全 文 ： 李贵生，赵振云，赖新强. 乌龟脑细胞辐射损伤的研究[J]. 生态科学，2011，30(4):436-440.
ZHONG Cai-rong,LI Shi-chuan, GUAN Wei, LI Hua-liang, LIN Xue-yun, Liao Bao-wen. Current distributions of three endangered
mangrove species in China[J]. Ecological Science, 2011, 30(4): 436-440.

乌龟脑细胞辐射损伤的研究
李贵生 1，赵振云 1，赖新强 2
1. 暨南大学生物工程学系，广州 510632
2．暨南大学实验中心，广州 510632

【摘要】在细胞培养的基础上，利用透射电镜和流式细胞术对乌龟脑细胞的辐射损伤进行了研究。在电镜下观察，未辐
射脑细胞为不规则的几何形状，有突起伸出；细胞核不规则，几何状或椭圆形，核仁和核周间隙明显；线粒体基质电子
密度均匀，内部嵴结构清晰；内质网清晰可见；细胞质匀质，内部充满大量糖原颗粒。乌龟脑细胞受辐射后，细胞外碎
片增多；核出现明显的分叶，并可见核碎片；核染色质固缩、边集；线粒体、内质网和部分细胞质出现空泡化；可见凋
亡小体。流式细胞术的检测结果显示：辐射组和未辐射组的细胞大部分都处于 G0 / G1期，分别占检测细胞总数 59.7 %和
61.9 %；在主峰前，辐射组细胞出现细胞凋亡峰；在 G2 / M 期，辐射组细胞的细胞数较未辐射组有所减少。研究结果表
明，乌龟脑细胞经辐射后出现了凋亡现象。
关键词：乌龟；脑细胞；辐射；超微结构；细胞凋亡；流式细胞术
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2011.04.012 中图分类号：Q945.78 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2011)04-436-05
Study on irradiation damage of brain cells of Chinemys reevesii
LI Gui-sheng
1
, ZHAO Zhen-yun
1
, LAI Xin-qiang
2

1. Department of Biotechnology, Jinan University, Guangzhou 510632, China;
2. Experimental Centre, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Abstract: The irradiation damage of Chinemys reevesii´s brain cells were studied by transmission electron
microscope and flow cytometry on the basis of cell culture. Under the transmission electron microscope, the
unirradiated brain cells were difform and had prominency spread. The karyons were geometry shape or elliptic. The
nucleolus and the gap of peri-nucleus were clear. The stroma electronic density was uniform and the structure of inner
crista was clear in mitochondrion. The endoplasmic reticulum was eidetic. The cytoplasm was uniform and many
glycogen particles appeared in cytoplasm. When the brain cells were irradiated, the fragments were increased outside
the cells. The visible sublobe appeared in karyon, and the nuclear fragment was seen. The chromatin was pycnosis
and focused in nuclear fringe. The vacuolizations were seen in mitochondria, endoplasmic reticulum and partial
cytoplasm. The apoptosis body appeared. The detected result of flow cytometry showed that the great mass of cells in
unirradiated group and in irradiated group were in G0 / G1 stage, which took up 61.9 % and 59.7 % respectively of the
total of detected cells. Ahead the major peak, the peak of apoptosis appeared in the irradiated group cells. In the G2 /
M stage, the cell numbers of the irradiated group were fewer than those of the unirradiated group. The results showed
that the apoptosis occurred in C. reevesii´s brain cells when the cells were irradiated.
Key words: Chinemys reevesii; brain cell ; irradiation; ultrastructure；apoptosis; flow cytometry
收稿日期：2011-01-15 收稿，2011-07-20 接受
作者简介：李贵生（1954—），男，博士，教授，主要从事水生经济动物养殖与病害研究，E-mail： ligs56@163.com
第 30 卷 第 4 期 生 态 科 学 30(4): 436-440
2011 年 7 月 Ecological Science Jul. 2011

