全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(４): ３７６￣３８３(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣１０￣２１ꎻ 修回日期: ２０１５￣０３￣２８
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１４０１７０９ꎻ ３１０７０１３１)ꎻ海南省重大科技项目(ＺＤＺＸ２０１３０２３)ꎻ中央级公益性科研院所基本科研业
务费专项资助(ＩＴＢＢ１１０３０４)ꎮ
通讯作者: 刘志昕ꎬ研究员ꎬ主要从事植物分子病毒学研究ꎻ Ｔｅｌ:０８９８￣６６８９０７７０ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｌｉｕｚｈｉｘｉｎ＠ ｉｔｂｂ.ｏｒｇ.ｃｎ
第一作者: 余乃通ꎬ男ꎬ浙江苍南人ꎬ助理研究员ꎬ主要从事植物分子病毒学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙｕｎａｉｔｏｎｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０４.００６
酵母双杂交 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ
诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选
余乃通ꎬ 王健华ꎬ 张雨良ꎬ 周 朋ꎬ 刘志昕∗
(中国热带农业科学院热带生物技术研究所ꎬ农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室ꎬ海口 ５７１１０１)
摘要:香蕉束顶病毒 ＤＮＡ２组分编码蛋白的功能尚不清楚ꎬ为了揭示其编码蛋白的功能ꎬ以本实验室保存的 ＢＢＴＶ Ｈａｉｋｏｕ４
分离物总 ＤＮＡ为模板进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ利用 Ｇａｔｅｗａｙ 重组技术将 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ 构建到酵母双杂交系统(ＰｒｏＱｕｅｓｔＴＭ
Ｔｗｏ￣Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍꎬ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)的诱饵载体 ｐＤＥＳＴ￣３２中ꎬ并通过酵母表型验证、诱饵质粒毒性验证以及自激活验证ꎮ 结果
显示ꎬ转有 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ质粒的 ＭａＶ２０３酵母菌具有弱的自激活背景ꎬ在 ３￣ＡＴ 浓度为 ２５ ｍｍｏｌ / Ｌ的 ＳｅＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣
Ｈｉｓ平板上生长较弱ꎬ但在 ３￣ＡＴ 浓度为 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＳｅＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ 平板上不生长ꎬ表明诱饵质粒背景自激活可被浓度为
５０ ｍｍｏｌ / Ｌ的 ３￣ＡＴ 所抑制ꎮ 在该条件下共转 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 和文库质粒到 ＭａＶ２０３ 感受态细胞进行互作蛋白筛
选ꎬ通过 ＰＣＲ和测序等手段最终鉴定 ３５个候选蛋白基因ꎬ分别编码转录调控因子、生长发育相关蛋白、代谢相关蛋白、抗逆
相关蛋白和未知蛋白等ꎮ 酵母双杂交 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ诱饵质粒的构建及其与寄主互作蛋白的筛选ꎬ为揭示 ＤＮＡ２ 组分
的蛋白功能提供了科学线索ꎮ
关键词:ＤＮＡ２ ＯＲＦꎻ 酵母双杂交ꎻ 质粒构建ꎻ 自激活验证
Ｂａｎａｎａ ｂｕｎｃｈｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ (ＢＢＴＶ) ＤＮＡ２ ＯＲＦ ｂａｉｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｂｙ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ ＹＵ Ｎａｉ￣ｔｏｎｇꎬ ＷＡＮＧ Ｊｉａｎ￣ｈｕａꎬ
ＺＨＡＮＧ Ｙｕ￣ｌｉａｎｇꎬ ＺＨＯＵ Ｐｅｎｇꎬ ＬＩＵ Ｚｈｉ￣ｘｉｎ (Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓꎬ
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ Ｂａｎａｎａ ｂｕｎｃｈｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ (ＢＢＴＶ) ＤＮＡ２ ｉｓ ｓｔｉｌｌ ｕｎｋｎｏｗｎ.
Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＤＮＡ２ ＯＲＦ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ＢＢＴＶ Ｈａｉｋｏｕ４ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ａｎｄ ｇａｔｅｗａｙ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｂｕｉｌｄ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒ ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ ｖｉａ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ
(ＰｒｏＱｕｅｓｔＴＭ Ｔｗｏ￣Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍꎬ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ). Ｔｈｅ ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ ｂａｉｔ ｖｅｃｔｏｒ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ￣
ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｔｅｓｔ ｂｙ ｙｅａｓｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ｂａｉｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｏｘｉｃ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ/ ＭａＶ２０３ ｗｅａｋｌｙ ｇｒｅｗ ｏｎ ＳｅＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣
Ｈｉｓ ＹＰＡＤ ｐｌａｔｅ ｗｉｔｈ ２５ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣ＡＴꎬ ｂｕｔ ｎｏ ｃｏｌｏｎｙ ｓｈｏｗｅｄ ｕｐ ｏｎ ＳｅＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ ＹＰＡＤ ｐｌａｔｅ ｗｉｔｈ ５０ ｍｍｏｌ /
Ｌ ３￣ＡＴ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ ａｎｄ ＡＤ￣Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ ＭａＶ２０３
ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ３５ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄꎬ
ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ｇｒｏｗｔｈ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ. Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ ｂａｉｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃｏｕｌｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ.
