全 文 ：第 34卷 第 5期 生 态 科 学 34(5): 233240
2015 年 9 月 Ecological Science Sep. 2015

收稿日期: 2014-09-05; 修订日期: 2014-12-23
基金项目: 广西科学院广西红树林研究中心广西红树林保护与利用重点实验室开放基金资助课题(GKLMC—201306)
作者简介: 车志群(1983—), 女, 山东, 博士, 从事微生物与分子生物学研究, E-mail: happychezhiqun@163.com
*通信作者: 阎冰, 男, 博士, 研究员, 从事海洋生物与环境压力响应研究, E-mail: wjzthb@163.com

车志群, 莫祖英, 孙仁杰, 等. 荧光定量 PCR 方法及分子标志物在海洋污染监测中的应用进展[J]. 生态科学, 2015, 34(5):
233240.
CHE Zhiqun, MO Zuying, SUN Renjie, et al. Review on application of methods of realtime fluorescent quantitative pcr and molecular
marker in marine pollution monitoring[J]. Ecological Science, 2015, 34(5): 233240.

荧光定量 PCR 方法及分子标志物在海洋污染监测中
的应用进展
车志群 1, 2, 莫祖英 1, 孙仁杰 1, 阎冰 1,*
1. 广西科学院广西红树林研究中心, 广西红树林保护与利用重点实验室, 北海 536000
2. 广西大学生命科学与技术学院, 南宁 530000

【摘要】 荧光定量 PCR 作为一种核酸定量技术, 可在 PCR 扩增时在体系中加入荧光染料或荧光基团, 实时监测荧光
信号从而对 PCR 扩增产物进行实时准确定量, 技术灵敏度高, 特异性强。通过对荧光定量 PCR 的原理、分类、优缺
点及几种定量分析方法对比进行简述, 并对其在国内外海洋环境污染监测中的广泛应用和研究进行了全面综述, 从而
对荧光定量 PCR 和分子标志物在海洋监测中的应用前景做进一步的展望。

关键词：实时荧光定量 PCR; 定量分析方法; 分子生标志物; 海洋污染监测
doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2015.05.035 中图分类号：Q33 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2015)05-233-08
Review on application of methods of realtime fluorescent quantitative pcr and
molecular marker in marine pollution monitoring
CHE Zhiqun1, 2, MO Zuying1, SUN Renjie1, YAN Bin1,*
1. Guangxi Academy of Sciences, Guangxi Mangrove Research Center, Guangxi Key Lab of Mangrove Conservation and Utilization,
Beihai 536000, China
2. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530000, China
Abstract: Real-time fluorescent quantitative PCR(qRT-PCR) which works as one kind of quantitative techniques about nucleic acid with
high sensitivity and strong specificity, refers to joining the fluorescent residues or fluorescence dye into PCR reaction system, and to
real-time monitor entire PCR process using the fluorescence signal accumulation, and finally to real-time monitor the PCR amplified
products. In this paper, the principle, classification, characteristics and the comparison of several analytical methods of qRT-PCR were
reviewed; at the same time the wide application and research in marine pollution monitoring at home and abroad were also reviewed. In
addition, they also predicted the further application of qRT-PCR and molecular markers in marine pollution monitoring.
Key words: realtime fluorescent quantitative PCR; quantitative analysis methods; molecular marker; marine pollution monitoring
1 前言
普通聚合酶链式反应应用虽然非常广泛, 但只
能对核酸进行定性。在此基础上 , 美国 APPlied
Biosystems 公司推出实时(real-time)荧光定量 PCR
(fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)[1], 其与普通
234 生 态 科 学 34 卷

PCR 体系的区别就是体系中加入荧光染料或基团,
从而通过实时荧光定量而对 PCR 产物进行实时精
确定量。目前已经在动植物基因工程、微生物生态
和医学、环境监测[23]等领域得到广泛应用。
2 实时荧光定量 PCR 的原理、分类及优缺点
典型的荧光定量 PCR 扩增曲线呈 S 型, 可直观
分为三个阶段: 基线期(荧光背景信号阶段)、对数期
(荧光信号指数扩增阶段)、平台期。在基线期, 也就
是 PCR 反应的最初几个循环里, 荧光信号因为太小
而被荧光背景信号所掩盖。在对数期, PCR 及荧光信
号的扩增均呈现指数增长。此阶段为荧光定量的主
要检测阶段, 有几个定义: ①Ct 值(Threshold cycle,
循环阈值), 即每个反应的荧光信号增加到指定域值
时所经历的循环数。②标准曲线与扩增效率, 因为
模板起始拷贝数与 Ct 值之间存在反向线性关系(Y=
ax+b), 所以利用已知拷贝数或梯度稀释的标准品可
作出标准曲线, 一般是以模板起始拷贝数的对数为
X 轴, 以样品 Ct 值为 Y 轴, 则扩增效率 E=10–1/a-1,
反之扩增效率 E=10–a-1。③熔解曲线, 可以用来验证
扩增产物的特异性, 如果只有单峰说明产物特异性
较好, 否则说明可能存在引物二聚体或非特异性扩
增。在平台期, 由于 DNA 聚合酶的失活、dNTP 和
引物的枯竭、反应副产物焦磷酸影响等导致 PCR 反
应受到阻碍。
荧光定量 PCR 检测方法主要有两种: 一种是荧
光染料嵌合法 SYBR, 如 SYBR Green 法。一种为荧
光探针法, 如 TaqMan 探针法、Cycling 探针法、
Molecular Beacon(分子信标)法。
2.1 荧光探针法
如TaqMan 探针法中荧光探针为一寡聚核苷酸,
且该探针只能与模板对应性结合, 该探针的一短设
有荧光报告基团(Reporter, R), 而另一端设有荧光淬
灭基团(Quencher, Q), 在未扩增前该探针中报告基
团所发射的荧光信号能量被淬灭基团吸收, 扩增开
始后, Taq 酶的5’-3’外切酶活性将活性就会将探针
切断, 使得报告基团和淬灭基团相远离, 从而产生
荧光信号。所以每扩增一循环 PCR, 同样有指数倍
的荧光信号增加, 从而实现荧光信号同步监测 PCR
产物生成[4]。

