全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
重组 hIL10质粒构建及其在毕赤酵母
SMD1168中的表达和纯化
封建凯 孙万邦 陈富超 黄俊琼 罗军敏 杜联峰 姚新生 王胜香
(遵义医学院免疫学教研室,珠海 519041)
摘 要: 构建重组 hIL10真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达, 为进一步研究 hIL10生物学功能及临床应用奠定
基础。 PCR扩增目的基因 hIL10cDNA,经 EcoR I /X ba I双酶切后, 将其亚克隆至同样双酶切的载体 pP ICZaA中, 构建表达质
粒 pP ICZaAhIL10;电转化法, 将其转入毕赤酵母 SMD1168,甲醇诱导 M ut+型转化子基因表达;对目的蛋白进行检测及纯化。
扩增出了目的基因 hIL10 cDNA, 重组质粒 pP ICZaAhIL10经酶切鉴定和序列测定正确; 表达产物经 SDSPAGE分析在 42 0
kD处可见较浓染条带, W estern b lo tting分析可见特异条带; EL ISA检测 72 h上清液中目的蛋白浓度可达 1973 mg /L; 纯化后
目的蛋白纯度达 670%。实现了重组 hIL10在毕赤酵母 SMD1168中的成功表达和初步纯化。
关键词: hIL10 质粒构建 毕赤酵母 基因表达
Plasm id Construction and Expression in Pichia pastoris SMD1168 of
RecombinantHuman Interleukin10 and Purification
Feng J iankai SunW anbang Chen Fuchao Huang Junqiong Luo Junm in
Du L ianfeng Yao X insheng W ang Shengx iang
( Immunology O epartm ent, Zuny iM edical College, Zhuhai 519041)
Abstrac:t It was to construct recomb inant hIL10 euka ryotic expression vector and explore its expression in P ichia pastor is
SMD1168, w hich could lay the founda tion for further study ing h IL10 b io log ica l function and c linical applica tion. In terest gene hIL
10cDNA was am plified by PCR and doubledig ested by theE coR I /X ba I, and then w as subc loned to pPICZaA w hich was d igested by
the sam e enzym e to construct expression p lasm id pP ICZaAhIL10. The recom binant plasm id w as transfo rm ed into P ichia SMD1168 by
electroporation. Interest protein in M ut+ transform ants w as induced expression w ith us ing m ethano l and purified. Resu lts ind ica ted that
the gene hIL10 cDNA was obta ined, and recomb inan t pP ICZaAhIL10 was co rrected by digested identification and sequencing. The ex
pression superna tant show ed a strong bands and spec ific bands at 42 0 kD through SDSPAGE andW estern blotting ana lysis. Interest
prote in concen tration after 72 h w as up to 1973 mg /L by EL ISA. Interest pro te in pur ity reached 670% after pur ifica tion. Therefore, it
prov ed that the recom binant hIL10 in P ichia SMD1168 w as expressed successfully and pur ified prelim inarily.