万方数据
1 引言（Introduction）

电离辐射是一种危害较大的环境因子，大剂量的
电离辐射对细胞的形态、功能均会造成损伤（胡凌云，
2009）。辐射诱导的细胞损害，通常根据细胞形态学
上的特征性改变，分为细胞坏死和细胞凋亡
(apoptosis)（陆克义，2004）。细胞坏死是在细胞受到
重大损伤刺激后的一种病理变化，而细胞凋亡是细胞
对非急性致死的有害性刺激协调适应性反应的体现，
是一个利它的细胞自杀过程（Carson & Ribeiro，
1993）。细胞辐射损伤的研究，有助于了解电离辐射
对生物体组织和细胞的生物学效应及致癌机制，为肿
瘤的防治打下基础。辐射损伤在哺乳动物特别是人类
中研究较多，但在爬行动物中却罕见报道。爬行动物
是生物进化中一个承上启下的阶段，具有很多特殊
性。龟类是古老的爬行动物，它们起源于二叠纪的杯
龙类，中生代末期及第三纪初期最为繁盛，曾和不可
一世的恐龙在陆地和水中共同生活。七万年前的白垩
纪末期，恐龙全部灭绝，而龟类却生存至今，故有“活
化石”美称。龟类的耐饥力很强，是长寿的动物。龟
类也有很强的抗辐射损伤的能力（待发表资料），但
其抗辐射损伤的机制有待进一步探讨。本文利用课题
组培养的乌龟（Chinemys reevesii）脑细胞进行辐射
损伤的研究，以期增添爬行动物辐射损伤的资料。

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 实验动物
实验所用的乌龟为 3 ~ 6 m 龄，体重 10 ~ 30 g，
共 10 只，均取自暨南大学爬行动物养殖场。

2.2 组织培养材料
试验用国产 24 孔培养板，进口一次性塑料培养
瓶。DMEM 培养基和胎牛血清，均为美国 Gibco 公
司产品。所有培养液的 pH 值都调整到 7.20。实验在
紫外线杀菌 1 h 以上的无菌室进行。

2.3 组织细胞培养
将幼龄乌龟体表清洗干净，用 75%酒精棉球擦拭
体表，以酒精棉球按住乌龟头部以致其麻醉，放入玻
璃平皿转入超净工作台，然后用灭菌的眼科镊固定，
将乌龟头骨打开，取出其脑部组织放入平皿中以磷酸
盐缓冲液（PBS）浸泡。将脑部组织用含有双抗的 PBS
漂洗，洗去表面血污，剔除软骨组织并剪成块，再用
PBS 漂洗多次后，吸去多余液体。组织小块集中于平
皿一角，用眼科剪不断反复剪切组织块约 20 ~ 30
min，约剪成 1 mm3大小。剪好的脑部组织块无需经
胰酶消化，直接加入约 2 mL 含有双抗和 20 % 胎牛
血清的 DMEM 培养液，用移液器移至 25 cm2 培养瓶
中，轻轻晃动使瓶内液体铺满底面，做好标记，放入
27 ℃ 恒温生化培养箱内培养，3 ~ 5 d 组织块贴壁后
补加培养液至 5 mL，继续培养。培养过程中，随时
观察细胞的贴壁以及生长情况，培养初期隔 3 ~ 5 d
更换半量的培养液，发现有污染的培养瓶及时丢弃。

2.4 实验方法
2.4.1 透射电镜观察
2.4.1.1 取材、固定和包埋
将生长良好的原代培养的脑细胞按 1 ：2 传入两
个 25 cm2 培养瓶，培养至对数生长期后，其中一瓶
用直线离子加速器X射线以8 Gy 剂量进行一次性辐
射，辐射后继续培养至第 5 d。另一瓶做对照用。将
准备好的两瓶细胞消化，制成悬液，1 000 rpm·min-1
离心 5 min，弃去上清，收集细胞，置于 4 ℃ 预冷的
2.5 %戊二醛中固定 2 h 以上，PBS 冲洗 3 次，每次 5
min，然后用 1 % 锇酸固定 2 h，PBS 冲洗 3 次，每
次 10 min，乙醇和丙酮逐级脱水，每次 15 min。Epon
812 包埋液渗透包埋。
2.4.1.2 超薄切片的制作、染色和观察
用 LKB V 型超薄切片机切片，切片厚度为 50 ~
70 nm，用直径 3 mm 的 200 目铜网捞起，滤纸吸干
后用醋酸双氧铀和硝酸铅双重染色，蒸馏水冲洗后在
PHLIIPS TECNAI 10 透射电镜下观察。
2.4.2 流式细胞术检测
将生长良好的原代培养的脑细胞（TBCs）按 1 ：
2 传入两个 25 cm2 培养瓶，培养至对数生长期后，
其中一瓶用直线离子加速器X射线以5 Gy 剂量进行
一次性辐射，辐射后继续培养至第 5 d。另一瓶不辐
射。然后按下列步骤实验。
（1）胰酶消化并分别收获两瓶细胞，用 PBS +2%
胎牛血清缓冲液制成单细胞悬液；
（2）PBS 缓冲液洗涤细胞两次，并调整密度为
1 ~ 2 × 10
6
个·mL-1；
（3）吸取 1 mL 细胞液于 15 mL 一次性尖头离
心管中，用力打入 3 mL 预冷的无水乙醇，混合均匀，
置于 4 ℃ 1 h；
（4）用 PBS 洗涤细胞两次，3 000 R·min-1，离
心 5 min；
4 期 李贵生，等：乌龟脑细胞辐射损伤的研究 437

