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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):152-157
每年植物通过光合作用产生的木质纤维素类物
质约 7.2 ×1010 t，如此大量的生物质可以为人类的
可持续发展提供丰富的再生能源［1］。但是由于结构
的特殊性，木质纤维素的利用一直受到限制［2］。微
生物生产的纤维素酶能够把纤维素降解成小分子糖，
进一步发酵生产能源类物质［3，4］。目前工业上用
收稿日期 ：2015-05-05
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31200084）
作者简介 ：李洋，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物 ；E-mail ：443897205@qq.com
通讯作者 ：高晓蓉，女，副教授，研究方向 ：微生物 ；E-mail ：biogaoxr@dlut.edu.cn
草酸青霉菌生产纤维素酶的反应条件优化
李洋  高晓蓉  张健
（大连理工大学生命科学与技术学院，大连 116024）
摘 要 ： 纤维素酶在生物能源、纺织、饲料和造纸工业等具有重要作用，筛选高效微生物生产菌株，优化最佳产酶工艺，
是获得该产品的有效途径。从含有落叶腐木和腐烂秸秆的土壤中筛选出一株高效纤维素降解菌，采用形态学观察及核糖体保守序
列分析确定该菌株分类地位，对菌株最适发酵初始 pH、最适碳源、氮源及不同表面活性剂选择添加进行最佳产酶条件优化。形态
学结合 ITS（Internal Transcribesd Spacer）基因序列系统发育学分析确定分离的菌株其为草酸青霉菌，命名为 Penicillium oxalicum
JG。该菌株以初始 pH2.0-3.0，CMC-Na 为碳源，豆粉为氮源时，产纤维素酶能力达到最大。不同表面活性剂对菌株产酶影响的结
果发现，来源广泛、价格相对较低廉的卵磷脂对草酸青霉菌具有明显的产酶促进作用，发酵液中滤纸酶（FPA）、β-1，4-内切葡聚
糖酶（CMCase）和 β-葡萄糖苷酶（BGL）活力分别提高 72.9%、20.8% 和 33.6%。草酸青霉菌 JG 可在酸性初始条件下发酵生产复
合纤维素酶，卵磷脂可明显提高其产酶活性。
关键词 ： 草酸青霉菌 ；纤维素酶 ；卵磷脂 ；条件优化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.020
The Optimization of Fermentation Condition for Cellulase Production
by Penicillium oxalicum
LI Yang GAO Xiao-rong ZHANG Jian
（School of Life Science and Technology，Dalian University of Technology，Dalian 116024）
Abstract: Cellulase plays an important role in the biological energy, textile, feed, paper industry, et al. Screening efficient strains
and optimizing the fermentation condition are the effective way of obtaining cellulase. A cellulose-degrading strain JG was isolated from the
soil containing rotten wood and straw. Morphology and molecular phylogenetic studies were used for its identification. Some factors during its
fermentation were optimized, including initial pH, carbon source, nitrogen source and surfactants. The strain JG was identified as Penicillium
oxalicum by analyzing its morphology and ITS（Internal Transcribesd Spacer）gene sequence phylogenetic systematics. Its optimal cultural
conditions for the highest cellulase production were as following ：initial pH values 2-3, carbon and nitrogen source were CMC-Na and soybean
meal. Studying the effects of adding different kinds of surfactant on the fermentation process demonstrated that the lecithin of wide source
and relatively low price had an obviously high effects on the cellulase production in JG, and the enzyme activities of FPA, CMCase, and BGL
increased by 72.9%, 20.8% and 33.6% respectively. In conclusion, JG produced cellulase under lower initial pH, and lecithin enhanced its
cellulase activity significantly.
