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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):58-62
甘蔗（Saccharum officinarum L.）是世界上一种
重要的糖料作物和能源作物。培育高产、高糖、高
抗的甘蔗新品种一直是甘蔗育种的主要目标。随着
分子生物学的快速发展，转基因技术已成为甘蔗育
种的重要方法。该技术通过将特定的基因导入甘蔗
中，不仅可以使甘蔗的产量和品质性状得以提高，
还能缩短育种的年限和周期［1］。目前，对转基因甘
蔗植株的初步检测，国内外的实验室及检测部门运
用最广泛的是 PCR 技术，该方法简便快捷，灵敏度
高［2，3］。然而对转基因甘蔗进行 PCR 鉴定的前提是
必须提取甘蔗植株基因组 DNA，目前提取 DNA 的方
法有很多种，使用最多的主要有 CTAB 法［4］、SDS
法［5］及其改良法［6］。这些方法提取 DNA 所需材料多，
步骤繁琐，费时费力且纯化程序复杂，因此当需要
收稿日期 ：2015-09-11
基金项目 ：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（ITBB140502），现代农业产业技术体系建设专项基金（CARS-20-2-5）
作者简介 ：崔学强，男，硕士研究生，研究方向 ：植物细胞与分子生物学 ；E-mail ：yncuixueqiang@126.com
通讯作者 ：冯翠莲，女，博士，助理研究员，研究方向 ：甘蔗生物技术 ；E-mail ：fengcuilian @126.com
一种简易的甘蔗叶组织 PCR 模板制备方法
崔学强1，2  张树珍2  冯翠莲2
（1. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 甘蔗研究中心 农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101 ；2. 海南大学农学院，
海口 570228）
摘 要 ： 以转基因甘蔗叶片为材料，少量嫩叶经碱并短暂高温处理，再中和，形成裂解混合物。直接以此为模板，转基因
甘蔗外源基因 bar、KP4、Cry1Ac-2A-gna 融合基因及内源基因 Shactin 基因为靶基因，PCR 扩增结果稳定、准确、重复性强，完全
可以达到常规 CTAB 法提取的 DNA 扩增效果。用此方法制备的模板室温下 2 周之内，4℃、-20℃下一个月之内结果不变。经多种
外源基因 PCR 反应的反复验证，证实了这种方法在转基因甘蔗检测中的广泛适用性。该方法快速制备 PCR 模板，无需 DNA 提取
过程，具有使用样品量少，成本低、简便、快捷等优点。
关键词 ： 甘蔗 ；碱裂解 ；中和 ；PCR 模板 ；多重 PCR
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.012
A Simple Method for Preparing PCR Template of Sugarcane
Leaf Tissue
CUI Xue-qiang1，2 ZHANG Shu-zhen2 FENG Cui-lian2
（1. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of CATAS，Sugarcane Research Center，Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops
of Ministry of Agriculture，Haikou 571101 ；2. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228）
Abstract: Using transgenic sugarcane leaves as materials，a small amount of young leaves were treated by alkali and transient
heat，then neutralized，and cracking mixture was formed. The mixture was directly used as the template of PCR，and transgenic sugarcane
exogenous gene of bar，KP4，CryIAc-2A-gna and endogenous gene Shactin as target genes，the amplified results were stable，accurate and
reproducible，which reached the same effect of DNA amplification by conventional CTAB method. The templates by this method were still
stable at room temperature for 2 weeks and at 4℃，-20℃ for 1 month. A series of exogenous gene PCR reactions were tested，which verified
that this method was widely available in the detection of transgenic sugarcane. The method is fast for preparation of PCR templates without DNA
extraction process，owing the advantages of requiring less material sample，low cost，simple，rapid，and efficient.