图 1 TaqMan 探针工作原理[5]
Fig. 1 Working principle of TaqMan probe
荧光探针的设计直接关系到实时监测的成败,
在设计时应遵循以下原则[6]: (1)探针一定要保证特
异性, 大概20—40 bp 左右(2)保持 GC 含量在 20%和
60%之间, 另外为了保证效率和重复性, 应避免重
复的核苷酸序列(特别是连续的4G)(3)用软件检测并
排除引物和探针间的互补性, 否则会形成二聚体或
发卡结构。(4)探针的 Tm 值要比引物的 Tm 值至少
高出5 ℃。另外, 实际实验过程中, 要注意探针的浓
度, 探针与模板序列的同源性, 探针与引物的距离
等一些其他相关因素
2.2 荧光染料嵌合法
如SYBR Green I是一种非特异性核酸荧光染料,
它只有结合于 DNA 双链的小沟部位时才能发射荧
光信号并用荧光定量监测装置进行捕捉从而定量。
其优点为检测的灵敏度高, 对 PCR 扩增的抑制低,
检测成本低廉, 溶解曲线分析, 增加结果的稳定性。
但是因为SYBR Green 与核酸的结合具有非特异性,
所以许多非目的 PCR 产物, 比如引物自身或引物间
二聚体, 单核苷酸链所形成的二级机构, 及非目的
扩增产物等, 都可能与之结合发出荧光, 从而影响
定量的精确性。这一问题我们可通过溶解曲线对
PCR 产物的特异性进行分析和验证, 如果溶解曲线
只有单峰且出峰位置与PCR目的产物退火温度相同,
则产物特异性较强。如果出现多锋或退火温度不对,
PCR 产物的特异性差, 实验结果是不可信。
所以, 相比之下, 荧光染料嵌合法无需另外设
计荧光探针, 无需特别优化条件, 方便简捷, 成本
低, 但缺点是较荧光探针法特异性较差, 专一性不
强。而荧光探针法特异性强, 适用于扩增序列专一
检测, 不过荧光探针的经济成本较高。
5 期 车志群, 等. 荧光定量 PCR 方法及分子标志物在海洋污染监测中的应用进展 235


图 2 SYBR Green Ⅰ工作原理[5]
Fig. 2 Working principle of SYBR GreenⅠ[5]
3 几种实时荧光定量分析方法
不同样品和状况所用的荧光定量分析方法不同,
本文分别介绍一下绝对定量、相对定量 2–CT 及双
标准曲线等几种不同方法
3.1 绝对定量法
绝对定量是利用已知分子拷贝数的样品梯度稀
释后的标准品而建立标准曲线, 从而根据待测样品
的 Ct 值对分子拷贝数进行绝对定量, 多用于对单个
样品进行准确定量[7]。
3.2 相对定量中 2–CT法
如果反应条件控制较好或反复优化后, 使得目
的基因和内参基因PCR产物的扩增效率相似(差异
<5%)并接近 1, 就可以通过比较目的基因与内参基
因、实验样品与校准样品间的△ct值来确定目的基
因的相对表达量[8]。所以使用 2–CT 法前, 要反复
验证目的基因和内参基因的扩增效率, 必要时需反
复优化。
3.2.1 扩增效率及其验证
扩增效率 E 一般指参与到下一轮反应的 DNA
模板占模板总量的百分比, 即 E=参与复制模板/总
模板。理想扩增状况下 , 扩增效率为 100%, 即
Y=X2n(其中 Y 为产物量, X 为初始模板量, n 为扩增次
数)。但现实情况下, 由于酶抑制剂或某些二级结构
等副产物的形成会有偏差[9], 但更多的是设备及操
作原因[10]。也就是说, DNA 的每一次扩增都不完全,
即每次扩增中产物不是呈 2 的倍增长 , 而是
Y=X(1+E)n。所以一般扩增效率 E≤1; 也有以 1+E
代表扩增效率的, 那么 E≤2。
在实时荧光定量 PCR 过程中, 当标准曲线 X 轴
表示 Ct 值, Y 轴表示时起始模板浓度(log 起始拷贝
数)时, 实际扩增效率 E=10–a–1(a 为双标准曲线的斜
率)。PCR 理想扩增效率为 100% 时标准曲线的斜
率应为–3.32 ; 允许的扩增效率为 90%—110%时,
标准曲线斜率的平均值应在–3.6—–3.1 之间[11]。
3.2.2 2–CT法具体操作
用相对定量比较多个样本, 样本之一常被选为
参照。在其它所有样本中目标基因的表达都相对于
参照上调或下调, 通常用未处理的或基准样本作为
校准样本[12]。
一旦确定目标基因和参照基因有相似且接近
100%的扩增效率, 就可以采用2–CT 法你就可以对
不同样本中目标基因表达水平的相对差异进行数据
分析, 步骤如下:
首先, 对所有的测试样和校准样本, 用内参基
因的 CT值归一目标基因的 CT 值:
ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref, test)
ΔCT(calibrator) = CT(target, calibrator) – CT(ref,
calibrator)
其次, 用校准样本的 ΔCT 值归一试验样本的
ΔCT 值:
ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)
最后, 计算表达水平比率:
2–ΔΔCT = 表达量的比值
3.3 相对定量中双标准曲线法:
目的基因、管家基因分别作标准曲线, 然后从
各自的标准曲线上求出初始模板量, 经管家基因均
一化处理后, 求出目的基因的相对含量[11]。表1[13]
中用标准品分别作出目的基因和管家基因的标准曲
线, 再根据 Sample A、Sample B、Sample C 的 Ct 值
分别得到目的基因和管家基因的初始模板量。然后
经管家基因的均一化处理, 分别得到三样品目的基
因的相对含量, 见表2[13]。
3.4 几种实时荧光定量分析方法特点及区别
前面已经讲过几种主要实时荧光定量分析方法
表 1 [12]以参照基因为标准的相对定量 2–ΔΔCt法
Tab. 1 Relative quantification 2–ΔΔCt method by reference
gene standards
试验样本 校准样本
目标基因 CT(target, test) CT(target, cal)
参照基因 CT(ref, test) CT(ref, cal)
236 生 态 科 学 34 卷