Key words: Human inter leuk in10 P lasm id construction P ichia pastor is Gene expression
收稿日期: 20091210
基金项目:贵州省教育厅自然科学基金重点培育项目 (黔教科 2008032)
作者简介:封建凯,男,硕士,研究方向:免疫学; Ema i:l sunwb7224@ s ina com
通讯作者:孙万邦,男,教授, Em ai:l sunw b7224@ sin a com
白细胞介素 10 ( interleukin10, IL10 )是美国
DNAX研究所的 Fiorentino等 [ 1]发现的一种细胞因
子,它由小鼠的 Th2细胞株 D10G41产生, 能抑制
Th1细胞株细胞因子 mRNA的转录。其 cDNA有
534 bp,编码一条由 178个氨基酸组成的多肽链,其中
氨基端的 18个氨基酸为信号肽, 成熟的 hIL10由
160个氨基酸残基组成,单链分子量为 185 kD, 酸性
溶液中为非共价键连接的同源寡二聚体形式,由于糖
基化程度不同,分子量略有差别,约为370 kD [ 2]。研
究发现, hIL10可由人体多种细胞产生, 具有免疫刺
2010年第 3期 封建凯等:重组 hIL10质粒构建及其在毕赤酵母 SMD1168中的表达和纯化
激和免疫抑制双向调节作用 [ 3, 4 ] , 是人体免疫系统
的中枢免疫分子之一。
目前临床实验使用的重组 hIL10是由 Scher
ingP lough研究所提供的大肠杆菌表达的重组蛋白
(商品名 Tennov il), 含 161个氨基酸, N端多含有 1
个蛋氨酸,非糖基化的同源单体,单体相对分子质量
187 kD。国内有重组 hIL10的原核和真核表达研
究,因表达系统的不同,在产量和纯化效率上各不相
同,因此进一步探讨重组 hIL10蛋白表达及纯化途
径十分重要。本研究用经济高效的毕赤酵母表达系
统来表达重组 hIL10, 可望为重组 hIL10的开发应
用和功能研究打下基础, 从而推动国内 hIL10基因
工程药物的开发。
1 材料与方法
11 质粒、菌株及主要试剂
质粒 pORFhIL10购自 Inv ivoGen公司; 表达载
体 pPICZaA和毕赤酵母菌株 SMD1168购自 Inv itro
gen公司。引物 Primer1: CGGAATTCATGGCCCA
CAGCTCAGCA (划线部分为 E coR I酶切位点 ) ,
P rimer2: GCTCTAGACAGTTTCGTATCTTCATTGTC (划
线部分为 Xba I酶切位点 ) ,委托大连宝生物公司合
成; EcoR I、Xba I、Sac I和 T4DNA连接酶购自 MBI
公司; 高保真 PCR试剂盒和无水甲醇购自上海生物
工程公司;凝胶回收 DNA试剂盒、小量质粒抽提试
剂盒、DL2000 DNA marker和 H ind IIIDNA M arker
购自大连宝生物公司; Zeoc inTM购自 Inv itrogen公司;
酵母细胞溶解酶 Ly ticase和标准牛血清清蛋白购自
S igma公司; PVDF膜和抗 H istag抗体购自索莱宝
公司; hIL10ELISA检测试剂盒购自深圳晶美公司;
其它试剂均为国产分析纯。
12 目的基因的扩增
以质粒 pORFhIL10为模板,用引物 Primer1和
Primer2扩增目的基因 hIL10cDNA。PCR反应体系