Key words: Penicillium oxalicum ；cellulase ；lecithin ；optimization
2016,32(2) 153李洋等：草酸青霉菌生产纤维素酶的反应条件优化
于纤维素酶生产的菌种主要是各种真菌，包括木霉
属（Trichoderma）、 曲 霉 属（Aspergillus） 和 青 霉 属
（Penicillium）等［5］，但不同菌株的最佳产酶条件和
促进剂作用多有不同，每种菌株所产纤维素酶若不
能发挥其全部潜能，将严重影响纤维素酶的降解效
率［6，7］。本实验从腐殖土壤样品中分离一株产纤维
素酶降解菌，通过对其发酵产酶条件优化和产酶组
成分析，旨为纤维素酶菌株的生产应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验样品 实验样品采自大连市不同地区 20
个含有腐木、腐烂秸秆的土样及牛粪等。
1.1.2 实验试剂 化学试剂均为分析纯。引物合成
及 DNA 测序由上海生工生物工程有限公司完成。
1.1.3 培养基组分 羧甲基纤维素钠培养基 ：CMC-
Na 10 g，（NH4）2SO4 4 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O
0.5 g， 蛋 白 胨 1.0 g， 琼 脂 16 g， 加 水 至 1 L，
1×105 Pa 灭菌 30 min。
纤维素刚果红鉴别培养基（参照文献［8］稍有
改进）：（NH4）2SO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5
g，KH2 PO4 1.0 g，微晶纤维素 2.0 g，刚果红 0.4 g，
琼脂 20 g，加水至 1 L，1×105 Pa 灭菌 30 min。
滤纸液体培养基：滤纸 0.5 g，（NH4）2SO4 20.0 g，
尿素 3.0 g，蛋白胨 3.0 g，CaCl2 3.0 g，MgSO4·7H2O 5.0
g，NaCl 0.1 g，FeSO4·7H2O 50.0 mg，MnSO4·7H2O
16.0 mg，ZnSO4·7H2O 14.0 mg，COCl2 20.0 mg，加水
至 1 L，1×105 Pa 灭菌 30 min。
发 酵 培 养 基 ：麸 皮 30 g，（NH4）2SO4 3.0 g，
KH2PO4 2.0 g，加水至 1 L，1×10
5 Pa 灭菌 30 min。
1.2 方法
1.2.1 菌株的筛选 每份土样 10.0 g，加入无菌水，
28℃，200 r/min 振荡培养 48 h 后，取上清液。采取
梯度稀释法，按照 10-1-10-8 浓度分别涂布于羧甲基
纤维素筛选培养基上，30℃暗培养 3 d。挑取长势好
的菌株转接到刚果红培养基，挑选显示有透明圈的
菌株接入 PDA 培养基进行纯化［9］。纯化 3 代后，接
入滤纸液体培养基，30℃，180 r/min 震荡培养 7 d，
测试滤纸崩解率［10］。
滤纸崩解率（%）=（发酵前的滤纸条重量 - 发酵
后的滤纸条的重量）/ 发酵前的滤纸条重量 ×100%
1.2.2 菌株的鉴定 形态、培养和生理生化特征鉴
定参照《真菌鉴定手册》进行。
DNA 提 取 采 用 Sangon 真 菌 提 取 试 剂 盒。 以
提取的基因组 DNA 为模板，真菌通用引物 ITS1 ：
（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3） 和 ITS4 ：（5-T-
CCTCGCCTTATTGATATGC-3）［11］为引物进行 PCR
扩增，反应体系 25 μL。PCR 反应条件 ：94℃预变性
5 min；94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 2 min，35 个循
环 ；72℃延伸 10 min。
PCR 产物测序由 Songon 公司完成。测序结果应
用 MEGA5.0 软件包构建系统发育树［12］。
1.2.3 纤 维 素 酶 酶 活 力 测 定 和 定 义 分 别 以 1%
（W/V）羧甲基纤维素钠、50 mg（1 cm×6 cm）新华
滤纸、0.5% 水杨苷为底物，在 50℃下分别反应 60
min、30 min 和 30 min，在 540 nm 紫外波长下，用
DNS 法 测 定 滤 纸 酶（FPA）、β-1，4- 内 切 葡 聚 糖 酶
（CMCase）、β-糖苷酶（BGL）［13］酶活。
酶活定义 ：在 50℃条件下，相应底物在酶的作
用下，每分钟产生 1 μmol 葡萄糖所需酶量为一个酶