表 2 目的基因和管家基因的原始定量结果
Tab. 2 The Ct value of object gene and housekeeping gene
目的基因 管家基因

已知量 Ct 定量结果 已知量 Ct 定量结果
标准品 1 1 35.66 1 37.46 —
标准品 2 10 32.77 10 33.06 —
标准品 3 100 29.20 100 29.69 —
标准品 4 1000 25.75 1000 26.10 —
标准品 5 10000 22.06 10000 22.51 —
标准品 6 100000 18.62 100000 18.88 —
Sample A — 27.22 343.3 — 23.17 6391.5
Sample B — 31.70 17.3 — 22.70 8589.7
Sample C — 24.62 1946.1 — 22.93 7432.9
表 3 目的基因的相对含量
Tab. 3 The relative content of object gene
管家基因 目的基因
检测样品
定量结果 定量结果 校正值 相对量
RNA 样品 A 6391.5 343.4 0.0537 1.000
RNA 样品 B 8589.7 17.3 0.0020 0.037
RNA 样品 C 7432.9 1946.1 0.2618 4.874

有绝对定量法、2–ΔΔCT法相对定量法、双标准曲线相对
定量法, 各种方法均具有其优缺点及特定的应用领域:
绝对定量中, 样品模板拷贝数是由标准曲线得
出的, 而标准曲线又是由于已知浓度的目标基因梯
度稀释后得出的。而相对定量中, 标准曲线仅用于
计算扩增效率, 目的基因转录子的数量是通过与内
参基因的比值得出的[14]。而相对定量中两种方法相
比各有其特点。
2–ΔΔCT法的特点有:
(a) 实验前必须分别对目的基因和内参基因做
标准曲线, 看两者的引物扩增效率是否相似(差异<
0.1)且接近 1, 并由熔解曲线看产物特异性
(b) 不需要每次都做标准曲线, 但该方法要求
严格的重复, 引物 Ct 值的差异只要很小的变化看,
测的结果就会有很大的差别。
(c) 除去内参基因外, 2–ΔΔCT法还需要在多个样
本间选定一个做为校准品, 以便于比对其他样本中
目的基因表达量的上升或下降。一般是未受到环境
胁迫样品。
(d) 其不足之处是必须反复优化 PCR 条件直到
目的基因和内参基因的扩增效率满足条件
(e) 该方法适合于待检样品种类不多, 但待检
基因种类不少的实验
双标准曲线法的特点有:
(a) 不用考虑不同基因扩增效率的大小差别,
直接用标准曲线来校准扩增效率, 更大限度的避免
了误差
(b) 无需像 2–ΔΔCT法那样对 PCR 实验及扩增效
率进行反复的优化
(c) 其不足之处是每次都需利用目的基因及看
家基因的梯度稀释样品来做标准曲线
(d) 该方法适合待检样品种类较多, 但是待分
析目的基因种类不多的状况
4 实时荧光定量中内参基因的筛选
4.1 内参基因设置的必要性
基因表达研究一般都依赖于杂交或 cDNA 微阵
列, 因其可让同时多个序列分析称为可能。但 qRT-
PCR 确实验证基因结果最精确有效的手段。很多荧
光定量结果很难重复, 原因是实验设计错误或数据
质量不过关。在荧光定量 PCR 中, 所得数据必须经
过均一化处理后才可信, 因为 RT-PCR 在样品处理
及实验中具有很多问题:
① 样品本身的差异
每个细胞都是动态可变的, 当处于不同内部因
素及外部环境中时, 样品本身表达量不一致。从组
5 期 车志群, 等. 荧光定量 PCR 方法及分子标志物在海洋污染监测中的应用进展 237

