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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):84-89
白细胞介素 24（IL-24）是近年来发现的一种肿
瘤细胞抑制因子。IL-24 基因最初是在 1995 年由美
国哥伦比亚大学的 Jiang 等［1］生物学家通过差示杂
交的方法从人类黑色素瘤细胞中克隆得到的。因它
可以诱导黑色素瘤细胞分化，故又名为黑色素瘤分
化相关基因 -7（mda-7）［2］。人 mda-7 基因为单拷贝
收稿日期 ：2015-04-22
基金项目 ：湖北省自然科学基金项目（2014CFB802）
作者简介 ：喻放，男，硕士研究生，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail ：358311135@qq.com
通讯作者 ：左振宇，男，副教授，硕士生导师，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：zuozhenyu@wust.edu.cn
范汉东，男，博士，教授，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail ：fanhandong@whu.edu.cn
人 IL-24 基因原核表达载体的构建及蛋白的表达纯化
喻放1  杨忠华1  范汉东2  左振宇1
（1. 武汉科技大学，武汉 430081 ；2. 杭州师范大学衰老研究所，杭州 310036）
摘 要 ： 构建人白细胞介素 24（IL-24）原核表达载体并利用 ELP-Intein 系统表达纯化可溶性的 IL-24 蛋白。通过 PCR 扩增
不含信号肽的人 IL-24 基因，将 IL-24 基因插入 pET-ELP-Intein 质粒构建重组表达载体 pET-ELP-Intein-IL-24。将重组质粒转化至 E.coli
BLR（DE3），20℃下经 IPTG 诱导表达。利用 ELP 蛋白在不同温度下发生相变的特点和 Intein 蛋白的自切割反应纯化可溶性 IL-24 蛋白，
将纯化得到的 IL-24 蛋白进行 Western blot 鉴定。用 Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒检测 IL-24 蛋白的生物学活性。成功构
建了重组表达载体 pET-ELP-Intein-IL-24，第一次通过原核表达方法表达并纯化出了可溶性的 IL-24 蛋白。Western blot 检测显示目
的蛋白能与 IL-24 抗体特异性结合，表明纯化出的蛋白确实为 IL-24 蛋白。细胞凋亡检测实验证明 IL-24 蛋白能显著地诱导 hepG2
细胞发生凋亡。
关键词 ： 白细胞介素 24 ；质粒构建 ；原核表达 ；蛋白纯化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.011
The Construction of Prokaryotic Expression Vector for Human Gene
IL-24 and Expression and Purification of Its Protein
YU Fang1 YANG Zhong-hua1 FAN Han-dong2 ZUO Zhen-yu1
（1. Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081 ；2. Institute of Aging Research of Hangzhou Normal University，
Hangzhou 310036）
Abstract: This work aims to construct a prokaryotic expression vector for human gene IL-24, and express and purify soluble IL-24 protein
via ELP-Intein system. The human gene IL-24 without signal peptide was amplified by PCR and cloned into vector pET-ELP-Intein, and the
recombinant expression vector pET-ELP-Intein-IL-24 was constructed. The recombinant plasmid was transformed to Escherichia coli BLR（DE3）,
and the expression was induced at 20℃ by IPTG. The soluble IL-24 protein was purified based on the transformation of ELP protein at different
temperatures and the self-cleavage reaction of Intein protein. The purified protein was identified by Western blot. The bioactivity of IL-24
protein was measured by Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit. The recombinant expression vector pET-ELP-Intein-IL-24 was successfully
constructed, and the soluble IL-24 protein was expressed for the first time by prokaryotic vector and purified. Western blot analysis showed
the target protein specifically bound with IL-24 antibody, which proved that the purified protein was indeed IL-24 protein. Apoptosis detection
experiment confirmed that IL-24 protein significantly induced the apoptosis of hepG2 cells.