万方数据
（5）加入 1 mL PI 染液，混合均匀，加入 1 μL
10 mg·mL-1 RNase A，4 ℃ 3 h；
（6）样品送至暨南大学实验中心，上流式细胞
仪分析。

3 结果（Results）

3.1 透射电镜观察结果
电镜下观察对数生长期的未辐射乌龟脑细胞为
不规则的几何形状，有突起伸出（图 1A）；细胞核不
规则，几何状或椭圆形，核仁和核周间隙明显（图
1B）；线粒体数量较多，横切可见圆形切面，基质电
子密度均匀，内部嵴结构清晰（图 1C）；内质网清晰
可见，整齐地排列在细胞核以及线粒体的周围（图
1D）。细胞质匀质，内部充满大量糖原颗粒。
受照射后的乌龟脑细胞，在电镜下观察，细胞为
不规则的几何形状，细胞外碎片增多（图 2A）；细胞
核出现明显的分叶，核染色质固缩、边集，并可见核
碎片（图 2B）；线粒体数量减少，嵴从内膜上脱落，
基质排列紊乱，部分出现空泡化（图 2C）；内质网结
构紊乱，肿胀，部分空泡化（图 2D）；可见典型的凋
亡小体（图 2E）；部分细胞质空泡化（图 2F）。

3.2 流式细胞术检测结果
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测原代
培养的乌龟脑细胞辐射组和未辐射组 5 d后的周期结
果显示，受检测辐射组和未辐射组的细胞大部分都处
于 G0 / G1期，即二倍体时期，分别占检测细胞总数
的 59.7 % 和 61.9 %。在主峰前，辐射组细胞有一个
较未辐射组细胞增加的亚二倍体峰；在 G2 / M 期细
胞中，辐射组与未辐射组的细胞数分别为 2.4 % 和
4.3 %（图 3A，3B）。

4 讨论（Discussion）

许多理化生物因素如电离辐射、热处理、病毒、
细胞毒剂、营养不足等均可诱导细胞凋亡，而且不同
因素诱导的细胞凋亡所表现出的形态学变化过程基
本相同。所以，形态学变化是鉴定细胞凋亡的金标准
(陈铁河，印木泉，1998)。凋亡细胞的形态学变化包
括细胞骨架破坏、体积缩小、核固缩、核微孔消失、
核膜折陷将核分隔成几部分、胞体缩小、质膜发泡、
细胞器紧缩、细胞破裂生成膜包裹着的凋亡小体等
（吴玮，1999）。电离辐射所致的细胞凋亡除上述特
征性改变外，其细胞膜结构与功能、膜通透性及染色
质形态结构变化更突出（何子毅，孟庆勇，2004）。
本研究显示：培养的乌龟脑细胞受照射后，细胞外碎
片增多；核被折陷的核膜分隔成几部分，并可见核碎
片；核染色质固缩、边集；线粒体和内质网结构受到
损害，有空泡化现象；可见特征性的凋亡小体。符合
前人报道的电离辐射所致的细胞凋亡特征。
流式细胞术是一种以对细胞或亚细胞结构进行
快速测量的新型分析技术和分选技术。它是一门综合
了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图