织提取RNA时, 即使组织样品大小及重量完全相等,
也不能保证其所提取 RNA 量完全相等。
② RNA 提取和纯化过程效率差异很大, 况且
核苷酸本身不是很稳定, 反转录合成 cDNA 时引物
扩增效率太低或不合适[15–16]。
4.2 内参基因筛选原理
一个合格的内参基因必须满足一下条件[17]: ①
表达水平不受实验因素或外界环境条件的影响②在
生物有机体及组织发育的各生理阶段表达水平差异
极小。符合所有条件的只有管家基因——管家基因
的定义就是在细胞生存过程中必须稳定、持续表达
的基因, 也是最先作为内参基因的基因[18]。一般荧
光定量中建议使用最少 2 条内参, 因为一条内参产
生的误差可能较大[19]。或者可使用多种方法定量结
果会更加准确。但是在某些特殊情况下也可使用单
条内参, 比如之前在类似的实验条件下经过验证,
变异较小[18], 但曾有报道称其仍可在 25%结果中产
生 3 倍偏差或在 10%中产生 6 倍偏差[20]。
4.3 常用水生生物内参基因筛选
FENG Liying[21]等对虾夷扇贝正常生理状态下
36中组织样品及15中胚胎/幼虫样品中的12个常用
候选基因进行荧光定量 PCR 筛选, 并用 genorm、
normfinder、相对△CT 法对其进行稳定性分析, 在
最佳、最差内参基因上3种方法结果一致: DEAD 框
RNA 解螺旋酶(HEL1)、泛素(UBQ)、60s 核糖体蛋白
L16(RPL16)为最佳内参基因组合。但是对于不同胚胎
/幼体阶段来讲, 细胞色素 C(CC)、细胞色素 B(CB)、
组蛋白 H3.3(His3.3)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)
所构成组合是最稳定的, 而无论在成年组织还是胚
胎/幼体中, 肌动蛋白(ACT)均是最不稳定的。
MA Liman[22]等利用荧光定量 PCR 对岩礁鱼类
—许氏平鲉不同组织及幼体发育不同阶段的 8 个内
参候选基因进行筛选, 并用 3 种不同算法 genorm、
normfinder、bestkeeper 来评估各基因稳定性。其中,
核糖体蛋白 L17(RPL17)与延长因子 1—α(EF1A)在
不同组织表达分析中表现高度稳定性, 而甘油醛-3-
磷酸脱氢酶(GAPDH)最差。而在幼体发育的不同阶
段, 核糖体蛋白L17(RPL17)、延长因子1—α(EF1A)、
β—肌动蛋白(ACTB)表达最稳定, 而 β—2—微球蛋
白(B2M)最差, 为岩礁鱼类内参基因筛选提供有用
参考, 为其基因表达提供精确数据均一化。
ZHANG Jian[23]对实验室条件下牙鲆及大菱鲆受
细胞肿大病毒感染 24h、72h 后, 9 个管家基因在脑、
鳃、心脏、肠、肾、肝脏、肌肉、脾脏中表达情况用
荧光定量进行验证, 并用 genorm 和 normfinder 对稳
定性进行计算。结果发现: (i)组织类型与感染时间不
同, 基因表达变化差异很大。(ii)在特定感染时间, 两
种算法对大多数组织基因稳定性预测都高度一致。
(iii)不同组织在不同感染时间最佳内参基因不同(iv)
在感染的两个时间点, 所有组织没有一个统一的最
佳内参基因。也就是说, 牙鲆及大菱鲆受病毒感染后,
不同组织和不同感染时间所用内参基因不尽相同。
ZHANG Baocun[24]等用荧光定量研究了条石鲷
受溶藻弧菌、细胞肿大病毒等感染前后 6 个管家基
因表达, 并用 genorm 及 normfinder 对定量数据进行
分析。结果发现: 感染前, RNA 聚合酶 II 转录亚基 8
介质(MRPT)及 β—肌动蛋白(ACTB)为各组织中最
稳定表达基因; 感染后, 各组织间基因稳定性差异
很大, 没有任何一个是在各组织及病原菌刺激下稳
定不变的。而且, 对大多数组织来说细菌和病毒感
染下基因稳定表达是不同的。所以组织类型及感染
源都会影响均一化基因的选择。
YANG Changgeng[25]等研究了尼罗罗非鱼中 7 个
内参候选基因在 7 种组织受病毒感染后免疫相关基因
表达。结果显示: 受到无乳链球菌感染后, 7 个基因在
组织间表达均有差异。受海豚链球菌感染后, 泛素结
合蛋白(UBCE)为肝、脾、肾、脑中最佳内参基因, 一
般条件下, 泛素结合蛋白(UBCE)及 18s 核糖体 RNA
(18srRNA)为最稳定表达内参。所以说选择 2 个以上内
参基因将更适合罗非鱼基因表达的跨组织分析。
5 实时荧光定量 PCR 技术在海洋环境监测中的应用
随着经济的发展, 海洋污染越来越严重, 海洋
沉积物、海洋环境及生物质量都受到不同程度的污
染, 生态环境破坏加剧。而进入海洋的化学物质种
类和数量也越来越多, 尤其是镉、镍、钴、铅等重
金属及酸碱、石油及其产品、除草剂与灭虫剂等农
药、放射性核素以及多环芳烃等工农业生产和日常
生活所产生的多种污染物, 造成海洋环境质量的全
面下降, 严重地威胁着近海脆弱的生态环境[2628]。
5.1 荧光定量 PCR 及分子标志物
为了加强海洋环境保护, 必须准确评估污染物
对海洋的危害程度, 及早进行环境的监测和评价工
238 生 态 科 学 34 卷