Key words: IL-24 ；recombinant plasmid construction ；prokaryotic expression ；protein purification
2016,32(2) 85喻放等：人 IL-24 基因原核表达载体的构建及蛋白的表达纯化
基因，包含 7 个外显子和 6 个内含子，与 IL-10 家族
的 IL-10、IL-20 等共同定位于人一号染色体的 lq32，
其 cDNA 全长为 1 718 bp，mRNA 长约 2 kb，编码由
206 个氨基酸组成、相对分子质量约为 23.8 kD 的蛋
白质［3-5］。IL-24 蛋白 N 端含有一个包含 49 个氨基
酸的信号肽，此信号肽与蛋白的分泌和切割密切相
关［6］。IL-24 蛋白能抑制包括肝癌、肺癌、胰腺癌、
卵巢癌、结肠癌、前列腺癌等大多数肿瘤细胞的生长，
具有广谱的抗肿瘤效应，且对正常细胞的生长没有
影响［7，8］。IL-24 是目前发现的唯一一种既具有肿
瘤抑制特性又能刺激免疫功能的细胞因子，其 II 期
临床研究证实 IL-24 蛋白的有效性与安全性［9］。因
此 IL-24 在肿瘤的临床治疗方面具有广阔的应用前
景。本研究拟构建人不包含信号肽的 IL-24 基因的
原核表达载体，通过 Banki 等［10］建立的 ELP-Intein
表达纯化系统进行 IL-24 蛋白的原核表达和纯化，
为 IL-24 在肿瘤临床治疗的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
E.coli DH5α、E.coli BLR（DE3）、hepG2 细 胞
为本实验室保存 ；原核表达载体 pET-ELP-Intein 为
杭州师范大学李建峰老师赠送 ；Taq DNA 聚合酶、
限 制 性 内 切 酶 BsrG I 和 Hind Ⅲ、T4 DNA ligase 购
自 NEB 公 司、DNA Marker、 蛋 白 Marker、Annexin
V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自 TaKaRa 公司 ；
兔抗 IL-24 抗体和荧光标记的羊抗兔 IgG 二抗购自
Abcam 公司 ；质粒小量提取试剂盒、PCR 产物回
收试剂盒购自 AxyGEN 公司 ；氨苄青霉素、IPTG、
Tris-HCl、十二烷基硫酸钠（SDS）、30% 丙烯酰胺、
过硫酸铵、甘氨酸、叠氮化钠、考马斯亮蓝 R-250
等试剂购自 Solarbio 公司 ；引物合成服务由上海捷
瑞生物技术有限公司完成 ；基因测序服务由上海美
吉生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 引物设计及基因扩增 根据 GenBank 中不含
信号肽的人 IL-24 基因序列，设计引物 IL-24-F ：5-
GCGTGTACAATGGGGGCCCAGGGCCAAGAGTTTC-
ACT 3（划线部分为 BsrG I 酶切位点，前面 3 个为保
护 碱 基 ），IL-24-R ：5-CCCAAGCTTTCAGAGCTTG-
TAGAATTTCTGCATC-3（划线部分为 Hind III 酶切
位点，前面 3 个为保护碱基），以肝癌细胞 hepG2 的
cDNA 为模板，扩增不含信号肽的人 IL-24 基因（480
bp）。PCR 反应条件为 ：95℃预变性 2 min ；95℃变
性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，循环 30 次；
72℃再延伸 5 min。PCR 产物以 1% 的琼脂糖凝胶电
泳进行检测，切下胶上的目的条带后使用 DNA 回收
试剂盒回收纯化。
1.2.2 重组质粒 pET-ELP-Intein-IL-24 的构建 将回
收的 PCR 产物和 pET-ELP-Intein 质粒用限制性内切
酶 BsrG I 和 Hind III 双酶切，回收酶切产物，利用
T4 DNA 连接酶将双酶切后的 IL-24 基因和 pET-ELP-
Intein 质粒进行连接，连接产物转化至 E.coli DH5α
感受态细胞，在含有氨苄青霉素抗性的 LB 平板中