A 示胞质突起（→） B 示核周间隙（→） C 示线粒体（→） D 示内质网（→）
A Show the protuberance B Show the gap of C Show mitochondrion D Show endoplasmic
of cytoplasm（→） peri-nucleus（→） （→） reticulum（→）

图 1 乌龟脑细胞的超微结构
Fig.1 Ultrastructures of brain cells of Chinemys reevesii

438 生 态 科 学 Ecological Science 30 卷

万方数据

A 示细胞碎片（→） B 示核碎片（→） C 示线粒体空泡化（→）
A Show the fragment of cell B Show the fragment of nucleus C Show the vacuolization of
（→） （→） mitochondrion（→）

D 示内质网空泡化 E 示凋亡小体（→） F 示细胞空泡化（→）
D Show the vacuolization of E Show the apoptosis body F Show the vacuolization of
endoplasmic reticulum（→） （→） cell （→）
图 2 受辐射乌龟脑细胞的超微结构
Fig.2 Ultrastructures of irradiated brain cells of Chinemys reevesii

像技术等众多领域的知识和成果的高科技技术（贾永
蕊，2010）。流式细胞术可应用于凋亡细胞的研究（刘
鑫，庞铁光，姚闯，徐玉清，2010）。细胞凋亡时，
核酸内切酶激活，导致 DNA 断裂，这是凋亡的特征
性表现，也为 FCM 鉴别凋亡细胞奠定了基础（管增
伟，范宪周，2004）。目前检测细胞凋亡 DNA 断裂
的方法中，最常用就是细胞 DNA 含量分析。在细胞
染色之前，首先经去污剂处理，当细胞用乙醇、Trtion
X - 100 处理后细胞膜上出现漏洞，小片段 DNA 从
细胞内释放出来，使其 DNA 含量低于正常细胞的二
倍体，然后用碘化丙啶（PI） 染色后分析，可在二
倍体 G0 / G1峰前出现“亚二倍体”峰， 即细胞凋亡峰
（APO 峰）， 根据 APO 峰可测出凋亡细胞百分率
（王敬春，苗术，黄海涛，2007）。本研究结果显示，
照射组细胞有一个较对照组细胞增加的亚二倍体峰，
说明出现了凋亡细胞。用流式细胞术检测细胞凋亡具
有速度快和检测数量大等优点，可避免细胞数少造成
的偏差，既能定性又能定量，较容易进行凋亡和其他
相关因素联合检测，在研究凋亡中具有其他方法无法
比拟的优势（Elstein & Zucker，1994）。
流式细胞仪对细胞周期的分析主要是对单个细
胞内 DNA 含量的分析，通过标记物发出红色荧光的
强弱可推算出 G0、G1期（二倍体）、S 期（超二倍体）、
G2、M 期（四倍体）的比例，其敏感性和特异性均
超过其它方法，其结果以 DNA 分布的直方图的形式
显示，进而可计算出 G0 / G1，S / G2 + M 比率来了解
细胞的增殖能力，并可了解细胞的增殖状态（耿慧霞，
王来，王强，2005）。在本研究中，辐射组和未辐射
组的细胞大部分都处于 G0 / G1期。此外，在 G2 / M
期中，辐射组细胞数较少。超微结构和流式细胞术对
乌龟脑细胞的分析均表明经辐射后的细胞发生了凋
亡。

4 期 李贵生，等：乌龟脑细胞辐射损伤的研究 439

万方数据



A 原代培养脑细胞辐射组检测结果 B 原代培养脑细胞未辐射组检测结果
A FCM result of irradiated TBCs B FCM result of unirradiated TBCs

图 3 流式细胞术检测结果
Fig.3 Detected results by FCM

参考文献（References）

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440 生 态 科 学 Ecological Science 30 卷

万方数据
乌龟脑细胞辐射损伤的研究
作者： 李贵生， 赵振云， 赖新强， LI Gui-sheng， ZHAO Zhen-yun， LAI Xin-qiang
作者单位： 李贵生,赵振云,LI Gui-sheng,ZHAO Zhen-yun(暨南大学生物工程学系,广州,510632)， 赖新强,LAI Xin-
qiang(暨南大学实验中心,广州,510632)
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGICAL SCIENCE
年，卷(期)： 2011,30(4)

参考文献(12条)
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