影响
图 1 所示为不同 NaNO3浓度对大真眼点藻生物
量的影响。在整个培养周期中, 各实验组的生物量
都在不断增加。初期, 藻细胞接种至反应器后出现
了短暂的延滞期, 随后即进入指数生长期, 从第 9
天开始增长速率减慢, 缓慢进入平台期。各实验组
第 0 天的生物量均为 0.2 g·L–1 左右, 在 0—2 天内各
实验组的生物量之间无明显差异(p>0.05), 而从第 3
天开始, 各实验组生物量之间的差距逐渐明显, 此时
18 mmol·L–1 实验组的生物量高于其他三组。从第 7
天开始 9 mmol·L–1实验组的生物量超过 18 mmol·L–1
实验组。在第 18 天, 9 mmol·L–1实验组生物量最高, 为
11.31 g·L–1, 18 mmol·L–1、6 mmol·L–1和 3.6 mmol·L–1
实验组的生物量分别为9.80 g·L–1、9.77 g·L–1和 7.79 g·L–1,
这说明在 3.6 mmol·L–1 –18 mmol·L–1 浓度范围内,
NaNO3 浓度为 9 mmol·L–1 时, 大真眼点藻生长的生
物量最高。
3.2 不同 NaNO3 浓度对大真眼点藻细胞内总脂含
量的影响
图 2 所示为不同 NaNO3浓度条件下大真眼点藻
细胞内总脂含量的时相变化。从图中可以看出, 随
着时间的推移, 各实验组的总脂含量呈逐渐上升的
趋势; 而在同一时期内, 随着 NaNO3 浓度的降低,

图 1 不同硝酸钠浓度对大真眼点藻生物量的影响
Fig. 1 The effect of different concentrations of sodium
nitrate on the biomass of Eustigmatos magnus

图 2 不同硝酸钠浓度对大真眼点藻细胞内总脂含量的影响
Fig. 2 The effect of different concentrations of sodium
nitrate on the total lipid content of Eustigmatos magnus
216 生 态 科 学 33 卷

总脂含量逐渐升高。在培养初期总脂含量约占干重
的 17%, 而在第 18天时, 各实验组的总脂含量出现
大幅提升, 其中3.6 mmol·L–1实验组的总脂含量最高,
为 60.21%, 6 mmol·L–1实验组为 53.51%, 9 mmol·L–1
实验组为 46.40%, 18 mmol·L–1 实验组为 38.16%。
该实验结果表明, 氮限制条件能促进藻细胞中油脂
的积累。
3.3 不同 NaNO3 浓度对大真眼点藻总脂组分及其
含量的影响
图 3 所示为不同 NaNO3浓度对大真眼点藻总脂
组分及其含量的影响, a-1、b-1 分别代表第 3、18
天各脂肪组分占总脂的百分比, a-2、b-2 分别代表
第 3、18 天各脂肪组分占藻粉干重的百分比。由
图可知, 大真眼点藻总脂组分主要为三大类: 中
性脂、糖脂和磷脂, 其中中性脂的含量最高, 糖脂
次之, 磷脂最少。如图 3 中 a-1 和 a-2 所示, 第 3
天各实验组的中性脂含量占总脂的 40%—50%、占
藻粉干重的 10%左右, 且随着 NaNO3 浓度的降低,
中性脂含量呈现递增趋势, 但此时各个值之间的差
距很小。而到了第 18 天, 各实验组的中性脂含量出
现了大幅提升, 如图 1-4 中 b-1 所示, 18 mmol·L–1
实验组的中性脂含量增加了 34.84%, 9 mmol·L–1实
验组增加了 41.90%, 6 mmol·L–1 实验组增加了
42.61%, 3.6 mmol·L–1 实验组增加了 43.19%, 该实验
组中性脂含量增加为最大, 图 3中 b-2所示中性脂含
量占藻粉干重的百分比呈现相同的变化趋势。而糖
脂和磷脂含量的变化趋势与中性脂的相反, 随氮浓
度的降低而降低, 这说明在中性脂积累的过程中糖
脂和磷脂在不断分解。
3.4 不同 NaNO3 浓度对大真眼点藻脂肪酸组成的
影响
表 1 所示的是四种 NaNO3条件下大真眼点藻的
脂肪酸组成分析, 由表可以看出, 藻粉中脂肪酸主
要由四种碳链长度的 9 种脂肪酸组成, 且多为不饱
和脂肪酸。大真眼点藻的脂肪酸组成主要有三种,
分别是: 棕榈酸、棕榈油酸和油酸, 各实验组测得
的这三种脂肪酸的总含量达到了总脂肪酸含量的
55%—87%, 其中棕榈酸和棕榈油酸的含量比较稳
定, 不受硝酸钠浓度的影响, 而各实验组的油酸含
量随硝酸钠浓度的减少而呈现逐渐递增的趋势。此
外, 该藻中还含有一定量的花生四烯酸和二十碳五
烯酸, 但是这两种脂肪酸含量都很低。