筛选阳性转化子。挑出单克隆接种 LB 液体培养基
培养，提取质粒，将质粒用 BsrG I 和 Hind III 双酶
切鉴定，鉴定正确后送至上海美吉生物公司进行性
DNA 测序。
1.2.3 ELP-Intein-IL-24 融合蛋白的诱导表达 将测
序正确的重组质粒 pET-ELP-Intein-IL-24 转化至 E.coli
BLR（DE3）感受态细胞，在含有氨苄青霉素抗性的
LB 平板中筛选阳性转化子。挑出单克隆接种 LB 液
体培养基培养，提取质粒，将质粒用 BsrG I 和 Hind
III 双酶切鉴定。将鉴定正确的单菌落接种于含氨苄
青霉素的 LB 液体培养基中，37℃，200 r/min 振荡
培养过夜。按 1∶100 将培养过夜的菌液转接于 LB
液体培养基中，37℃，200 r/min 振荡培养至 OD600
达到 0.5 左右，加入 IPTG 至终浓度为 0.5 mmol/L，
20℃，150 r/min 诱导培养 12 h。离心收集菌体，超
声破碎，菌液破碎后将上清和沉淀中的蛋白进行
12% SDS-PAGE 电泳检测。
1.2.4 ELP-Intein-IL-24 融 合 蛋 白 的 纯 化 菌 液
超声破碎后，收集上清，加入等体积的 0.8 mol/L
（NH4）2SO4 溶液（降低融合蛋白的 Tt），轻轻混匀，
放入 37℃恒温水浴锅静置 20 min，使融合蛋白发
生相变反应（此时由于溶液温度高于 Tt，融合蛋白
是以固体形式存在于沉淀中，但杂蛋白却不会发生
相变反应，所以杂蛋白会随着上清一起被除去）；
37℃，16 000×g 离心 10 min，弃上清 ；用预冷的
PBS 缓冲液重新悬浮含有融合蛋白的沉淀，使融合
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.286
蛋白重新溶解（此时由于溶液温度低于 Tt，融合蛋
白会重新变为可融状态，溶解在 PBS 缓冲液中）；
4℃，16 000×g 离心 10 min，弃沉淀，将上清收集
在干净的 EP 管中 ；重复上述步骤进行第 2 轮相变反
应，提高融合蛋白的纯度。纯化后的蛋白进行 12%
SDS-PAGE 电泳检测。
1.2.5 ELP-Intein-IL-24 融合蛋白的自切割反应 In-
tein 蛋白在 25℃左右，pH6.5 的条件下能在巯基化
合物的作用下发生自我切割反应，将 Intein 蛋白 N
端或 C 端的目的蛋白切割下来。
按 0.585 g/L EDTA、8.368 g/L Bis-Tris、1% 巯
基乙醇溶解于 PBS 缓冲液中，调整 pH 值至 6.5，配
制成 Intein 自切割缓冲液。将溶解于 Intein 自切割
缓冲液的融合蛋白置于 25℃水浴中，进行 Intein 蛋
白自我切割反应，以释放目的蛋白。15 h 后自动
切割过程结束，向溶液中加入等体积的 0.8 mol/L
（NH4）2SO4 溶 液，37℃ 水 浴 静 置 20 min， 使 ELP-
Intein 标签发生相变。切割下的 ELP-Intein 标签和未
切割完全的融合蛋白将转变为沉淀，失去标签的目
的蛋白则保持可溶状态存在于上清中。切割下来的
目的蛋白进行 12% SDS-PAGE 电泳检测。
1.2.6 IL-24 蛋白的 Western blot 鉴定 取适量切割
下来的 IL-24 蛋白，100℃加热变性处理后，进行
SDS-PAGE 电泳实验，然后将目的蛋白条带点转移
至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用抗体封闭液室温
振荡封闭 1 h 后，依次加入兔抗 IL-24 抗体和荧光标
记的羊抗兔 IgG 二抗，在红外荧光扫描成像仪观察
实验结果。
1.2.7 IL-24 蛋 白 诱 导 肝 癌 细 胞 hepG2 凋 亡 的 检
测 于 12 孔细胞培养板中将 hepG2 细胞在含 10%
胎牛血清的 DMEM 培养基中培养传代 4 次至对数生
长期，将原核表达的 IL-24 蛋白过滤除菌后加入细
胞培养孔中，使终浓度为 20 mg/L，另外一个细胞培
养孔中不加 IL-24 蛋白作为对照组，置于 37℃ CO2
细胞培养箱中培养 24 h 后，分别收集并洗涤实验组