Key words: sugarcane ；alkali lysis ；neutralization ；PCR template ；multiple PCR
2016,32(3) 59崔学强等：一种简易的甘蔗叶组织 PCR模板制备方法
检测的转基因植株较多时，这些方法显得不太适
用［7，8］。本实验拟研究出一种适用于转基因甘蔗检
测的 PCR 模板的快速制备方法。该方法快速制备
PCR 模板，无需 DNA 提取过程，具有使用材料少，
成本低、简便、快捷等优点。尤其适合材料比较宝
贵的转基因甘蔗的预筛选和大样本量的 PCR 检测，
以期为转基因甘蔗分子育种的实际应用创造了条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植 物 材 料 转 KP4 基 因 和 转 CryIAc-2A-gna
融合基因甘蔗植株由本课题组利用农杆菌介导法获
得，导入转基因植株的骨架载体为 pCAMBIA3300，
筛选基因为 bar 基因，对照植株为非转基因 ROC-22
植株。
1.1.2 主要试剂与仪器 2×Taq MasterMix 购自康为
世纪生物科技有限公司 ；2000 bp DNA Ladder Maker
（M1101）购自东盛生物公司 ；琼脂糖购自 Sigma 公
司 ；NaOH、HCl、Tris-HCl 等购自广州化学试剂厂，
均 为 分 析 纯 ；PCR 扩 增 仪 T1 Thermocycle（Biome-
tra）；常温离心机（HETTICHD-78532）；恒温水浴锅
（浦光 HH-4）。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 利用 Primer Premier V 5.0 分别设
计合适引物，再利用 Oligo V6.22 对设计的引物进行
评估排除引物之间的干扰，引物设计完成由上海生
工合成（表 1）。
表 1 PCR 引物序列及产物长度
名称 引物序列（5-3） Tm 值 /℃ 扩增片段 /bp
bar 基因
Bar-F ：CAGAAACCCACGTCATGCCAGTTCC 65.3 453
Bar-R ：CATCGTCAACCACTACATCGAGACAAGC 64.9
KP4 基因
KP4-F ：TCGCCGGCCTGTGCTTCCTGTT 65.7 256
KP4-R ：GGCCCCTGGACACGTCGTTGC 67.8
CryIAc 基因
CryIA-F ：GGACAACAACCCAAACATCA 59.7
CryIA-R ：CAGCCTCGAGTGTTGCAGTA 58.6 308
CryIAc-2A-gna 融合基因
BG-F ：CCTCGTTAGACTCAACAGCA
BG-R ：GCTTTATCTTTCCAGCAGTAG 57.8
56.1
856
Shactin 基因 Shactin-F ：TCACACTTTCTACAATGAGCT 54.1 764
Shactin-R ：GATATCCACATCACACTTCAT
1.2.2 转基因甘蔗 PCR 反应模板制备 取甘蔗幼嫩
叶片 0.5 cm2 左右剪碎，放入 1.5 mL 的 Eppendorf 管
中，加入 100 μL 0.25 mol/L 的 NaOH，将此离心管
插入沸水中煮 30 s，取出加入 100 μL 0.25 mol/L 的
HCl 和 50 μL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0） 再 将 该 管
放 入 沸 水 中 孵 育 2 min， 室 温 条 件 下 10 000 r/min
离 心 2 min， 取 上 清 2 μL 直 接 作 为 模 板 进 行 PCR
反应。
1.2.3 单 PCR 检 测 甘 蔗 转 基 因 成 分 以 转 KP4、
CryIAc-2A-gna 基因甘蔗的叶片浸出液为模板，分别
用表 1 中相应引物进行 PCR 反应。PCR 反应体系 ：
2×Taq MasterMix 10 μL， 上 下 游 引 物 各 1 μL（10
μmol/L），模板 2 μL，用 ddH2O 将终体积调整到 20
μL。KP4 和 bar 基因 PCR 扩增的退火温度为 60℃，
CryIAc 基 因 和 CryIAc-2A-gna 基 因 的 退 火 温 度 为
56℃，Shactin 基因退火温度为 52℃，所有基因的退
火时间均为 1 min，PCR 结束后取 10 μL PCR 扩增产
物进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 多重 PCR 检测甘蔗转基因成分 选取 6 株转
基因甘蔗作为实验材料，阴性对照为非转基因植株
ROC-22，ddH2O 作为空白对照，同时扩增 KP4 基
因和 bar 基因及 CryIAc-2A-gna 基因、CryIAc 基因和
bar 基因验证该方法在转基因甘蔗多重 PCR 检测上
面的可靠性及适用性。（1）KP4 基因、bar 基因扩增