作, 传统的海洋污染监测技术还停留在水质、沉淀
物为主, 生物监测为辅的阶段,
一再忽视了海洋环境中污染物产生的生物效应
的研究和监测。传统海洋污染监测虽然可直观
描绘水体中污染物的含量、分布范围、超标率、
超标面积等, 却没法直接描绘所监测环境受
到损害的程度及各种污染物对海洋生态环境所
造成的影响, 更别提在产生污染和危害之前提前进
行预警。
采用生物标志物作为敏感的生物效应“早期
预警”工具, 在环境污染监测中具有非常重要的意
义[29–30]。GOKSOYR A 等提出: 生物标志物是生物
体暴露于亚致死剂量的有毒污染物时, 生物体在分
子、细胞和个体水平上受因自身机体及外部环境影
响环境而产生异常变化的信号指标[31]。因为生物标
志物的这些异常变化发生在污染物对生物体产生严
重损害之前[32], 所以有助于对生物所处的环境中污
染状态及潜在危害及毒性伤害提供早期预警[33]。
污染物对环境尤其是生态系统的产生影响时, 生
态系统的响应肯定是从基因—蛋白—细胞—组织—器
官—个体—种群—群落从微观到宏观逐层显现出来
的, 海洋环境中用于污染监测的常见生物标志物有
①基因类(分子)标志物②蛋白类生物标志物——如
抗氧化酶类、细胞色素 P450 酶系、乙酰胆碱酯酶
(AChE)、金属硫蛋白等③细胞类生物标志物——如
微生物细胞生物荧光、溶酶体和过氧化物酶体、免疫
细胞等④组织(器官类)生物标志物——如性畸变、行
为学生物标志物等[34]。而其中分子标志物更是因对环
境污染物反应灵敏快速, 且特异性强, 所以有助于提
前预警生物体所处的环境污染状态及对生物体的潜
在影响及危害。分子标志物国内外普遍采用方法是采
用荧光定量 PCR 方法对一些潜在分子标志物 mRNA
表达进行检测和分析, 从而为海洋污染提供早期警
报, 作为评估海洋环境健康的早期预警指标。
5.2 国外应用现状
Osorio-Yáñez C 等[35]用苯并芘(Bap)、乙氧基喹
(EQ)等污染物对尼罗蒂长罗非鱼胁迫24h 后, 用荧
光定量 PCR 方法研究了其肝脏内醛还原酶(AKR1A1)
基因、细胞色素 P4501A(CYP4)基因 mRNA 表达的
影响。结果发现: 苯并芘(Bap)、乙氧基喹(EQ)AKR1A1、
CYP4基因的表达均有诱导作用, 且诱导24h 后罗非
鱼肝脏中 AKR1A1、CYP4基因 mRNA 的表达水平分
别显著提高20倍与120倍。
WON E J 等[36]用荧光定量 PCR 研究了多齿围
沙蚕在伊朗原油及苯并芘(Bap)等水溶性成分(WAF)
胁迫下, 3个细胞色素 P450基因(CYP)及抗氧化基因
GST、SOD、CAT 等 mRNA 表达响应。结果证实: 多
齿围沙蚕3个 CYP 基因均可作为海洋石油泄漏事故
后海洋沉积物污染监测的生物标志物。
PHAM C H 等[37]对雄性青鳉鱼1 gL–1、25 gL–1
银纳米粒子 (Ag-NPs) 及 1.6 gL–1 、 39.5 gL–1
AgNO3 (硝酸银)慢性毒性胁迫7 d、21 d、28 d 后, 肝
脏内8种压力相关基因的表达利用荧光定量 PCR 进
行了分析。结果发现: 在青鳉受1 gL–1 Ag-NPs 胁
迫不同时间后肝脏内的 Mt 及 GST 基因均被显著诱
导, Orla 基因仅在 1 gL–1 Ag-NPs 胁迫 7 d 后才被
轻微诱导, 在所有胁迫最后阶段 P53及 HSP70 基因
都受到抑制。而 TF 在受 Ag-NPs 和 AgNO3两种浓
度胁迫 21 天后均有抑制。所以 Ag-NPs 增加了重金
属解毒、氧化及炎症压力, 最终激活青鳉的免疫应
答。Ag-NPs 对雄性青鳉 Chg-L、VTG1的显著诱导,
尤其是胁迫7 d 或21 d 后, 与对照组和 AgNO3组间
的对比是第一次对 Ag-NPs 雌激素效应的研究。
MAO H等[38]采用RACE从日本蟳睾丸总RNA中
调取完整Mt cDNA并对其进行进行测序和分析, 并利
用镉(Cd)对其进行胁迫后发现日本蟳睾丸形态及 Mt
mRNA 表达异常, 两者均显示睾丸 Mt 对重金属镉的
反应灵敏, 因此认为 Mt 是镉污染很好的生物标志物。
5.3 国内应用现状
刘娜等[39]根据目前近海区域多环芳烃污染严重
的现状, 以近海养殖重要经济贝类菲律宾蛤仔为对
象, 利用荧光定量PCR研究其在0 gL–1、0.25 gL–1、
1 gL–1、4 gL–1 苯并芘(BaP)胁迫 0 d、3 d、10 d
后 28 种与胁迫、免疫、信号转导等代谢相关基因[40]
及抗氧化、解毒代谢相关功能基因[41–42]的 mRNA 表
达情况, 结果发现: 菲律宾蛤仔 28 种功能基因中,
有 12 种基因 mRNA 表达与 BaP 浓度呈显著的线
性关系(P<0.05): 硫酯包含蛋白在染毒处理 3 d 时
与 BaP 浓度呈显著的正相关(P<0.05), 防卫素、丝
氨酸蛋白酶、谷胱苷肽 S-转移酶 Pipi-GST、超氧化
物歧化酶 Mn-SOD、硒依赖的谷胱甘肽过氧化物酶
se-GPx、芳香烃受体核易位蛋白 ARNT 和热激蛋白
HSP 40A 在染毒处理 10 d 时与 BaP 浓度呈显著正
5 期 车志群, 等. 荧光定量 PCR 方法及分子标志物在海洋污染监测中的应用进展 239