活力单位，用 IU/mL 表示［14］。
1.2.4 菌株初始 pH、碳源、氮源及金属离子的确
定 将基础发酵培养基初始 pH 值分别调至 1.0、2.0、
3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0， 测 定 不 同 pH 条 件
下菌株产酶活性。分别用麸皮、滤纸、CMC-Na、玉
米粉代替基础发酵培养基中碳源，用豆粉、硫酸铵、
尿素、酵母粉、蛋白胨代替氮源，添加不同种类金
属离子，30℃，180 r/min 发酵培养 144 h，测定不同
碳、氮源及金属离子对菌株酶活的影响［15］。
1.2.5 不同种类表面活性剂对菌株产酶影响 在优
化后的培养基中分别加入 EDTA 二钠、SDS、PEG、
鼠李糖脂及卵磷脂，30℃，180 r/min 发酵培养 144 h，
测定不同表面活性剂对菌株 JG 产酶的影响［16，17］。
1.2.6 纤维素酶 SDS-PAGE 分析 菌株 JG 在优化后
的培养基中，30℃，180 r/min 发酵培养 144 h，粗酶
液经 40% 乙醇沉淀、浓缩后 , 上样于 15% 的分离胶
和 5% 的浓缩胶中进行 SDS-PAGE 电泳，以标准纤
维素酶（上海 Songon 公司）及商品化酸性纤维素酶
（山东龙元生物工程有限公司食品添加、纺织用工业
酸性纤维素酶）作为对照。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2154
2 结果
2.1 菌株的筛选
选取 CMC-Na 培养基上长势良好的 10 个菌株，
分离纯化后分别命名为 Y-1、JG-1、TNL-1、TNL-2、
XTNL-1、HTNL-2、WHXTNL、LZ、JG-2 和 VI。 从
菌落生长形态判断 Y-1 和 VI 为放线菌 ；TNL-1 和
TNL-2 为 细 菌 ；JG、XTNL-1、HTNL-2、WHXTNL、
LZ 和 JG 为真菌。进一步测试各菌株对滤纸崩解程
度发现，JG 滤纸崩解率最高，为 19.7%。图 1 为 JG
在刚果红鉴别培养基上产生的透明圈及其在 PDA 培
养基上生长 5 d 的形态，可以看出菌落呈明显青绿色，
表面为粉粒状，初步确定 JG 为真菌。液体培养结果
测得，JG 的 CMCase 酶活性为 0.435 IU/mL，明显高
于其他菌株，故选择 JG 进一步研究。
2.2 菌株ITS序列鉴定及系统发育分析
PCR 扩增获得的序列长度为 564 bp，GenBank
序列登录号为 KC880081.1，与 Penicillium oxalicum
strain QHBC11 相似性最大，为 99%，初步确定该菌
株为一株草酸青霉菌，命名为 Penicillium oxalicum
JG（图 2）。
2.3 初始pH对菌株产酶影响
培养基发酵初始 pH 值对菌株 JG 产酶活性影
Penicillium oxalicum NFML_CH42_88 1KM458819.1
Penicillium oxalicum strain RHmKM246756.1
Uncultured fungus clone LX042234-122-013-F04
Penicillium oxalicum BKKM186184.1
Penicillium sp. B4FJ196840.1
Penicillium oxalicum SCSAAF0017JQ647900.1
Penicillium funiculosumJN676124.1
JG
Penicillium oxalicum strain QHBC11KC880081.1
Penicillium oxalicum FFRh5HQ443244.1
Penicillium oxalicum F3JF793525.110072 81
39
46
85
0.002
图 2 菌株 JG 基因系统发育进化树
FPA
CMCase
BGL
0.8
0.6
0.4
0.2
0
䞦⍫࣋/IU·mL-1 
1 2 3 4 5
pH
6 7 8 9 10
图 3 不同初始发酵的 pH 值对纤维素酶活影响
A ：刚果红培养基上 JG 透明圈形态 ；B ：JG 在 PDA 培养基上菌落形态
图 1 菌株 JG 形态特征
响结果（图 3）表明，菌株以麸皮为底物，初始 pH
在 2.0-3.0 时，所产纤维素总的酶活性最高，当初始
pH>5.0 时，酶活开始明显下降。在发酵过程中还发
现，4.0 时该菌产酶最适 pH 值。
2.4 不同碳源对纤维素酶活的影响
发酵初始 pH2.5 条件下，菌株 JG 在以 CMC-Na