体系 ：2×Taq MasterMix 10 μL，模板 2 μL，KP4 基
因和 bar 基因上、下游引物各 1 μL（10 μmol/L），用
ddH2O 将终体积调整到 20 μL。PCR 扩增的退火温度
为 60℃，时间 1 min，PCR 结束后取 10 μL PCR 扩增
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.360
产物进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。（2）CryIAc-
2A-gna 融合基因、CryIAc 基因、bar 基因扩增体系 ：
2×Taq MasterMix 10 μL， 模 板 2 μL，CryIAc-2A-gna
融合基因、CryIAc 基因及 bar 基因上下游引物各 1
μL（10 μmol/L），用 ddH2O 将终体积调整到 20 μL。
PCR 扩增的退火温度为 56℃，时间 1 min，PCR 结
束后取 10 μL PCR 扩增产物进行 1% 的琼脂糖凝胶
电泳检测。
1.2.5 碱处理叶片浸出液在不同温度下保存的 DNA
稳定性 将模板分别保存室温、4℃、-20℃的环境下，
分别于 7、15 和 30 d，进行单 PCR 扩增 CryIAc-2A-
gna 融合基因检测模板 DNA 的稳定性。
1.2.6 转基因甘蔗用量对 PCR 模板制备的影响 以
转 KP4 基因甘蔗幼嫩叶作为材料，嫩叶用量设置
0.25、0.5、1、1.5、2 和 2.5 cm2 6 个处理，用碱处理
法制备 PCR 模板，制备方法同 1.2.2，比较 PCR 扩
增效果。
1.2.7 转基因甘蔗不同生长状态对 PCR 模板制备的
影响 分别选取转 KP4 基因甘蔗生长初期幼嫩叶、
生长中期绿色叶、生长中后期泛黄叶及生长后期枯
黄老叶作为实验材料，用碱处理法制备 PCR 模板，
制备方法同 1.2.2，比较 PCR 扩增效果。
2 结果
2.1 单PCR检测甘蔗转基因成分
如图 1 所示，以碱处理的叶片浸出液为模板，
不同基因引物进行单 PCR 反应扩增甘蔗转基因成分
及内源基因，均能扩增出与目的基因预期大小相符
的基因片段。
2.2 多重PCR反应检测甘蔗转基因成分
如 图 2-A 所 示， 以 CTAB 法 提 取 的 模 板 为 阳
性对照，6 株转 KP4 基因植株碱处理的叶片浸出液
为模板，同时加入 KP4 基因及 bar 基因引物，均能
扩增出与阳性对照大小相同的基因片段。如图 2-B
所示，以转 CryIAc-2A-gna 基因植株碱处理的叶片
浸出液为模板，同时加入 CryIAc 基因、bar 基因及
CryIAc-2A-gna 基因引物，均扩增出了与阳性对照大
小相同的基因片段。
2000
1000
750
500
200
100
bp
M 1 2 3 4 5 6
M：DL2000 DNA Maker；1：KP4 基因；2：bar 基因；3：CryIAc-2A-gna 融合基因；
4 ：CryIAc 基因 ；5 ：甘蔗内源基因 Shactin 基因 ；6 ：ddH2O
图 1 单 PCR 检测甘蔗转基因成分电泳结果
2000
1000
750
500
200
100
bp
MA
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9
2000
1000
750
500
200
100
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
M ：DL2000 DNA Maker ；1 ：CTAB 法阳性对照 ；2 ：非转基因 ROC-22 ；3 ：
空白对照 H2O ；4-9 ：转基因甘蔗，A ：转 KP4 基因甘蔗多重 PCR ；B ：转
CryIAc-2A-gna 基因甘蔗多重 PCR
图 2 多重 PCR 反应检测甘蔗转基因成分电泳结果
2.3 碱处理叶片浸出液在不同温度下保存对实验
结果的影响
碱处理的叶片浸出液分别保存于常温、4℃、
-20℃条件下，3 种条件下保存 7 d 的模板均能扩增
出目的基因片段且扩增结果无显著差异（图 3-A）；
室温保存 15 d 的模板有部分扩增产生了杂带，未能
扩增出目的基因片段，而 4℃、-20℃保存的模板均
能扩增出特异的目的基因片段（图 3-B）；室温保存
30 d 的模板均扩增出非特异条带，未能扩增目的基
因片段，4℃、-20℃保存的模板仍可扩增出特异的
2016,32(3) 61崔学强等：一种简易的甘蔗叶组织 PCR模板制备方法
目的基因片段（图 3-C）。
2.4 转基因甘蔗不同生长状态及不同用量对实验
结果的影响
如图 4 所示，对样品不同生长状态下的叶片制
备的模板进行 KP4 基因及 bar 基因的扩增结果表明，
幼嫩叶扩增条带最亮，随着叶片的老化，扩增条带
渐暗，叶片成枯黄时虽能扩增条带，但条带已很模糊。
对不同样品用量制备的模板进行 KP4 基因（图 4-A）
及 bar 基因（图 4-B）的扩增结果表明 ：取 0.25 cm2