50 L:模板 1 L, 2 PCR M aster 25 L, 引物各 1
L,灭菌双蒸水 22 L; PCR反应条件: 94 预变形
10 m in; 94 45 s, 55 45s, 72 1 m in, 30个循环;
最后 72 延伸 7m in。扩增产物进行 15%琼脂糖
凝胶电泳。
13 表达质粒的构建
用 EcoR I /Xba I双酶切扩增的目的基因 hIL
10cDNA,酶切产物进行纯化后,用 T4DNA连接酶将
目的基因插入到同样内切酶双酶切的原始载体 pPIC
ZaA中,构建表达质粒 pPICZaAhIL10。对重组质粒
进行双酶切鉴定和 DNA序列测定,确定质粒构建正
确。重组质粒 pPICZaAhIL10经 Sac I线性化后,电
转化法导入感受态毕赤酵母 SMD1168,菌液涂布于
100 g /mL Zeoc inTM的 YPD平板, 30培养 3 d。
14 转化子的筛选和鉴定
挑取生长较好的菌落,用 1 000 g /mL Zeoc inTM
的 YPD平板进行高抗性筛选; 在 MMH和 MDH 平
板上进行 Mut表型鉴定; 用 Ly ticase处理筛选鉴定
后的转化子为模板, 用 Prim er1和 Primer2作引物,
对转化子进行 PCR鉴定。
15 目的蛋白的诱导表达
挑取 Mut+的转化子接种于 5mL BMGY培养基
中, 30 、280 r/m in振荡培养 18 h;离心后弃去上清,
用 25mL BMMY重悬菌体;菌液置于 250 mL的锥形
瓶中,用 4层纱布封口, 28 、280 r/m in振荡培养,进
行诱导表达;每 24 h向培养基中添加无水甲醇使其
终浓度为 05%,定时取诱导物上清进行检测。
16 重组 hIL10表达的检测
用 SDSPAGE和 W estern blot ing对不同时间的
诱导物上清液进行定性检测, 用 ELISA法检测各时
间段诱导物上清中目的蛋白的浓度。
17 重组 hIL10的纯化
扩大体积进行诱导表达, 诱导物上清液中的目
的蛋白用镍琼脂糖凝胶 FF柱进行纯化, 洗脱峰分
别进行 ELISA和 B radford检测,计算目的蛋白纯化
后纯度。
2 结果
21 重组质粒 pPICZaAhIL10的构建 [ 5]及鉴定
PCR扩增的目的基因 hIL10cDNA ( 550 bp), 经
E coR I/X ba I双酶切后,插入到同样内切酶双酶切
的质粒 pPICZaA ( 3 600 bp)中, 构建了重组表达质
粒 pPICZaA hIL10(图 1) ; 再用 E coR I /Xba I对所
获质粒进行双酶切鉴定 (图 2 ), 可获得预期大小的
条带;质粒序列测定进一步证实了重组质粒构建正
确 (图 3, 图 4)。与 G enB ank中报道的 hIL10cDNA
序列 (登录号: NM 000572)对照, 完全一致, 两端粗
169
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
斜体部分分别为 E coR I和 Xba I酶切位点。
M. H ind III DNA M ark er; 1. 重组质粒 pPICZaAh IL
10a; 2.重组质粒 pP ICZaAhIL10b
图 1 重组质粒琼脂糖凝胶电泳
M1. H ind III DNA M arker; M 2. DNA Marker DL2000;