相关(P<0.05), 细胞色素 CYP4、谷胱甘肽转移酶
GST C、凝集素C-lectin 和 过氧化氢酶CAT在 3 d、
10 d 时与污染物浓度呈显著的线性正相关关系(P<
0.05)。从而为海洋环境苯并芘(BaP)污染在基因水平
提供了高效灵敏的分子生物标志物。
李春勇等[43]以在近海海域广泛分布的重要海洋
监测生物近江牡蛎为研究对象, 对其在 0.5 gL–1、
0.2 gL–1、0.005 gL–1、0.001 gL–1、0.0001 gL–1
有机磷农药敌百虫胁迫 3 d、7 d、20 d, 利用荧光定
量 PCR 研究其闭壳肌、鳃、外套膜、消化腺等四种
组织中热激蛋白 HSP70 的 mRNA 表达。结果发现:
近江牡蛎四种组织 HSC7O 都对低浓度的敌百虫污
染反应灵敏,尤其鳃 HSC7O 对敌百虫处理反应最敏
感,因此,鳃是一种比较合适的污染物监测组织材料,
HSC70 是适宜的潜在污染预警分子。
钟玉民等[44]研究了 Cu2+和 Zn2+对缢蛏的急性毒
性浓度, 并克隆了缢蛏 ALP 基因, 利用荧光定量
PCR 法分析了在不同浓度 Cu2+和 Zn2+胁迫下, 缢
蛏不同组织中 ALP 基因在不同时间的表达情况。
研究结果可为缢蛏在环境污染胁迫下其他的免疫基
因的研究提供基础。
宫晓莉等[45]研究了四溴双酚 A(TBBPA)对沿海
重要养殖贝类栉孔扇贝所产生的毒性效应, 并利用
抑制性消减杂交技术筛选了受 TBBPA 胁迫时的差
异表达基因, 并利用荧光定量 PCR 对栉孔扇贝的谷
胱甘肽转移酶GST以及热激蛋白HSP70进行表达研
究。结果显示: 以上基因与 TBBPA 污染具有一定的
时间剂量关系, 可作为海洋环境TBBPA污染监测的
有效分子生物标志物[46–47]。
6 展望
随着海洋环境污染的加剧, 为了提前进行污染
预警和预防, 海洋污染监测就不能仍旧停留在以水
质、沉淀物为主, 生物监测为辅的阶段, 而是迫切需
要新技术在产生污染和危害前提前进行预警。随着各
种荧光定量 PCR 方法及分析方法的建立和改进, 使
得分子层次的生物标志物得以检测, 从而使海洋监
测变的更灵敏、特异性更强, 荧光定量 PCR 与分子标
志物方法必将在未来海洋监测中得到更广泛的利用。
参考文献
[1] HIGUCHI R, FOCKLER C, DOLLINGER C, et al.Kinetic
PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification
reactions[J]. Nature Biotechnology, 1993, 11(9): 1026–1030.
[2] FOULDS I V, GUY R A, KAPOOR A, et al. Application of
quantitative real-time PCR with dual-labeled hydrolysis
probes to microbialwater quality monitoring[J]. Journal of
Biomolecular Techniques, 2002, 13(4): 272–276.
[3] REES C B, LI Weiming. Development and application of a
real-time quantitative PCR assay for determining CYP1A
transcripts in three genera of salmonids[J]. Aquatic
Toxicology, 2004, 66 (4): 357–368.
[4] 付春华, 陈孝平, 余龙江. 实时荧光定量 PCR 的应用和
进展[J]. 激光生物学报, 2005, 14(6): 466–471.
[5] 陈旭, 齐凤坤, 康立功, 等. 实时荧光定量 PCR 技术研
究进展及其应用[J]. 东北农业大学学报, 2010, 41(8):
145–148.
[6] GELMINI S, ORLANDO C, SESTINI R, et al. Quantitative
polymerase chain reaction-based homogeneous assay with
fluorogenic probes to measure c-erbB-2 oncogene amplify-
cation [J]. Clinical Chemistry, 1997, 43(5): 752–758.
[7] 李丽, 赵成萍, 李宏, 等. 质粒制备绝对定量 PCR 标准
曲线方法的建立[J]. 农业生物技术学报, 2011, 19(6):
1157–1162.
[8] 唐永凯, 贾永义．荧光定量 PCR 数据处理方法的探讨[J].
生物技术, 2008, 18(3): 89–91.
[9] PETTENGILL E A, LINE C P, COLEMAN G D.
Evaluation of qPCR reference genes in two genotypes of
Populus for use in photoperiod and low-temperature
studies[J]. BMC Research Notes, 2012(5): 366.
[10] TAYLOR S, WAKEM M, DIJKMAN G, et al. A practical
approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the
MIQE guidelines[J]. Methods, 2010, 50(4): S1–S5.
[11] 柳方方, 张玲, 王晶, 等. 数字 PCR 测定 DNA 含量及
测量结果不确定度评定[J].化学分析计量, 2013, 22(1):
18–22.
[12] 伯乐生命医学产品(上海)有限公司. 荧光定量 PCR 应用
指南[EB/OL]. http: //www.biorad.bioon.com.cn/, 2014-08-20.
[13] 宝生物工程(大连)有限公司. 定量 PCR-Competitive PCR
与 Real Time PCR[EB／OL]．http: // www.takara. com.cn/,
2014-08-20.
[14] KOZERA B, RAPACZ M. Reference genes in real-time
PCR[J]. Journal of Applied Genetics, 2013, 54(4):
391–406.
[15] BUSTIN S A, BENES V, GARSON J A, et al. The MIQE
guidelines: minimum information for publication of
quantitative real-time PCR experiments[J]. Clinical Chemistry,
2009, 55(4): 611–622.
[16] MALLONA I, LISCHEWSKI S, WEISS J, et al.Validation
of reference genes for quantitative real-time PCR during
leaf and flower development in Petunia hybrida[J].BMC
Plant Biology, 2010, 10: 4.
[17] CHERVONEVA I, LI Y, SCHULZ S, et al. Selection of
optimal reference genes for normalization in quantitative
RT-PCR[J]. BMC Bioinformatics, 2010, 11: 253–268.
[18] THELLIN O, ZORZI W, LAKAYE B, et al. Housekeeping
genes as internal standards: Use and limits[J]. Journal of
Biotechnology, 1999, 75(2/3): 291–295.
[19] NICOT N, HAUSMAN J F, HOFFMANN L, et al. House-
keeping gene selection for real-time RT-PCR normalization
in potato during biotic and abiotic stress[J]. Journal of
240 生 态 科 学 34 卷