４期 余乃通ꎬ等:酵母双杂交 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ＤＮＡ２ ＯＲＦꎻ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄꎻ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎꎻ ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３２.４１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０４￣０３７６￣０８
香蕉束顶病毒属于矮缩病毒科(Ｎａｎａｖｉｒｉｄａｅ)
香蕉束顶病毒属(Ｂａｂｕｖｉｒｕｓ)ꎬ是香蕉束顶病(Ｂａ￣
ｎａｎａ ｂｕｎｃｈｙ ｔｏｐ ｄｉｓｅａｓｅꎬＢＢＴＤ)的病原[１]ꎮ 染病
香蕉新生叶片窄、短ꎬ叶脉出现深绿色点线状“青
筋”ꎬ随后整棵植株束状丛生ꎬ呈矮缩状ꎬ严重者整
株死亡[２]ꎮ 香蕉束顶病最早在斐济发现ꎬ之后在
全球香蕉生产地陆续报道[３]ꎮ 早在 １９００ 年ꎬ中国
就有关于 ＢＢＴＤ的记载ꎮ ２０ 世纪 ５０ 年代和 ９０ 年
代ꎬ香蕉束顶病在我国福建、广东、广西、云南和海
南等香蕉产区的 ２次流行危害ꎬ严重影响当地香蕉
产业的发展ꎬ造成重大经济损失[２ꎬ３]ꎮ 据报道ꎬ该
病毒寄主有 ８种ꎬ包括香蕉、大蕉、蕉麻、粉芭蕉、长
梗蕉、班克氏芭蕉、尖苞片蕉及象腿蕉ꎬ均属芭蕉
科[４]ꎮ
香蕉束顶病毒由于寄主范围窄、病毒含量
低[５]ꎬ加之香蕉植株中含有多糖多酚类物质以及
乳汁等特点ꎬ直到 １９８７ 年才成功完成病毒提纯ꎮ
ＢＢＴＶ的分子生物学研究也随之展开ꎬ其中包括该
病毒单克隆抗体的制备[６ꎬ７]、 多克隆抗体制
备[２ꎬ ８ꎬ９]、病毒检测方法[６]ꎬ及其寄主[４]、株系[１０]和
流行学[１１]研究ꎮ
ＢＢＴＶ基因组至少由 ６ 个 １.０ ~ １.１ ｋｂ 的环状
ｓｓＤＮＡ 组分组成ꎬＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３、ＤＮＡ４、
ＤＮＡ５、ＤＮＡ６ 组分分别编码复制蛋白酶(Ｒｅｐｌｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ Ｒｅｐ)、未知蛋白( ｕｎｋｎｏｗｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ)、外壳蛋白( ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＣＰ)、运动蛋白
(ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＭＰ)、Ｒｂ￣结合蛋白(Ｒｂ￣ｂｉｎｄ￣
ｉｎｇ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ Ｒｂ)和核穿梭蛋白(Ｎｕｃｌｅａｒ ｓｈｕｔｔｌｅ
ｐｒｏｔｅｉｎꎬＮＳＰ) [５ꎬ １２~１４]ꎮ Ｙｕ 等[１５]报道海南 ＢＢＴＶ
分离物还含有卫星组分ꎮ 香蕉束顶病毒基因组中
的 ＤＮＡ１、ＤＮＡ３、ＤＮＡ４、ＤＮＡ５、ＤＮＡ６ 表达蛋白
功能已有报道ꎬ仅 ＤＮＡ２ 和卫星组分的编码蛋白
功能尚不清楚ꎮ 本研究根据已获得的 Ｈａｉｋｏｕ４ 总
ＤＮＡ样品为模板进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ利用 Ｇａｔｅｗａｙ 重
组技术将 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ构建到酵母双杂交系
统的诱饵载体 ｐＤＥＳＴ￣３２ 中ꎬ通过酵母表型验证、
诱饵质粒毒性验证和自激活验证ꎬ最终确定 ３５ 个
候选蛋白基因ꎮ 酵母双杂交 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ 诱
饵质粒的构建及其与寄主互作蛋白的筛选ꎬ为揭示
ＤＮＡ２组分的蛋白功能提供了科学线索ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料与主要试剂
ＢＢＴＶ Ｈａｉｋｏｕ４ 分离物总 ＤＮＡ 样品ꎬ保存在
本实验室的－２０℃冰箱ꎮ ＤＮＡ２全长序列已提交到
ＮＣＢＩ的 ＧｅｎＢａｎｋ(Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ:ＨＭ２３１３１４.１)
数据库ꎮ
入门克隆载体 ｐＤＯＮＲＴＭ２０７ 由向成斌教授惠
赠ꎻ酵母菌株 ＭａＶ２０３、 ｐＤＥＳＴＴＭ ３２ 表达质粒、
ｐＤＥＳＴＴＭ ２２ 猎物质粒、 ｐＥＸＰ３２ / Ｋｒｅｖ１、 ｐＥＸＰ２２ /
ＲａｌＧＤＳ￣ｗｔ、 ｐＥＸＰ２２ / ＲａｌＧＤＳ￣ｍ１、 ｐＥＸＰ２２ / Ｒａｌ￣
ＧＤＳ￣ｍ２等对照质粒均购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司ꎻＥ.ｃｏｌｉ
Ｔｒａｎｓ５α购自北京 ＴｒａｎｓＧｅｎ公司ꎮ
Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ ＣｌｏｎａｓｅＴＭ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、Ｇａｔｅｗａｙ
ＢＰ ＣｌｏｎａｓｅＴＭ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ 购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司ꎻ
ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲＴＭ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 ｒＴａｑ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、硫酸庆大霉素(Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ)、氨苄青霉