1. pP ICZaAhIL10a双酶切产物; 2. pP ICZaAhIL10b双
酶切产物
图 2 重组质粒的双酶切鉴定
图 3 用 P rim er2进行的序列测定结果
图 4 扩增的 hIL10 cDNA的碱基序列
22 毕赤酵母转化子的筛选和鉴定
重组质粒 pPICZaAhIL10线性化后导入毕赤
酵母 SMD1168,经过 Zeoc inTM高抗性筛选和 Mut表
型鉴定,获得了 5株甲醇利用快速型 (M ut+ )转化子
和 2株甲醇利用缓慢型 (M uts )转化子, 经菌落 PCR
鉴定,均可扩增出与目的基因大小相符的条带,证实
转化子均有目的基因的整合 (图 5)。
23 重组 hIL10的诱导表达和检测
取 5株 Mut+酵母转化子进行甲醇诱导表达, 经
ELISA检测, 72 h时目的蛋白浓度较高,重组 hIL10
170
2010年第 3期 封建凯等:重组 hIL10质粒构建及其在毕赤酵母 SMD1168中的表达和纯化
表达浓度可达 1973 mg /L; 72 h的诱导物上清液经
SDSPAGE分析, 在 420 kD处可见较深染的条带
(图 6) ,经W estern blotting分析, 5株转化子均有特
异性条带产生 (图 7)。
M. DNA m arker; 1- 5.转化子 Mu t+ PCR扩增产物; 6. 空
质粒 pPICZaA转化子扩增产物; 7, 8. M uts型转化子
PCR扩增产物
图 5 重组毕赤酵母的 PCR鉴定
M. 分子量标准; 1.重组质粒经 72 h诱导表达产物上清; 2- 6.
M ut+型转化子经 72 h诱导表达产物上清
图 6 重组毕赤酵母表达 hIL10的 SDS- PAGE分析
M. 分子量标准; 1.重组质粒经 72 h诱导表达产物上清; 2- 6.
M ut+型转化子经 72 h诱导表达产物上清
图 7 重组毕赤酵母表达 hIL10的 W estern blotting分析
24 重组 hIl10的表达纯化
扩大体积进行诱导表达, 72 h上清液用镍琼脂
糖凝胶 FF柱纯化目的蛋白, 各洗脱峰经 SDSPAGE
分析, 300 mM咪唑洗脱效率最高 (图 8) ; ELISA法
和 B radford法分别检测各洗脱峰中目的蛋白和总蛋
白浓度, 经计算 300 mM咪唑洗脱峰中重组 hIL10
纯度较高,可达 670%。
M.分子量标准; 1, 2. 50 mM 咪唑洗脱; 3, 4. 100 mM 咪唑洗脱;
5, 6. 200 mM咪唑洗脱; 7, 8. 300 mM 咪唑洗脱; 9. 400 mM 咪唑
洗脱
图 8 镍琼脂糖凝胶层析柱纯化后的重组 hIL10蛋白
3 讨论
IL10具有多种生物学功能,在机体免疫反应的
不同阶段,针对细胞免疫和体液免疫在调节免疫应答
过程中表现出两面性,既具有免疫抑制作用, 又具有
免疫刺激活性,但在机体水平其主要表现为严格限制
炎症反应,减轻病原体或免疫系统本身对机体组织损
伤等免疫抑制作用 [ 6]。临床试验研究表明,重组 hIL
10在感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和器官移
植 [ 7, 8]等方面都具有潜在的临床应用价值。
国内外有用原核细胞 [ 9]、动物细胞 ( CHO )、昆
虫细胞、植物细胞 [ 10]和毕赤酵母细胞 [ 11]对 hIL10
进行表达研究的报道,但是原核表达系统形成的包
涵体增加了复性工艺,且不利于纯化;动植物细胞表
达系统技术条件要求高,不适于大规模生产;应用酵
母表达系统进行表达,因表达载体和宿主细胞的选
择不同,表达效率各不相同。本试验应用蛋白酶 A
缺陷型毕赤酵母菌株 SMD1168为宿主细胞, 减少了
目的蛋白的降解, 应用的表达载体 pPICZaA具有多
克隆位点,可实现分泌型表达, 该表达系统操作简
便, 成本低廉。
表达载体 pPICZaA带有 Zeoc inTM抗性, 该抗生
素属于博来霉素家族,可以直接影响菌体 DNA的合
成, 用此抗生素作为筛选标记具有高效性,一般来讲
抗性转化子 100%发生了质粒的整合。本试验在载
体构建时保留了表达载体 pPICZaA上的 Cterm ina l
mycepitope tag和 Cterm inal po lyh istidine tag, 采用
与目的蛋白融合表达的方式, 使 hIL10单体分子量
增大约 25 kD, 从 SDSPAGE和 W esten blotting鉴
171
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
定结果分析本试验中融合表达的重组 hIL10蛋白
分子量约为 420 kD,考虑可能为二聚体形式, 该形
式是 hIL10发挥生物学活性的自然状态。当然,仅
从分子量大小上分析,不能排除目的蛋白被糖基化
的可能,但通过 ELISA检测可证实表达的重组蛋白具
有较好的抗原性。重组 hIL10蛋白的纯化应用了镍
琼脂糖凝胶 FF柱,其原理是离子亲和层析,纯化柱填
材中螯合的镍离子可与重组蛋白中融合表达的 6
H istag结合,镍琼脂糖凝胶 FF的配基是 IDA,镍离子
有 6个螯合价数, N iIDA螯合了 3价,剩余 3价可结
合 3个组氨酸残基, 结合较稳定,所需洗脱液中咪唑
浓度较高, 本试验中 300 mM咪唑洗脱效果较理想,
融合重组蛋白的纯度初步纯化后可达 670%。
外源基因的特性是决定表达成败的首要因素,
其次, 外源蛋白的理化特点、转化子的表型、包内表
达或分泌表达方式以及诱导表达的条件等都会影响
目的蛋白的表达效率。总之,影响外源基因在毕赤
酵母中高效表达的因素复杂而多样, 目前, 实现了
hIL10在毕赤酵母 SMD1168中的成功表达, 下一步
要通过探索最佳的优化表达条件, 进而作小规模的
发酵尝试, 使 hIL10在毕赤酵母中实现高效表达,
为 hIL10的基础研究和临床应用打下基础, 加速重
组 hIL10国产生物药品的开发。
参 考 文 献
[ 1] Fiorent ino DF, B oodMW, M osm ann TR. Tw o type ofm ou se T helper
cells IV. Th2 C lones secrete a factor that inh ib its cytok ine produ ct ion
by Th1 clon e. E xpM ed, 1989, 170 ( 6) : 20812095.