和麸皮为底物时，诱导产生的 CMCase 和 BGL 均表
现出较高的酶活力（表 1），外切纤维素酶活也明显
高于其他种类的碳源（表中未列出），但是以 CMC-
A B
2016,32(2) 155李洋等：草酸青霉菌生产纤维素酶的反应条件优化
Na 为碳源的 FPA 略低于以麸皮为碳源时的活力。通
常情况下，CMCase 作为水解纤维素聚合链的第一步
反应酶，其活力大小起着重要作用，故选取 CMCase
酶活表现较高的 CMC-Na 作为 JG 发酵培养的最适
碳源。
2.5 不同氮源对菌株纤维素酶活的影响
在发酵初始 pH2.5，碳源为 CMC-Na 的条件下
优化氮源的结果（表 2）显示，豆粉作为有机氮源
更容易被菌株利用，且对提高菌株酶活力有明显的
促进作用。故选择豆粉作为发酵培养基的最适氮源。
2.6 不同金属离子对菌株纤维素酶活的影响
金属离子通常作为酶的活性中心的组成部分，
对调节维持微生物细胞渗透压以及维持细胞结构的
稳定性具有重要的作用。在培养基中分别加入 Na+、
Mg2+、Ca2+、K+ 和 Fe3+，测定不同金属离子对菌株发
酵酶活的影响，结果（表 3）显示，金属离子对纤
维素酶活的影响相对较小，但是 K+ 对酶活有一定的
促进作用。因此，在菌株发酵过程中可以添加少量
表 1 不同碳源对纤维素酶活的影响
碳源（3%W/V） FPA/（IU·mL-1） CMCase/（IU·mL-1） BGL/（IU·mL-1）
麸皮 0.342±0.021 0.467±0.016 0.704±0.02
滤纸 0.293±0.011 0.134±0.012 0.053±0.006
羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 0.220±0.013 0.623±0.018 0.806±0.032
玉米粉 0.306±0.019 0.173±0.006 0.130±0.003
注 ：酶活值（IV/mL）= 实验平均值（3 次）± 标准差，下同
表 2 不同氮源对纤维素酶活的影响
氮源（0.3%W/V） FPA/（IU·mL-1） CMCase/（IU·mL-1） BGL/（IU·mL-1）
豆粉 0.237±0.024 0.809±0.016 0.892±0.020
硫酸铵 0.201±0.018 0.621±0.009 0.713±0.004
尿素 0.116±0.022 0.434±0.034 0.239±0.028
酵母粉 0.113±0.011 0.389±0.040 0.500±0.026
蛋白胨 0.087±0.004 0.265±0.018 0.319±0.030
表 3 不同金属离子对纤维素酶活的影响
金属离子（0.1%W/V） FPA/（IU·mL-1） CMCase/（IU·mL-1） BGL/（IU·mL-1）
Na+ 0.16±0.008 0.49±0.023 0.66±0.013
K+ 0.25±0.015 0.87±0.019 0.91±0.021
Ca2+ 0.10±0.006 0.53±0.021 0.65±0.015
Mg2+ 0.17±0.013 0.57±0.003 0.67±0.009
Fe3+ 0.15±0.002 0.27±0.018 0.42±0.014
的 K+ 作为促进剂。
2.7 添加表面活性剂对纤维素酶活力的影响
络合剂 EDTA 二钠和阴离子表面活性剂 SDS，
对菌株 JG 产生 FPA、CMCase、BGL 三种酶活性均
有明显的抑制作用（图 4）。PEG、卵磷脂和鼠李糖
脂都是非离子表面活性剂，它们对 JG 产生的纤维素
酶活性却有一定的促进作用，其中 PEG 促进作用较
小，并且对 CMCase、BGL 酶活性的产生抑制作用，
但能提高 FPA 酶活性 ；而鼠李糖脂和卵磷脂却有明
显的促进作用。但是鼠李糖脂价格较高，将增加工
业应用的生产成本，相比之下，卵磷脂价格低廉、
材料易得且无污染，更易成为首选。本实验中添加
卵磷脂后，菌株 JG 所产的 FPA、CMCase、BGL 酶
活性分别提高了 72.9%、20.8%、33.6%，与添加鼠
李糖脂的效果相同，故选择卵磷脂作为 JG 发酵产酶
的最适表面活性剂。
2.8 菌株JG产酶SDS-PAGE分析
将优化后菌株 JG 所产的纤维素酶组分进行了分
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2156
析，结果（图 5）显示，超滤后的 3 个目标蛋白大
小约为 55、37 和 33 kD。发酵产物蛋白的谱型与商