素(Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ)、 ＩＰＴＧ 均购自大连宝生物公司ꎻ
ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购自北京 ＴｒａｎｓＧｅｎ 公司ꎻ３￣氨基三唑
(３￣ａｍｉｎｏ￣ｌꎬ２ꎬ４￣ｔｒｉａｚｏｌｅꎬ３￣ＡＴ) 购自 Ｓｉｇｍａ 公司ꎻ
酵母提取物、大肠杆菌培养基胰蛋白胨购自 Ｏｘｏｉｄ
公司ꎻ无氨基酵母氮源、各种氨基酸购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公
司ꎻ其他化学试剂均为国产分析纯ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 酵母双杂交引物设计 依据 Ｙｕ[１６]的报道
结果ꎬ Ｈａｉｋｏｕ４ ＤＮＡ２ 编码框 (Ｏｐｅｎｉｎｇ ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅꎬ ＯＲＦ) 的起始位点 ＧＴＧ 位于 ｎｔ ３１４￣３１６ꎬ终
止位点 ＴＡＧ 位于 ｎｔ ４０７￣４０９ꎬ整个 ＯＲＦ 长度为 ９６
ｂｐꎮ 采用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ 软件设计用于扩增构建
到酵母双杂交诱饵质粒的 ＤＮＡ２ ＯＲＦ 引物 ＹＴＨ￣
ＢＢＴＶ ２Ｆ (５′￣ＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＴ ＧＴＧ ＣＴ￣
ＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧ￣３′加框为起始密码子)和 ＹＴＨ￣
ＢＢＴＶ ２Ｒ ( ５′￣ＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴ ＣＴＡ
ＴＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＴＡＴＡＣ￣３′加框为终止密码子)ꎬ以
及重 组 位 点 接 头 引 物 ａｔｔＢ１￣ａｄＦ ( ５′￣ ＧＧＧＧＡ￣
ＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ￣３′) 和 ａｔｔＢ２￣ａｄＲ
７７３
植物病理学报 ４５卷
( ５′￣ ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ￣３′)ꎬ
由上海生物工程公司合成ꎮ
１.２.２ ＤＮＡ２ ＯＲＦ编码区及接头扩增
( １) ＰＣＲ 初扩增 使用 ＹＴＨ￣ＢＢＴＶ ２Ｆ /
ＹＴＨ￣ＢＢＴＶ ２Ｒ 引物对 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ 进行
ＰＣＲ初扩增ꎬ５０ mＬ 反应体系:１ mＬ 总 ＤＮＡ (约
２００ ｎｇ / mＬ)、１ mＬ ＹＴＨ￣ＢＢＴＶ ２Ｆ (１０ μｍｏｌ / Ｌ)、１
mＬ ＹＴＨ￣ＢＢＴＶ ２Ｒ (１０ μｍｏｌ / Ｌ)、４ mＬ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ
(２. ５ ｍｍｏｌ / Ｌ)、 １０ mＬ ５ × ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲＴＭ Ｂｕｆｆｅｒ
(Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ)、０.５ mＬ ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲＴＭ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙ￣
ｍｅｒａｓｅ (２.５ Ｕ / mＬ)ꎬ３２.５ mＬ 无菌水ꎮ 混匀后ꎬ瞬
时离心ꎬ将管壁液滴收回管底ꎬ置于 ＰＣＲ 扩增仪
中ꎮ 扩增条件:９８℃预变性 ２ ｍｉｎꎬ９８℃变性 １０ ｓꎬ
４６℃退火 ２０ ｓꎬ７２℃延伸 ３０ ｓꎬ循环 １０次ꎮ
(２) ＰＣＲ产物两端加接头 ａｔｔＢ 序列 取上述
ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ的 ＰＣＲ扩增产物 １０ mＬꎬ进行如
下 ５０ mＬ 反应体系:１０ mＬ ＰＣＲ 初扩增产物、４ mＬ
ａｔｔＢ１￣ａｄＦ ( １０ μｍｏｌ / Ｌ )、 ４ mＬ ａｔｔＢ２￣ａｄＲ ( １０
μｍｏｌ / Ｌ)、４ mＬ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ (２.５ ｍｍｏｌ / Ｌ)、１０ mＬ ５
×ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲＴＭ Ｂｕｆｆｅｒ (Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ)、０.５ mＬ Ｐｒｉｍｅｒ￣
ＳＴＡＲＴＭ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (２.５ Ｕ / mＬ)ꎬ１７.５ mＬ
无菌水ꎮ 轻轻混匀后ꎬ瞬时离心ꎬ将管壁液滴收回
管底ꎬ置于 ＰＣＲ扩增仪中ꎮ 扩增条件为:９８℃预变
性 ２ ｍｉｎꎬ９８℃变性 １５ ｓꎬ４５℃退火 ２０ ｓꎬ７２℃延伸
２０ ｓꎬ循环 ５次ꎻ接着 ９８℃变性 １５ ｓꎬ５０℃退火 ２０ ｓꎬ
７２℃延伸 ２０ ｓꎬ循环 ５次ꎻ然后 ９８℃变性 １５ ｓꎬ５５℃