和对照组细胞，将细胞用 Sigma 凋亡检测试剂盒内
的 1×Binding Buffer 均匀悬浮 ；吸取 500 μL 细胞悬
浮液于 1.5 mL EP 管中，加入 5 μL Annexin V-FITC
和 10 μL PI 轻轻混匀后于 4℃避光反应 15 min ；用
200 目滤膜过细胞悬液，1 h 内用流式细胞仪检测细
胞凋亡率。
2 结果
2.1 IL-24基因扩增
如图 1 所示，以肝癌细胞 hepG2 的 cDNA 为模
板进行 IL-24 基因的 PCR 扩增，产物经 1% 琼脂糖
凝胶电泳检测，能得到一条 480 bp 左右的条带，与
目的基因大小相符。
M 1
500
bp
250
M ：DNA marker ；1 ：IL-24 基因
图 1 IL-24 基因的 PCR 扩增
2.2 重组质粒pET-ELP-Intein-IL-24的构建与鉴定
如图 2 所示，将重组质粒 pET-ELP-Intein-IL-24
用 BsrG I 和 Hind III 双酶切后，获得一条 480 bp 左
右的条带，此条带大小与 IL-24 基因大小相符。将双
酶切鉴定正确的质粒进行基因测序，测序结果表明
连入 pET-ELP-Intein 质粒中的 IL-24 基因与 GenBank
中 IL-24 基因的碱基序列完全一致，说明重组质粒
pET-ELP-Intein-IL-24 构建成功。
M 1 2 3
500
bp
M ：DNA marker ；1 ：IL-24 基因 ；2 ：双酶切的重组质粒 pET-ELP-Intein-IL-24 ；
3 ：连接前的 pET-ELP-Intein 质粒
图 2 重组质粒 PET-ELP-Intein-IL-24 双酶切鉴定
2016,32(2) 87喻放等：人 IL-24 基因原核表达载体的构建及蛋白的表达纯化
2.3 ELP-Intein-IL-24融合蛋白的诱导表达
将 重 组 PET-ELP-Intein-IL-24 质 粒 转 化 到 宿 主
菌株 BLR（DE3）中并筛选出阳性重组子，重组菌
株在 LB 培养基中培养至 OD600 达到 0.5 左右，加入
IPTG 至终浓度为 0.5 mmol/L，20℃，150 r/min 诱导
培养 12 h。离心收集菌体，超声破碎，对上清和沉
淀分别进行 12% SDS-PAGE 电泳检测。如图 3 所示，
上清中明显有一条 50 kD 左右的蛋白条带，与 ELP-
Intein-IL-24 融合蛋白的大小相符，沉淀中在 50 kD
处的条带并不明显，没有转化 pET-ELP-Intein-IL-24
质粒的 BLR（DE3）菌株表达产物在 50 kD 处也无
明显条带。说明 ELP-Intein-IL-24 融合蛋白诱导表达
成功，且表达出的融合蛋白是可溶的。
（图 6），在荧光成像仪下观察到在 18 kD 处明显有
一条带，说明此蛋白为 IL-24 蛋白。
M 1 2 3
55
kD
M ：蛋白 marker ；1 ：未转化 PET-ELP-Intein-IL-24 质粒的 BLR（DE3）菌株
表达产物 ；2 ：转化 pET-ELP-Intein-IL-24 质粒的 BLR（DE3）菌株表达产物
超声破碎上清 ；3 ：转化 pET-ELP-Intein-IL-24 质粒的 BLR（DE3）菌株表达
产物超声破碎沉淀
图 3 ELP-Intein-IL-24 融合蛋白的 SDS-PAGE 电泳检测
2.4 ELP-Intein-IL-24融合蛋白的纯化
如图 4 所示，加入（NH4）2SO4 溶液降低 ELP-
Intein-IL-24 融合蛋白的 Tt 后，经过两轮相变反应，
能去除绝大多数杂蛋白，得到高纯度的 ELP-Intein-
IL-24 融合蛋白。
2.5 ELP-Intein-IL-24融合蛋白的自切割反应
如图 5 所示，ELP-Intein-IL-24 融合蛋白 25℃下
在自切割缓冲液中进行自切割反应 20 h 后，能成功
切割掉 ELP-Intein 标签，得到 18 kD 左右大小的蛋
白，与人 IL-24 蛋白大小相符。
2.6 IL-24蛋白的Western blot鉴定
将去掉标签的 IL-24 蛋白进行 Western blot 实验