experimental botany, 2005, 56(421): 2907–2914.
[20] DERVEAUX S, VANDESOMPELE, HELLEMANS J.
How to do successful gene expression analysis using real-
time PCR.Methods, 2010, 50(4): 227–230.
[21] FENG Liying, YU Qian, LI Xue, et al. Identification of
Reference Genes for qRT-PCR Analysis in Yesso Scallop
Patinopecten yessoensis[J]. PLoS One, 2013, 8(9): e75609.
[22] MA Liman, WANG Wenji, LIU Conghui, et al. Selection of
reference genes for reverse transcription quantitative real-
time PCR normalization in black rockfish (Sebastes
schlegeli)[J]. Marine Genomics, 2013, 11: 67–73.
[23] ZHANG Jian, HU Yonghua, SUN Boguang, et al. Selection
of normalization factors for quantitative real time RT-
PCR studies in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)
and turbot (Scophthalmus maximus) under conditions of
viral infection[J]. Veterinary Immunology and Immuno-
pathology, 2013, 152(3/4): 303–316.
[24] ZHANG Baocun, SUN Li, XIAO Zhizhong, et al.
Quantitative real time RT-PCR study of pathogen-induced
gene expression in rock bream (Oplegnathus fasciatus):
Internal controls for data normalization[J]. Marine Genomics,
2014, 15: 75–84.
[25] YANG Changgeng, WANG Xianli, TIAN Juan, et al.
Evaluation of reference genes for quantitative real-time
RT-PCR analysis of gene expression in Nile tilapia
(Oreochromis niloticus)[J]. Gene, 2013, 527 9(1): 183–192.
[26] ROSS J R, ORSS D R. Polycyclic aromatic hydrocarbons
in the San Francisco Estuary water column: sources, spatial
distributions, and temporal trends (1993-2001)[J]. Chemo-
sphere, 2004, 57(8): 909–920.
[27] TELLI-KARAKOC F, TOLUN L, HENKELMANN B,
et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and
polychlorinated biphenyls (PCBs) distributions in the Bay
of Marmara Sea: Izmit Bay[J]. Environmental Pollution,
2002, 119(3): 383–397.
[28] OHWADA K. YAMADA M, TAKADA H, TOYODA K, et
al. Study on the fate of petroleum-derived polycyclic
aromatic Hydrocarbons (PAHs) and the effect of chemical
dispersant using an enclosed Ecosystem, Mesocosm [J].
Marine Pollution Bulletin, 2003(1–6): 105–113.
[29] DE LA TORRE F R, FERRARI L, SALIBIÁN A.
Biomarkers of a native fish species (Cnesterodon
decemmaculatus) application to the water toxicity assess-
ment of a peri-urban polluted river of Argentina[J]. Chemo-
sphere, 2005, 59(4): 577–583.
[30] CAJARABILLE M P, BEBIANNO M J, BLASCO J, et al.
The use of biomarkers to assess the impact of pollution in
coastal environment of the Iberian Peninsula: a practical
approach[J]. The Science of the Total Environment, 2000,
247(2/3): 295–311.
[31] GOKSOYR A, BEYER J, EGAAS E. Biomarker responses
in flounder (Platich thys flesus) and their use in pollution
monitoring[J]. Marine Pollution Bulletin, 1996, 33(1/6):
36–45.
[32] BODIN N, BURGEOT T, STANISIDRE J Y, et al.Seasonal
variations of a battery of biomarkers and physiological