退火 ２０ ｓꎬ７２℃延伸 ２０ ｓꎬ循环 ２０ 次ꎬ最后 ７２℃延
伸 １０ ｍｉｎꎮ 将 ａｔｔＢ￣ＰＣＲ 产物按照(天根琼脂糖凝
胶 ＤＮＡ 回收试剂盒ꎬＤＰ２０９￣０３)步骤进行胶纯化
回收ꎮ
１.２.３ ＢＰ重组构建入门克隆、转化及鉴定 ＢＰ重
组按照 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司 Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ ＣｌｏｎａｓｅＴＭ Ｅｎ￣
ｚｙｍｅ Ｍｉｘ 说明书操作ꎮ (１) 室温下ꎬ在 ０. ２ ｍＬ
ＰＣＲ管中混合下列组分:１ mＬ ａｔｔＢ￣ＰＣＲ产物 (１００
ｎｇ / mＬ)、１ mＬ ｐＤＯＮＲＴＭ ２０７ (１５０ ｎｇ / mＬ)、６ mＬ
１×ＴＥ缓冲液(ｐＨ ８.０)ꎻ(２) 冰上溶解 Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ
ＣｌｏｎａｓｅＴＭ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ约 ５ ｍｉｎꎬ轻轻涡旋 ２~３次ꎬ
每次 ２ ｓꎬ使其溶解充分ꎻ(３) 加入 １ mＬ Ｇａｔｅｗａｙ
ＢＰ ＣｌｏｎａｓｅＴＭ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ到 ０.２ ｍＬ ＰＣＲ管中ꎬ涡
旋 ２次ꎬ每次 ２ ｓꎬ瞬时离心ꎬ将管壁液体收回管底ꎻ
(４) 立即将 Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ ＣｌｏｎａｓｅＴＭＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ 置
于－８０℃保存ꎻ(５) ２５℃温育 １ ｈꎻ(６) 加入 １ mＬ蛋
白酶 Ｋ溶液 (２ mｇ / mＬ)ꎬ３７℃温育 １０ ｍｉｎꎬ除去
ＢＰ重组酶ꎬ终止反应ꎮ 转化操作按北京全式金生
物技术有限公司的 Ｔｒａｎｓ５α 感受态转化说明进行
(ＣＤ２０１)ꎮ
鉴定为阳性的大肠杆菌送往测序公司进行测
序ꎬＤＮＡ测序工作由上海英骏生物技术有限公司
广州分公司完成ꎮ 对测序正确的克隆菌液提取质
粒(天根质粒小提中量试剂盒ꎬＤＰ１０６￣０２)ꎬ命名为
ｐＤＯＮＲ２０７￣ＤＮＡ２ ＯＲＦꎮ
１.２.４ ＰＣＲ扩增目的基因、ＬＲ 重组及鉴定 由于
入门克隆载体 ｐＤＯＮＲ２０７ 的抗性筛选标记与
ｐＤＥＳＴ３２相同(庆大霉素)ꎬ故很难按正常的方法
将 ｐＤＯＮＲ２０７￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ与 ｐＤＥＳＴ３２经 ＬＲ重组
反应后ꎬ 通过抗性标记来筛选重组的质粒
ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦꎬ因为未发生重组反应的
ｐＤＯＮＲ２０７￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ转化菌也可以在庆大霉素
的抗性平板上生长ꎮ 因此考虑排除重组质粒
ｐＤＯＮＲ２０７￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 的抗性标记ꎬ通过 ２０７ ２Ｆ
(５′￣ＴＣＣＴＧＣＧＴＴＡＴＣＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧ￣３′)和 ２０７
２Ｒ ( ５′￣ＴＴＴＣＣＣＧＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＴＡＡＣ￣３′)
对 ｐＤＯＮＲ２０７￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ得到
ＤＮＡ２ ＯＲＦ片段两端含有 ＬＲ 重组位点的 Ｌ 位点
序列ꎮ ２５ mＬ 反应体系:１.０ mＬ ｐＤＯＮＲ２０７￣ＤＮＡ２
ＯＲＦ、２.５ mＬ １０ ´Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ (Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ)、０.５ mＬ
２０７ ２Ｆ (１０ μｍｏｌ / Ｌ)、０.５ mＬ ２０７ ２Ｒ (１０ μｍｏｌ /
Ｌ)、０.５ mＬ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ (１０ ｍｍｏｌ / Ｌ)、０.２ mＬ ｒＴａｑ
(５ Ｕ / mＬ)、１９.８ mＬ 灭菌水ꎮ 扩增条件:９８℃预变
性 １ ｍｉｎꎻ９４℃变性 １ ｍｉｎꎻ５０℃退火 ３０ ｓꎻ６８℃延伸
３０ ｓꎬ循环 ３５次ꎬ最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ产物
按照天根公司胶回收试剂盒的操作说明书进行
(ＤＰ２０９￣０３)回收ꎮ
ＬＲ 重组反应:(１) 室温下ꎬ分别在 ０. ２ ｍＬ
ＰＣＲ管中混合下列组分:１ mＬ ＰＣＲ 产物 (７２ ｎｇ /
mＬ)、１ mＬ ｐＤＥＳＴ３２ (１００ ｎｇ / mＬ)、６ mＬ １×ＴＥ 缓
冲液(ｐＨ ８.０)ꎻ(２) 冰上溶解 Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ约 ５ ｍｉｎꎬ轻轻涡旋 ２~ ３ 次ꎬ每次 ２ ｓꎻ
(３) 加入 ２ mＬ ＧａｔｅｗａｙＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ到
０.２ ｍＬ ＰＣＲ管ꎬ瞬时离心ꎬ将管壁液体收回管底ꎻ
(４) 立即将 Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ置于
－８０ ℃保存ꎻ(５) ２５℃温育 １ ｈꎻ(６) 加入１ μＬ蛋白