品酸性纤维素酶谱比较相近，具体成分有待进一步
分离纯化后分析。
名为 Penicillium oxalicum 98MJ，其对半纤维素、纤
维素及木质素都有较好的降解效果，是一株具有开
发潜力的纤维素酶生产菌株。本研究通过对筛选获
得的草酸青霉菌 JG 进行产酶单因素优化，确定初始
pH 值为 2.0-3.0，CMC-Na 和豆粉为最优产酶条件。
张蔚等［22］所筛选的草酸青霉菌在初始 pH 值 7.0，
以 4% 麸皮和 0.2% 牛肉膏为最适产酶底物。本实验
还对不同金属离子对产酶的影响进行了研究，结果
表明，添加 K+ 对菌株产酶具有一定的促进作用，但
是效果并不明显。
菌株 JG 的最适初始发酵 pH 为 2.0 左右，发酵
过程中 pH 值维持在 4.0 左右。穆春雷等［23］ 曾经
筛 选 出 一 株 草 酸 青 霉 菌 M11（Penicillium oxalicum
M11），该菌株在初始 pH 为 6.5，发酵过程中 pH 值
为 5.0 时产酶达到最适。耿丽萍等［24］对草酸青霉
菌 HB1 的产酶条件优化后指出其菌株最适初始 pH
为 4.0-7.0 之间，发酵 pH 为 7.0 时，酶活力最旺盛。
由此可知，本研究获得的草酸青霉菌 JG 为具备较强
耐酸性的产纤维素酶菌株，其原因可能与草酸青霉
菌代谢产酸有关。当工业上对纤维素类物质的处理
采用酸时，该菌可以表现出较强的耐酸性，具有实
际的应用价值。
表面活性剂由于结构的特殊性，具有改变酶作
用微环境的功能。刘佳等［25］研究了吐温 -80 和鼠李
糖脂对绿色木霉产纤维素酶的影响，发现鼠李糖脂
促进产酶效果明显高于吐温 -80。卵磷脂作为两性离
子表面活性剂，在酸性环境中，呈阳离子表面活性
剂的性质，可以使菌丝在培养基中分散更均匀，增
加与底物接触，从而对菌株产酶有很大促进作用。
卵磷脂对纤维素酶的作用机理很早之前就有研究。
缪炜等［26］经研究发现卵磷脂可作用于内切葡聚糖
酶，引起酶构象的变化，并且与作用 pH 值和卵磷脂
添加浓度有很大的关系。本研究选用的 JG 发酵培养
基中分别添加鼠李糖脂和卵磷脂，培养 7 d 后，内
切葡聚糖苷酶、β-糖苷酶和滤纸酶活性较其它几种
表面活性剂诱导产生的酶活性都达到最大值，结果
非常相近。添加卵磷脂的最终滤纸酶活 0.41 IU/mL、
内切纤维素酶活 0.978 IU/mL、β-葡萄糖苷酶活 1.192
IU/mL，分别提高了 72.9%、20.8% 和 33.6%。考虑
到鼠李糖脂由于成本较高，不适于大规模的工业应
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
䞦⍫/IU·mL-1  ᵚ␫࣐ EDTAҼ䫐 SDS PEG 卵磷脂 鼠李糖脂
BGL
CMCase
FPA
图 4 不同种类表面活性剂对菌株产酶影响
M ：Protein Marker ；1 ：标准工业纤维素酶 ；2 ：工业酸性纤维素酶 ；3 ：菌
株 JG 产酶 ；4 ：超滤后蛋白样品
图 5 纤维素酶 SDS-PAGE 分析
97.2
kD
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
M 1 2 3 4
3 讨论
本实验从含有腐烂树叶和秸秆的土壤中筛选
到一株纤维素降解菌，形态学和分子生物学鉴定
为草酸青霉菌，命名 Penicillium oxalicum JG。近几
年，对于草酸青霉菌产纤维素酶能力的研究比较集
中，青岛农业大学张名爱等［18，19］证明了分离出的
鹅源草酸青霉（Penicillium oxalicum Currie ＆ Thom）
F67，具有产纤维素酶、果胶酶及溶磷等特性，并已
有广泛的应用。杨友坤等［20］从牛粪堆肥样品中筛
选出一株草酸青霉菌，命名为 Penicillium oxalicum
F12，具有较强的纤维素降解能力，在高纤维类物质
堆肥过程中有着较大的应用潜力。王洪媛等［21］从
土壤中筛选到一株降解能力较强的草酸青霉菌，命
2016,32(2) 157李洋等：草酸青霉菌生产纤维素酶的反应条件优化
用 ；相比之下，卵磷脂更具有工业应用的潜质。
4 结论
本研究从含有枯枝腐叶及牛粪的土壤样品中筛
选出一株具有纤维素降解能力的草酸青霉菌，命名
为草酸青霉菌 JG（Penicillium oxalicum JG）。该菌株
在最适碳源、氮源底物和最适发酵初始 pH 条件下
产酶能力有显著提高。生物表面活性剂卵磷脂菌株
JG 产酶具有明显的促进作用。
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（责任编辑 李楠）