图 3 不同硝酸钠浓度对大真眼点藻总脂组分及其含量的影响
Fig. 3 The effect of different concentrations of sodium nitrate on the lipid classification of Eustigmatos magnus
2 期 程秀颀, 等. 不同硝酸钠浓度对大真眼点藻生长和脂产量的影响 217

表 1 不同硝酸钠浓度对大真眼点藻脂肪酸组成及其含量的影响
Tab. 1 The effect of different concentrations of sodium nitrate on the fatty acid of Eustigmatos magnus
天数 硝酸钠浓度/ 脂肪酸含量 (mmol·L−1) (占总脂肪酸的相对含量/ %)
14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:4 20:5 others
0 1.69 17.22 33.93 0.51 5.17 4.10 0.09 8.93 17.94 10.42
18 3.07 17.51 41.57 0.78 5.65 1.25 0.05 2.80 16.65 10.67
9 3.97 16.89 41.16 0.90 4.08 1.98 0.19 4.75 15.43 10.65
6 3.77 18.69 48.77 0.76 9.26 1.59 0.18 2.08 9.24 5.66
3
3.6 3.11 20.73 45.06 1.00 13.75 1.52 0.01 1.70 9.55 3.57
18 3.24 14.78 51.04 0.44 10.83 1.87 0.10 2.31 8.18 7.21
9 3.57 14.69 55.21 0.50 13.59 1.38 0.13 1.17 4.88 4.88
6 3.62 14.62 54.23 1.06 14.18 1.51 0.14 0.62 2.93 7.09
9
3.6 4.08 14.88 57.50 0.39 16.18 1.00 0.16 0.87 3.46 1.48
18 4.00 12.70 52.76 0.96 14.88 2.62 0.14 2.02 5.56 4.36
9 3.91 13.86 58.17 0.28 13.90 1.50 0.13 1.72 3.80 2.73
6 4.06 14.38 55.15 0.71 15.13 1.40 0.15 1.03 2.99 5
18
3.6 4.24 13.13 57.25 0.40 16.14 1.60 0.16 1.38 3.45 2.25

3.5 总脂单位体积产率和中性脂单位体积产率
由图4可知, 9 mmol·L–1实验组的总脂单位体积产
率略高于 6 mmol·L–1 实验组, 分别为 0.292 g·L–1·d–1
和 0.290 g·L–1·d–1, 而 9 mmol·L–1 实验组的中性脂单
位体积产率略低于 6 mmol·L–1 实验组 , 分别为
0.260 g·L–1·d–1和 0.265 g·L–1·d–1。总体来看, 9 mmol·L–1
实验组和 6 mmol·L–1 实验组的产油能力相当。
4 讨论
氮源是微藻生长所需的重要营养因子, 其种类、
浓度都会对微藻的生理特性产生很大影响。Li 等[19]