酶 Ｋ溶液(２ mｇ / mＬ)ꎬ３７℃温育 １０ ｍｉｎꎬ去除酶ꎬ终
止反应ꎮ
８７３
４期 余乃通ꎬ等:酵母双杂交 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选
转化大肠杆菌ꎬ菌落 ＰＣＲ 鉴定重组质粒ꎬ并进
行测序ꎮ 对测序正确的提取阳性重组质粒(ＤＰ１０６￣
０２)ꎬ命名为 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦꎬＤＮＡ 测序工作
由上海英骏生物技术有限公司广州分公司完成ꎮ
１.２.５ 酵母细胞表型鉴定、诱饵质粒转化及毒性验证
(１) 酵母菌株 ＭａＶ２０３ 表型鉴定 酵母双杂
交试验前ꎬ需鉴定实验室保存的酵母 ＭａＶ２０３是否
已产生变异ꎮ 从 － ８０℃ 冰箱中取出酵母菌株
ＭａＶ２０３ꎬ激活后划线于 ＳＣ / ￣Ｕｒａ、 ＳＣ / ￣Ｔｒｐ、 ＳＣ / ￣
Ｌｅｕ和 ＳＣ / ￣Ｈｉｓ酵母平板ꎬ置于 ３０℃培养 ４ ~ ６ ｄꎮ
如果未出现任何菌落ꎬ表明酵母菌株 ＭａＶ２０３基因
型未发生改变ꎬ所保存的 ＭａＶ２０３酵母菌株可用于
酵母双杂交后续试验ꎻ如果在缺陷性平板上生长ꎬ
表明所保存的 ＭａＶ２０３酵母菌株发生突变ꎬ不能用
于后续试验ꎮ
(２) 酵母感受态细胞制备 １) 将酵母菌株
ＭａＶ２０３单菌落接种到 １０ ｍＬ ＹＰＡＤ液体培养基ꎬ
３０℃振荡培养过夜ꎻ ２)测定菌液 ＯＤ６００ꎬ用新鲜
ＹＰＡＤ培养基将酵母菌液稀释至 ＯＤ６００≈０.４ꎬ继续
培养 ２~４ ｈꎻ ３)于 ２ ５００ ｒｐｍ离心 ５ ｍｉｎꎬ酵母细胞
重悬于 ４０ ｍＬ １×ＴＥ溶液中ꎻ ４)于 ２ ５００ ｒｐｍ离心
５ ｍｉｎꎬ酵母细胞重悬于 ２ ｍＬ １×ＬｉＡｃ / ０.５×ＴＥ溶液
中ꎻ ５)室温下孵育 (放置) １０ ｍｉｎꎻ ６) 即得到
ＭａＶ２０３感受态细胞ꎮ
(３) 质粒转化酵母细胞 １) 取大约 １ mｇ 质
粒 ＤＮＡ 和 １００ mｇ 变性鲑鱼精 ＤＮＡ 混和ꎬ加入
１００ μＬ新制备的酵母 ＭａＶ２０３ 感受态细胞混匀ꎻ
２) 加入 ７００ μＬ 的 １×ＬｉＡｃ / ４０％ＰＥＧ￣３３５０ / １×ＴＥ
现配溶液ꎬ混匀ꎻ ３)３０℃孵育(水浴锅)３０ ｍｉｎꎬ期
间每隔 １０ ｍｉｎ涡旋 １次ꎻ ４)添加 ８８ μＬ ＤＭＳＯꎬ混
匀ꎬ４２℃热击 ７ ｍｉｎꎻ ５)离心机最大转速离心 １０ ｓꎬ
去除上清液ꎻ ６)加入 １ ｍＬ １×ＴＥ 重悬酵母菌体ꎬ
重复一次ꎻ７) 沉淀酵母细胞悬浮于 ５０ ~ １００ μＬ
ＴＥꎬ再涂布在选择性培养基上ꎬ３０℃培养 ３~４ ｄꎬ观
察酵母转化子生长情况ꎮ
(４) 诱饵质粒的毒性检测 分别将诱饵质粒
ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 和空载体 ｐＤＥＳＴ３２ 转化酵
母菌 ＭａＶ２０３感受态细胞ꎬ３０℃培养 ３ ｄ 后观察两
者在 ＳｅＣ￣Ｌｅｕ平板中生长出的克隆数量是否大致
相近ꎬ判断 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 对 ＭａＶ２０３ 有无
毒性作用ꎮ 或从含有 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 质粒
的酵母菌 ＭａＶ２０３ 的 ＳｅＣ￣Ｌｅｕ 平板中挑出一个单
菌落接种于 １０ ｍＬ的 ＹＰＡＤ液体培养基中ꎬ２００ ｒ /
ｍｉｎ 过夜培养ꎬ２４ ｈ测得 ＯＤ６００值为 １.２０(>０.８)ꎬ则
表明 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 的表达对酵母没有毒
性ꎬ可以进行后续酵母双杂交试验ꎮ
１.２.６ 诱饵质粒自激活鉴定 诱饵质粒的自激活
检测 流 程 按 照 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 的 ＰｒｏＱｕｅｓｔＴＭ
Ｔｗｏ￣Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ(ＰＱ１０００１￣０１ 和 ＰＱ１０００１￣０１)
步骤进行ꎬ按表 １ 所示的质粒组合共转化酵母菌
ＭａＶ２０３感受态细胞ꎬ分别涂布在选择性 ＳｅＣ￣Ｌｅｕ￣
Ｔｒｐ的 ＹＰＡＤ 平板上ꎬ３０℃培养 ３ ~ ４ ｄꎬ待菌落直
径长到 ２ ~ ３ ｍｍ 后ꎬ转接至含不同浓度 ３￣ＡＴ 的
ＳＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ 的 ＹＰＡＤ 平板ꎬ ３０℃ 继续培养
３~４ ｄ 观察其生长情况ꎮ
１.２.７ 互作蛋白的初步筛选 染病香蕉文库质粒
由实验室制备和保存ꎬ滴度为 ５.０×１０６ ＣＦＵ / ｍＬꎬ达
到建库要求ꎮ 取 １ mｇ 诱饵质粒和 １ mｇ 文库质粒
混匀ꎬ共转酵母感受态 ＭａＶ２０３ 细胞ꎬ转化过程同
１.２.５ꎮ 将转化后的酵母细胞均匀涂布于 ５０ ｍｍｏｌ /
Ｌ ３￣ＡＴ 的 ＳＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ 缺陷型 ＹＰＡＤ 平板ꎬ
３０℃培养 ３ ~ ４ ｄꎬ待菌落直径长到 ２ ~ ３ ｍｍꎬ进行
菌落 ＰＣＲ鉴定ꎮ ＰＣＲ产物送上海英骏生物技术有
限公司广州分公司完成 ＤＮＡ测序工作ꎬ测序结果进
行 Ｂｌａｓｔ 预测分析(ｈｔｔｐ: / / ｂｌａｓｔ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ /
Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)ꎬ可初步获得互作蛋白基因的功能预测ꎮ
Ｔａｂｌｅ １ Ｂａｉｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｎｏ. Ｂａｉｔ ｐｌａｓｍｉｄ＋Ｐｒｅｙ ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌａｓｍｉｄ / ｎｇ
Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
ｃｅｌｌ / mＬ
Ｐｕｒｐｏｓｅ
１ ｐＥＸＰ３２ / Ｋｒｅｖ１＋ ｐＥＸＰ２２ / ＲａｌＧＤＳ￣ｗｔ １００ １００ Ｓｔｒｏｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ
２ ｐＤＥＳＴＴＭ３２ ＋ ｐＤＥＳＴＴＭ２２ １００ １００ Ｔｅｓｔ ｏｆ ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
３ ｐＥＸＰ３２ / Ｋｒｅｖ１ ＋ｐＥＸＰ２２ / ＲａｌＧＤＳ￣ｍ１ １００ １００ Ｗｅａｋ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ
４ ｐＥＸＰ３２ / Ｋｒｅｖ１ ＋ｐＥＸＰ２２ / ＲａｌＧＤＳ￣ｍ２ １００ １００ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ
５ ｐＤＥＳＴＴＭ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ＋ ｐＤＥＳＴＴＭ２２ １００ １００ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ
９７３
植物病理学报 ４５卷
２ 结果
２.１ ＤＮＡ２ ＯＲＦ编码区的扩增
经 １％琼脂糖凝胶电泳ꎬ第 １次 ＰＣＲ扩增到约
１００ ｂｐ 左右的 ＤＮＡ 特异条带ꎬ与预测大小相符ꎬ
扩增克隆了 Ｈａｉｋｏｕ ４ ＤＮＡ２ ＯＲＦ基因片段ꎮ 为了
把 ａｔｔＢ接头序列引入 ＤＮＡ２ ＯＲＦ两端ꎬ第２次ＰＣＲ
扩增获得大小约为 １５０ ｂｐ的 ＤＮＡ特异条带ꎬ与预
期条带大小相符(图 １)ꎬ表明成功扩增了两端含
ａｔｔＢ接头序列的 Ｈａｉｋｏｕ ４ ＤＮＡ２ ＯＲＦ ＰＣＲ产物ꎮ
Ｆｉｇ. １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｔＢ￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ
Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １ꎬ ２: ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ
ａｔｔＢ￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ.
２.２ ｐＤＯＮＲ２０７￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ重组质粒鉴定
将纯化的 ａｔｔＢ￣ＰＣＲ 产物与 ｐＤＯＮＲ２０７ 进行
ＢＰ重组ꎬ转化大肠杆菌ꎮ 随机挑取 １７个克隆进行
菌落 ＰＣＲ鉴定ꎬ结果表明 １７ 个克隆子中有 ９ 个为
阳性ꎬ条带大小与预测片段一致ꎮ 将 ３、７、１０ 号克
隆送往上海英骏生物技术有限公司广州分公司完
成测序ꎮ 对测序正确的阳性克隆菌提取质粒(天
根质粒小提中量试剂盒ꎬ ＤＰ１０６￣０２ )ꎬ命名为
ｐＤＯＮＲ２０７￣ＤＮＡ２ ＯＲＦꎮ
２.３ ａｔｔＬ￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ扩增
使 用 ２０７ ２Ｆ / ２０７ ２Ｒ 引 物 ＰＣＲ 扩 增
ｐＤＯＮＲ２０７￣ ＤＮＡ２ ＯＲＦ质粒ꎬ经 １％琼脂糖凝胶电
泳得到大小约为 ７５０ ｂｐ的 ＤＮＡ条带ꎬ结果显示与
预期相符 (两端含有 Ｌ 序列的 ＤＮＡ２ ＯＲＦꎬ即
ａｔｔＬ￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ)(图 ２)ꎮ
２.４ ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 重组载体鉴定及质粒
提取
将纯化的 ａｔｔＬ￣ＰＣＲ 产物与 ｐＤＥＳＴ３２ 进行 ＬＲ
重组ꎬ转化大肠杆菌ꎮ 随机挑取 ６个克隆进行 ＰＣＲ
鉴定ꎬ菌液 ＰＣＲ 结果显示 ６ 个克隆子均为阳性ꎬ条
带与预测大小一致ꎮ 将 １、３、５号克隆子送往上海英
骏生物技术有限公司广州分公司完成测序ꎮ 对测序
正确的阳性克隆菌提取质粒(天根质粒小提中量试
剂盒ꎬＤＰ１０６￣０２)ꎬ即为 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦꎮ
２.５ 酵母菌株ＭａＶ２０３表型鉴定
如图 ３ 所示ꎬ涂布于 ＳＣ / ￣Ｕｒａ、ＳＣ / ￣Ｔｒｐ、ＳＣ / ￣
Ｌｅｕ和 ＳＣ / ￣Ｈｉｓ酵母培养基上的酵母菌株 ＭａＶ２０３
均未生长ꎬ表明 ＭａＶ２０３ 基因型未发生改变ꎮ 因
此ꎬＭａＶ２０３酵母菌株可用于酵母双杂交后续毒性
验证、自激活验证以及互作蛋白筛选等试验ꎮ
Ｆｉｇ. ２ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｔＬ￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ
Ｌａｎｅ Ｍ: ２０００ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐＤＯＮＲ２０７￣ＤＮＡ２ ＯＲＦꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
Ｆｉｇ. ３ Ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎ ＭａＶ２０３ ｇｒｅｗ ｏｎ ＳＣ / ￣
Ｕｒａꎬ ＳＣ / ￣Ｔｒｐꎬ ＳＣ / ￣Ｌｅｕ ａｎｄ ＳＣ / ￣Ｈｉｓ
ＹＰＡＤ ｐｌａｔｅｓ
０８３
４期 余乃通ꎬ等:酵母双杂交 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选