[ 2] M oore KW, de W aal M alefyt R, Coffm an RL, et a.l In terleukin10
and the interleuk in10 recep tor. Annu Rev Immuno,l 2001, 19( 1 ):
683765.
[ 3] Mocel lin S, Panelli MC, W ang E, et a.l Th e dual rule of IL10.
Trends Imm uno,l 2003, 24 ( 1) : 3643.
[ 4] Cont iP, K empu raj D, Kandere K, et a.l IL10, an in flamm atory/ in
h ib itory cytok inc, bu t not alw ays. Imm unol Len, 2003, 86 ( 2 ):
123129.
[ 5] 马学军,舒跃龙,等译校.精编分子生物学实验指南 (第 4版 ).
北京:科学出版社, 2005.
[ 6] Lee SW, H ong YS, Chun CM, et a.l An tiin flamm atory ef fects of IL4
and IL10 on hum an polym orphonuclear leukocytes. Korean M ed
S c,i 2002, 17 ( 1) : 714.
[ 7] Donck ier V, Lo iP, C losset J, et a.l Precondit ion ing of donorsw ith in
terleuk in10 reduces h epatic isch em iareperfu sion in ju ry after liver
transplantation in pigs. T ransp lan tat ion, 2003, 75: 902904.
[ 8] Lee CG, H om er RJ, C ohn L, et a.l Transgen ic over exp ress ion of in
terleuk in ( IL) 10 in th e lung causesm ucu sm etap lasia, issue in flam
m at ion, and a irw ay rem odeling via IL13dep eNden t andiN depeNd
ent pathw ays. B iolC hem, 2002, 277: 3546635474.
[ 9] Bondoc LL Jr, Varnerin JP, T ang JC. Resolu tion of recom b inan t hu
m an in terleuk in 10 from varian ts by recycling free flow focu sing. A
n alB ioch em, 1997, 246 ( 2) : 234238.
[ 10] M enassa R, Kennette W, Nguyen V, et a.l Sub cellu lar target ing of
hum an in terleuk in10 in p lan ts. B iotechno,l 2004, 108 ( 2 ):
179183.
[ 11] 井申荣,邹全明,曾韦锟,等.重组人白细胞 10在毕赤酵母中的
表达及生物学活性测定.中华微生物学和免疫学杂志, 2005, 25
( 9) : 773776.
(上接第 167页 )
[ 7] B orgstah l GE, Parge HE, H ickey M J, et a.l The stru cture of hum an
m itochond rial mangan ese superoxid e dism u tase reveals a novel tet
ram eric interface of tw o 4helix bund les. C el,l 1992, 71 ( 1 ):
107118.
[ 8] Ew ing B, G reen P. Analysis of expressed sequ ence tags ind icates
35 000 hum an gen es. Nat Genet, 2000, 25( 2 ): 232234.
[ 9] L ee HK, Jeong S. B etaCaten in stab ilizes cyclooxygenase2 mRNA by
interact ing w ith AUrich elem en ts of 3UTR. Nu cleic Acids Res,
2006, 34( 19 ) : 57055714.
172