M 1 2
50
kD
M ：蛋白 marker ；1，2 ：纯化后的 ELP-Intein-IL-24 融合蛋白
图 4 ELP-Intein-IL-24 融合蛋白纯化后的 SDS-PAGE 电
泳检测
M1 2
18
kD
M ：蛋白 marker ；1，2 ：去掉 ELP-Intein 标签的 IL-24 蛋白
图 5 自切割后的 IL-24 蛋白 SDS-PAGE 电泳检测
M1 2
18
kD
M ：蛋白 marker ；1，2 ：IL-24 蛋白
图 6 IL-24 蛋白的 Western blot 鉴定
2.7 IL-24蛋白诱导hepG2细胞凋亡的检测
图 7 和图 8 分别为细胞凋亡的流式检测结果，
将流式数据制作成表格，如表 1 所示。培养 24 h 后，
不加 IL-24 蛋白处理的对照组中 hepG2 细胞的中凋
亡率只有 17.90%，加入 IL-24 蛋白处理后，hepG2
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.288
细胞的凋亡率明显升高，达到了 57.75%，说明原核
表达的 IL-24 蛋白具有明显的诱导肝癌细胞 hepG2
凋亡的生物学活性。
3 讨论
IL-24 具有明显的抗肿瘤效果，在恶性肿瘤的临
床治疗方面具有极大的应用前景。人体内 IL-24 的
表达主要集中在具有免疫功能的一些细胞，如外周
血单核细胞、巨噬细胞、NK 细胞和正常的黑色素瘤
细胞［11-13］。IL-24 的对肿瘤的抑制作用不依赖于 p21
和 p53 等抑癌基因的活性来实现［14］。此外，IL-24
还可以抑制肿瘤的转移、抑制肿瘤血管的形成以
及提高恶性肿瘤对化疗和放疗的敏感性［15-17］。Pan
等［18］将腺病毒介导的 IL-24 基因（Ad-IL-24）导入
胰腺癌细胞后，实验发现 Ad-IL-24 可以通过显著上
调 Bax、Caspase 和 下 调 VEGF、CD34 和 bcl-2 的 表
达来诱导胰腺癌细胞发生凋亡，并且对正常细胞没
有明显影响。
传统的原核表达方法虽然能表达 IL-24 蛋白，
但产物往往是存在于包涵体之中［19］，要经过包涵体
溶解、变性、复性等过程后才能进行 IL-24 蛋白的
层析柱纯化［20］。然而经过变复性的蛋白很难保持
原有的生物学活性，而且用层析柱进行蛋白纯化不
仅操作繁琐，而且成本高。本研究使用 ELP-Intein
系统进行 IL-24 蛋白的原核表达，利用类弹性蛋白
ELP 在不同温度下的可逆相变特性和内含肽 Intein
的自切割反应进行 IL-24 蛋白的纯化［21］。成功表达
并纯化出了可溶且有抗肿瘤生物学活性的 IL-24 蛋
白，为进一步研究 IL-24 蛋白的功能及其在肿瘤临
床治疗上的应用奠定了基础。
4 结论
本 研 究 成 功 构 建 了 重 组 质 粒 pET-ELP-Intein-
IL-24，利用 ELP-Intein 表达系统表达并纯化了具有
生物学活性的 IL-24 蛋白，通过原核表达获得了可
溶并具有生物学活性的 IL-24 蛋白。
参 考 文 献
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104
103
102
FL
2-
H
::P
I
101
100
100
Q4
81.5%
Q3
9.44%
Q1
0.555%
Q2
8.46%
101
FL1-H::AnnexinV
102 103 104
图 7 对照组细胞凋亡检测
104
103
102
FL
2-
H
::P
I
101
100
100
Q4
42.1%
Q3
48.9%
Q1
0.191%
Q2
8.85%
101
FL1-H::AnnexinV
102 103 104
图 8 实验组细胞凋亡检测
表 1 各样品中正常细胞与凋亡细胞所占比例
样品名 正常细胞比例 /% 凋亡细胞比例 /%
对照组 81.50 17.90
实验组 42.10 57.75
2016,32(2) 89喻放等：人 IL-24 基因原核表达载体的构建及蛋白的表达纯化
375-384.
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（责任编辑 李楠）