２.６ 诱饵质粒毒性检测
将诱饵质粒 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 和空载体
ｐＤＥＳＴ３２分别转化入酵母菌 ＭａＶ２０３ 感受态细
胞ꎬ３０℃培养 ３ ~ ４ ｄ 后ꎬ两者在 ＳｅＣ￣Ｌｅｕ 缺陷性平
板中生长出的单克隆数量大致相近(图 ４)ꎬ表明
ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ对 ＭａＶ２０３无毒性作用ꎮ 从
ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ / ＭａＶ２０３ 的 ＳｅＣ￣Ｌｅｕ 平板中随
机挑出一个单菌落接种于 １０ ｍＬ 的 ＹＰＡＤ液体培
养基中ꎬ２００ ｒ / ｍｉｎ过夜培养ꎬ２４ ｈ 测得 ＯＤ６００值为
１.２０(>０.８)ꎬ结果也表明 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 的
表达蛋白对酵母没有毒性ꎮ 再分别从 ＭａＶ２０３ 中
提取 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ和 ｐＤＥＳＴ３２质粒ꎬ电泳
和 ＰＣＲ检测转入酵母 ＭａＶ２０３的质粒均为阳性ꎮ
２.７ 诱饵质粒的自激活作用检测
ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ诱饵质粒自激活作用检
测结果见图 ５ꎮ 强互作 ( ｗｔ ) 阳性对照质粒
ｐＥＸＰ３２ / Ｋｒｅｖ１与ｐＥＸＰ２２ / ＲａｌＧＤＳ￣ｗｔ共转化酵
Ｆｉｇ. ４ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｉｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ
Ｆｉｇ. ５ Ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＤＥＳＴ３２￣ ＤＮＡ２ ＯＲＦ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎ ＭａＶ２０３
１８３
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ６ Ｔｈｅ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ｐｒｏｔｅｉｎ
母ＭａＶ２０３后ꎬ可以在高浓度 ３￣ＡＴ为 １００ ｍｍｏｌ / Ｌ
的 ＳＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ平板上正常生长ꎬ其它共转化
子在该 ３￣ＡＴ 浓度的平板上均不能生长ꎻ弱互作
(ｍ１)阳性对照质粒 ｐＥＸＰ３２ / Ｋｒｅｖ１ 与 ｐＥＸＰ２２ /
ＲａｌＧＤＳ￣ｍ１共转化酵母 ＭａＶ２０３ 后ꎬ获得的转化
子在 ３￣ＡＴ 浓度为 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ 的 ＳＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ
平板上不能生长ꎻ而阴性对照(ｍ２)质粒 ｐＥＸＰ３２ /
Ｋｒｅｖ１ 与 ｐＥＸＰ２２ / ＲａｌＧＤＳ￣ｍ２ 在 ３￣ＡＴ 浓度为 ２５
ｍｍｏｌ / Ｌ 的 ＳＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ 缺陷性平板上不能生
长ꎮ 空(Ｂ)质粒 ｐＤＥＳＴ３２ 与 ｐＤＥＳＴ２２ 共转化酵
母 ＭａＶ２０３ 后ꎬ在 ３￣ＡＴ 浓度为 １０ ｍｍｏｌ / Ｌ 的
ＳＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ平板上不能生长ꎮ 而本试验所构
建的诱饵质粒 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 与 ｐＤＥＳＴ２２
的共转化子在 ３￣ＡＴ 浓度为 ２５ ｍｍｏｌ / Ｌ 的 ＳｅＣ￣
Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ 平板上生长较弱ꎬ在 ３￣ＡＴ 浓度为 ５０
ｍｍｏｌ / Ｌ的 ＳｅＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ 平板不生长ꎮ 重复试
验表明ꎬ诱饵质粒 ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 具有弱的
自激活背景ꎬ与弱互作(ｍ１)阳性对照结果相同ꎬ但
自激活背景可被浓度为 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ 的 ３￣ＡＴ 所抑
制ꎮ 因此ꎬ本研究构建的酵母双杂交诱饵质粒
ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ可在此条件下与染病香蕉
ｃＤＮＡ文库进行蛋白互作筛选ꎮ
２.８ 互作蛋白的初步筛选
ｐＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 诱饵质粒和染病香蕉
ｃＤＮＡ文库质粒共转酵母 ＭａＶ２０３ 感受态细胞后ꎬ
经过 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ３￣ＡＴ 的 ＳＣ￣Ｌｅｕ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ 营养缺
陷型 ＹＰＡＤ 培养基的筛选ꎬ共筛选到 ９８ 个阳性生
长菌落ꎮ 挑取这 ９８ 个酵母菌落进行 ＰＣＲ鉴定ꎬ其
中 ９个 ＰＣＲ呈阴性ꎬ８９个 ＰＣＲ呈阳性ꎮ 测序结果