左右的嫩叶剪碎制取的模板扩增条带较不清晰，叶
面积在 0.50-2.5 cm2 之间制备的模板扩增结果无显著
差异。
3 讨论
本研究的出发点是为大批量的转基因甘蔗建立
一种简便、快捷的检测方法，为甘蔗分子育种工作
奠定基础。运用本实验的方法仅需要取幼嫩叶片微
量的叶尖即可进行上百次的 PCR 反应，同时碱处理
法制备 PCR 模板仅需加热和中和两个过程，区别
于传统的 CTAB 法和 SDS 法，可以省去低温研磨、
DNA 抽提等繁琐步骤，虽然此方法制备的模板可能
含有蛋白质、盐类等杂质，但通过实验对单基因和
多基因扩增实验反复验证，证明其在转基因检测中
的可靠性。该方法在转基因水稻［9，10］、小麦［11］检
测中已有相关文献报道，并在检测中得到了实际运
用。针对甘蔗快速制备 PCR 模板的方法之前已有文
献报道，如陈忠良等［12］用于甘蔗 SSR-PCR 模板制
备采用的改良 SDS 法、DNA 快速提取法；陈平华等［13］
快速制备大批量甘蔗模板的碱裂解叶片法等。陈忠
良等采用的改良 SDS 法在传统 SDS 法基础上进行了
操作步骤的简化，DNA 快速提取法则是直接用提取
液来处理甘蔗叶片，之后在处理液中加入蛋白酶 K
2000
1000
750
500
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11A
B
C
2000
1000
750
500
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
2000
1000
750
500
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M ：DL2000 DNA Maker ；1 ：鲜叶片 ；2 ：H2O ；3-5 ：常温 ；6-8 ：4℃ ；
9-11 ：-20℃
图 3 模板 DNA 在不同温度下保存 7 d（A）、15 d（B）和
30 d（C）的 PCR 扩增电泳图
A
2000
1000
750
500
200
100
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
B
2000
1000
750
500
200
100
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A ：KP4 基因扩增 ；B ：bar 基因扩增。M ：DL 2000 DNA Maker ；1 ：嫩叶 ；2 ：
绿叶 ；3 ：泛黄叶 ；4 ：枯黄叶 ；5 ：0.25 cm2 嫩叶 ；6 ：0.50 cm2 嫩叶 ；7 ：1
cm2 嫩叶 ；8 ：1.5 cm2 嫩叶 ；9 ：2.0 cm2 嫩叶 ；10 ：2.5 cm2 嫩叶
图 4 样品不同生长状态及不同用量所制取模板的 PCR 扩
增图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.362
进行水浴和冰浴处理，离心取上清并加入 RNaseA，
最后即可制取模板。这两种方法与本实验的碱裂解
法相比操作步骤相对繁琐，成本较高，但其具有制
取的模板所含杂质较少的优点。陈平华等［13］采用
的碱裂解叶片法与本实验的方法有许多相似之处，
但是采用的裂解液与中和液有明显区别，其所用裂
解液为 KOH 与 Tween-20 的混合液，中和液为 Tris-
HCl 与 EDTA 的 混 合 液， 而 本 实 验 采 用 的 裂 解 液
NaOH 溶液，中和液为 HCl 和 Tris-HCl。陈平华等的
方法与本实验方法相比所用试剂较多，成本较高但
与本实验扩增效果无明显差别。
实验在样品不同生长状态下制备模板扩增结果
表明，幼嫩叶较宜制备模板。其原因可能是幼嫩叶
所含 DNA 量大，加热处理细胞易破裂，而随着叶片
的衰老，其体内的 DNA 出现了一定程度的降解，同
时 DNA 从细胞中释放的难度也有所加大。对样品用
量研究表明，0.5 cm2 左右嫩叶就能满足实验的要求，
且随着样品用量的增加模板扩增结果并无显著变化。
其原因可能是在提取试剂一定的情况下，样品量的
加大并不能使制取的模板量增大。对模板稳定性的
研究结果表明，如果模板放置于室温条件下稳定性
较差，其主要原因可能是室温条件，利于菌类生长，
导致模板的降解。4℃、-20℃的条件较常温不利于
菌的生长，同时较低的温度更有利于稳定模板 DNA
的结构，一般能保存较长时间。本实验对条件的摸
索确定将为后期的研究工作奠定基础，提供参考。
4 结论
以转基因甘蔗叶片为材料，0.5 cm2 左右嫩片经
碱并短暂高温处理，再中和，形成裂解混合物。直
接以此为模板，转基因甘蔗外源基因及内源基因基
因扩增结果稳定、准确、重复性强。用此方法制备
的模板室温下 2 周之内，4℃、-20℃下一个月之内
结果不变。本方法制备的甘蔗叶组织模板可用于后
续转基因甘蔗检测。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）