indices for the mussel Mytilus galloprovincialis transplanted
into the northwest Mediterranean Sea[J]. Comparative Bioche-
mistry and Physiology Toxicology & Pharmacology, 2004,
138(4): 411–427.
[33] WAN Bin. Research progress of biomarkers in ecotoxico-
logy[J]. Foreign Medical Sciences: Section of Hygiene,
2000, 27(2): 110–114.
[34] 蔡中华, 陈艳萍, 周进, 等. 生物标志物(Biomarkers)在
海洋环境监测中的研究与进展[J]. 生命科学, 2012, 24(9):
1035–1048.
[35] OSORIO-YÁÑEZ C, GARCÍA-TAVERA J L, PÉREZ-
NÚÑEZ M T, et al. Benzo(a)pyrene induces hepatic
AKR1A1 mRNA expression in tilapia fish (Oreochromis
niloticus)[J]. Toxicology Mechanisms and Methods, 2012,
22(6): 438–444.
[36] WON E J, RHEE J S, SHIN K H, et al. Expression of three
novel cytochrome P450 (CYP) and antioxidative genes
from the polychaete, Perinereis nuntia exposed to water
accommodated fraction (WAF) of Iranian crude oil and
Benzo[]pyrene[J]. Marine Environmental Research, 2013,
90: 75–84.
[37] PHAM C H, YI J, GU M B. Biomarker gene response in
male Medaka (Oryzias latipes) chronically exposed to
silver nanoparticle[J]. Ecotoxicology and Environmental
Safety, 2012, 78: 239–245.
[38] MAO Huan, TAN Fuqing, WANG Dahui, et al.Expression
and function analysis of metallothionein in the testis of
stone crab Charybdis japonica exposed to cadmium[J].
aquatic toxicology, 2012, 124–125: 11–21.
[39] 刘娜. 菲律宾蛤仔在苯并芘胁迫下差异基因的筛选与分
子标志物的研究[D]. 青岛: 中国海洋大学. 2012: 1–145.
[40] LIU Na, PAN Luqing, MIAO jingjing , et al. Molecular
cloning and sequence analysis and the response of a aryl
hydrocarbon receptor homologue gene in the clam
Ruditapes philippinarum exposed to benzo(a)pyrene[J].
Comparative Biochemistry and Physiology Toxicology &
Pharmacology, 2010, 152(3) 279–287.
[41] PAN Luqing, LIU Na, XU Chaoqun, et al. Identification
and expression of a novel cytochrome P450 gene, belong to
CYP4, in the clam Ruditapes philippinarum exposed to
benzo(a)pyrene [J]. Environmental Toxicology and Phar-
macology, 2011, 32: 390–398.
[42] XU Chaoqun, PAN Luqing, LIU Na, et al. Cloning,
characterization and tissue distribution of a pi-class
glutathione S-transferase from clam (Venerupis philippinarum):
Response to benzo[]pyrene exposure[J]. Comparative Bio-
chemistry and Physiology Part C, 2010, 152(2): 160–166.
[43] 李春勇.敌百虫诱导近江牡蛎 HSC70 基因表达的定量研
究[D]. 广州: 暨南大学, 2007: 1–68.
[44] 钟玉民. 缢蛏碱性磷酸酶基因的克隆及重金属铜和锌对
其表达的影响[D]. 上海: 上海海洋大学, 2012: 1–57.
[45] 宫晓莉. 四溴双酚 A(TBBPA)对栉孔扇贝毒性效应与差异
基因筛选的研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2012: 1–79.
[46] 潘鲁青, 宫晓莉, 许超群, 等. 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔
组织解毒代谢基因表达的影响[J]. 中国水产科学 2012,
19(2): 1–7.
[47] GONG Xiaoli, PAN Luqing, MIAO Jingjing, et al.
Application of SSH and quantitative real time PCR to
construction of gene expression profiles from scallop
Chlamys farreri in response to exposure to tetrabromo-
bisphenol A[J]. Environmental Toxicology and Pharmaco-
logy, 2012, 34(3): 911–918.