经过序列相似性比对ꎬ除去重复序列、载体序列和
移码序列ꎬ最后得到 ３５个可能与 ＤＮＡ２ ＯＲＦ 编码
蛋白互作的候选基因ꎮ 它们分别编码转录调控因
子(８个)、生长发育相关蛋白(５ 个)、代谢相关蛋
白(４个)、抗逆相关蛋白(７个)ꎬ以及未知蛋白(１１
个)(图 ６)ꎮ
３ 讨论
本研究成功构建酵母双杂交诱饵质粒ｐＤＥＳＴ
３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦꎬ转化 ＭａＶ２０３ 感受态细胞并通过
酵母表型验证、诱饵质粒毒性验证和自激活验证ꎬ
确定了 ＰＤＥＳＴ３２￣ＤＮＡ２ ＯＲＦ 适用于该系统(ｐｒｏ￣
ＱｕｅｓｔＴＭ Ｔｗｏ￣Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍꎬ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)的后续试
验ꎮ 虽然诱饵质粒有弱的自激活背景ꎬ但是可以被
工作浓度为 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ的 ３￣ＡＴ所抑制ꎬ并在该条
件下与染病香蕉总 ｃＤＮＡ 的文库质粒进行互作筛
选ꎬ该试验结果可为揭示 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ 编码
蛋白的功能研究提供基础ꎮ
Ｇａｔｅｗａｙ技术通过 ＢＰ 重组和 ＬＲ 重组可以把
目的基因构建到诱饵质粒载体中ꎮ 该重组技术不需
要酶切和连接处理ꎬ只需要将两端含有 ａｔｔＢ序列的
目的基因和含有 ａｔｔＰ 序列的载体进行混合ꎬ加入
Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ ＣｌｏｎａｓｅＴＭ Ｅｎｚｙｍｅ后ꎬ室温即可发生重
组反应ꎮ 同理ꎬ两端含有 ａｔｔＬ序列的基因和含有 ａｔ￣
ｔＲ序列的载体混合后ꎬ在Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ ＣｌｏｎａｓｅＴＭ Ｅｎ￣
ｚｙｍｅ作用下发生重组反应[１７]ꎮ 与传统的酶切连接
２８３
４期 余乃通ꎬ等:酵母双杂交 ＢＢＴＶ ＤＮＡ２ ＯＲＦ诱饵质粒构建及其互作蛋白筛选
相比ꎬ此方法对病毒大片段 ＯＲＦ构建到相关载体中
具有借鉴意义ꎮ
本试验在 ３￣ＡＴ 浓度为 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ的 ＳｅＣ￣Ｌｅｕ￣
Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ 营养缺陷型平板ꎬ筛选到 ３５个与 ＤＮＡ２ ＯＲＦ
互作的候选蛋白基因ꎮ 为了进一步验证蛋白互作
的可能性ꎬ还需开展点对点共转验证和双分子荧光互
补试验验证ꎮ 本研究构建的酵母双杂交ＢＢＴＶ ＤＮＡ２
ＯＲＦ诱饵质粒及筛选与之互作蛋白的结果ꎬ为确定
ＤＮＡ２组分的蛋白功能提供了科学线索ꎮ
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[１４] Ｂｅｅｔｈａｍ Ｐ Ｒꎬ Ｈａｒｄｉｎｇ Ｒ Ｍꎬ Ｄａｌｅ Ｊ Ｌ. Ｂａｎａｎａ ｂｕｎｃｈｙ
ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ￣２ ｔｏ￣６ ａｒｅ ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ [ Ｊ] . Ａｒｃｈｉｖｅ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ １９９９ꎬ １４４: ８９－１０５.
[１５] Ｙｕ Ｎ Ｔꎬ Ｆｅｎｇ Ｔ Ｃꎬ Ｚｈａｎｇ Ｙ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＢＢＴＶ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ
[Ｊ] . Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａꎬ ２０１１ꎬ ２６(４): ２７９－２８４.
[１６] Ｙｕ Ｎ Ｔ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂａｎａｎａ ｂｕｎｃｈｙ ｔｏｐ
ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ ＤＮＡ２ ＯＲＦꎬ ａｎｄ ｓｅｌｆ￣ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ２ ＯＲＦ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ( ｉｎ Ｃｈｉ￣
ｎｅｓｅ) [Ｄ] . Ｈａｉｎａｎ: Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (海南:海南大
学)ꎬ ２０１１.
[１７] Ｎｉ Ｗ Ｓꎬ Ｌｅｉ Ｚ Ｙꎬ Ｃｈｅｎ Ｘꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ
ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ￣ｒｅａｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｏｒ
Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ
[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００７ꎬ ４９
(９): １３１３－１３１９.
责任编辑:于金枝
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