图 4 不同硝酸钠浓度对大真眼点藻总脂及中性脂单位体积
产率的影响
Fig. 4 The effect of different concentrations of sodium
nitrate on the volumetric productivity of total lipid and
netural lipid of Eustigmatos magnus
研究了不同氮源对富油新绿藻 (Neochloris oleoa-
bundans)的生长及总脂积累的影响, 研究发现硝酸盐
是富油新绿藻(N. oleoabundans)的最适生长和最适产
油氮源, 当硝酸盐浓度设置在 3 mmol·L−1 –10 mmol·L−1
范围内时, 该藻的生物量随氮浓度的升高而增长,
而在 10 mmol·L−1—20 mmol·L−1 范围内, 生物量随
着氮浓度的升高而降低, 10 mmol·L−1是最适生长浓
度, 总脂含量则随氮浓度的升高而呈降低的趋势,
在 5 mmol·L−1 条件下总脂产率最高。
而在本研究中以 NaNO3为氮源, 原因是 NaNO3
的成本较低, 并且是 BG-11 培养基配方中的氮源。
在四种NaNO3浓度条件下对大真眼点藻进行通气培
养, 研究结果显示在 9 mmol·L–1 条件下大真眼点藻
的生物量最高, 这说明最适宜该藻生物量积累的
NaNO3 浓度为 9 mmol·L–1。总脂含量和中性脂含量
随 NaNO3 浓度的降低而增加, 这与上述报道呈现相
似的变化趋势。这说明低氮条件能促进藻细胞中油
脂积累, 尤其是中性脂的积累, 而糖脂和磷脂则逐
渐分解, 含量逐渐下降。这种现象产生的原因是: 在
微藻培养初期, 培养基中营养成分充足, 藻细胞固
定 CO2 用于生长和繁殖, 此时细胞中主要积累蛋白
质或碳水化合物, TAG 的合成维持一个基本水平;
而到了对数生长后期, 随着培养时间的延长, 培养
基中的营养成分不断消耗, 此时碳源充足而氮源缺
乏, 因此氮缺乏构成了环境胁迫[20], 在胁迫条件下藻
218 生 态 科 学 33 卷

细胞的代谢途径发生了转变: 细胞中类囊体膜的含
量降低, 酰基水解酶的活性增强并刺激磷酸水解[21],
从而导致细胞内的脂肪酸酰基辅酶A的增加, 与此
同时氮浓度的减少也将促进二酰基甘油酰基转移
酶将脂肪酸酰基辅酶 A 转化成 TAG[22], 所以氮浓
度的降低促进了细胞内的总脂含量和中性脂含量
的上升。
微藻的产油性能不仅与油脂含量相关, 还与生
物量有密切联系, 因此我们需借助总脂单位体积产
率和中性脂的单位体积产率来评价该藻的产油性能。
在本研究中, 中性脂产率和总脂产率在9 mmol·L–1和
6 mmol·L–1条件下几乎相等且高于其它两个实验组,
这说明: 氮浓度过高的条件下会抑制大真眼点藻的
生长和产油; 在氮源较为充足的条件下, 藻细胞的
生长较好, 可是细胞内的油脂含量却很低; 而在低
氮条件下, 藻细胞内的油脂含量较高, 但是藻细胞
的生长受到一定程度的抑制。由此可见, 要想获得
较高产量的油脂需选择一种折中的氮浓度对微藻进
行培养。
大真眼点藻的脂肪酸在组成上与已有报道的真
眼点藻纲其它几个藻株相似, 主要有肉蔻酸、棕榈
酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、
花生四烯酸和二十碳五烯酸等, 只是各组分的百分
含量存在一定的种间差异, 但是棕榈酸和棕榈油酸
均为含量较高脂肪酸组分[23–26]。在大真眼点藻中,
棕榈酸、棕榈油酸和油酸占总脂肪酸的百分比合计
超过了 60%, 而适宜用作生物柴油的油脂的脂肪酸
组成以直链的C16或C18饱和或单不饱和脂肪酸为最
佳, 因此可以认为大真眼点藻能够作为生物柴油的
原料。目前, 氮源及其浓度对微藻脂肪酸合成影响
的机理尚不清楚, 还需进一步的研究。
本研究只是针对大真眼点藻产油特性进行最初
步的探索, 要想了解该藻是否能够应用于生物柴油
的生产, 还需对其进行放大培养, 只有在室外培养
条件下依然能够获得较高总脂产率, 才能说明该藻
是生物柴油制备的良好原材料。从目前来看, 微藻
的大规模培养仍存在很多限制因素, 如原生动物的
污染、环境条件的不确定性等, 这些限制因素在短
期内可能不会得到较大改善。
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