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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):187-192
收稿日期：2015-05-22
基金项目：国家科技重大专项（2012ZX10002006-002-003），上海市科委科学基金项目（13431900602）
作者简介：龙玲，女，硕士研究生，研究方向：生物工程；E-mail ：13210700143@fudan.edu.cn
通讯作者：朱乃硕，男，教授，研究方向：微生物感染与分子免疫；E-mail ：nzhu@fudan.edu.cn
应用比色法检测枯草芽孢杆菌变异菌株中 1- 脱氧
野尻霉素含量
龙玲  杨艳  朱乃硕
（复旦大学生命科学学院  遗传工程国家重点实验室  微生物与分子免疫学研究室，上海  200438）
摘 要 ： 为寻找测定枯草芽孢杆菌黑色变种突变株 Bacillus subtilis var. niger-231（B-231）的发酵液中 1- 脱氧野尻霉素
（1-Deoxynojirimycin，DNJ）的新方法并提高其产发酵液中 DNJ 的含量。在有铜离子的存在下，DNJ 与二硫化碳反应，用有机溶剂
对产物萃取后在 440 nm进行光度测定，得到DNJ含量。再采用紫外诱变方法处理突变株 B-231。绘制了检测DNJ标准品的标准曲线，
对测定 DNJ 的新方法做了精密度、灵敏度、准确度以及产物的稳定性的探讨，设计正交试验优化了反应条件，并将此方法运用
到细菌发酵液中 DNJ 含量的测定中，通过遗传诱变手段处理原始细菌 B-231，最终筛选到一株高产 DNJ 的菌株，命名为 B. subtilis
var. niger- 431（B-431），DNJ 含量达 87.3 mg/L，其产生 DNJ 的量较原始菌株原突变株提高了 4.2 倍。首次提出了一种快速测定细
菌发酵液中的 1- 脱氧野尻霉素的新方法，紫外诱变手段使细菌产生 DNJ 的能力有较大提高。
关键词 ： 枯草芽孢杆菌 ；1- 脱氧野尻霉素 ；α-糖苷酶抑制剂 ；紫外诱变
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.027
Colorimetric Method in the Determination of 1-Deoxynojirimycin
Isolated from the Mutant Strain of Bacillus subtilis
LONG Ling  YANG Yan  ZHU Nai-shuo
（Laboratory of Microbiology and Molecular Immunology，State Key Laboratory of Genetic Engineering，School of Life Sciences，Fudan
University，Shanghai 200438）
Abstract:  This work is to seek a novel method to detect 1-Deoxynojirimycin（DNJ）in the culture broth of Bacillus subtilis var. niger-231
（B-231）and to  improve DNJ production. DNJ reacts rapidly with carbon disulfide while Cu2+ existing，and the final product extracted by 
organic solvent was measured by spectrophotometer at 440 nm，thus DNJ content was determined. Then mutant strain B-231 was induced with 
ultraviolet. The standard curve for measuring standard DNJ was drawn，and the precision，sensitivity，accuracy and stability of the products 
while using the novel method of measuring DNJ were studied. Orthogonal test was designed to obtain the optimal reaction condition. The novel 
method was applied to measure the content of DNJ in the culture broth of bacteria. A high-yield DNJ strain was screened and named as B. subtilis
var. niger- 431（B-431）by mutagenizing the B-231. The content of DNJ by B-431 was up to 87.3 mg/mL，and increased 4.2 times compared to 
B-231. This study established a novel method to determine 1-deoxynojirimycin in the culture broth of DNJ-producing strain for the first time. The 
induction by ultraviolet increased the capacity of this bacterium producing DNJ. 
Key words:  Bacillus subtilis ；1-deoxynojirimycin ；α-glucosidase inhibitor ；ultraviolet mutation
1- 脱氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin，DNJ）通
过抑制 α-糖苷酶活力和小肠刷状缘对葡萄糖的吸收
来改善糖尿病状况［1，2］。进而改善餐后高血糖和胰
岛素敏感［2］。DNJ 是一种小分子生物碱，其结构和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6188
葡萄糖十分相似，是葡萄糖分子六元环上面的氧原
子被氮原子取代，且 1 号碳原子连接的氧原子被脱
去而成。从桑树的根部和叶子提取到［3］，一些芽
孢杆菌和链霉菌也可以产生 DNJ［2，4，5］，Kim 等［6］
2011 年报道从 Chungkookjang（快速发酵豆酱，韩
国的一种传统食品）分离出产强的 α-糖苷酶抑制剂
菌株 B. subtilis B2，后者的结构分析表明，它和在植
物中提取到的 DNJ 结构一样［7，8］。由于 DNJ 的抑制
糖苷酶活力的作用，其在治疗糖尿病［9］，同时在艾
滋病感染［10］和心血管疾病［11］方面有潜在作用和应
用前景。然而，受其来源限制，桑叶中 DNJ 含量低
且提取工艺复杂，而化学合成方法不很成熟且无法
大规模生产［12］，因此，应用微生物发酵来生产 DNJ
就显得更加经济有效。
如前所述，一些芽孢杆菌和链霉菌可以产生
DNJ。然而这些细菌是从石油中分离到的，要想把
它们应用到食品工业十分困难。Zhu 等［13］报道了
首次从发酵食品即豆渣分离到的枯草芽孢杆菌 B.
subtilis B2 可以产生 DNJ。用 B. subtilis B2 发酵的豆
渣可能被用来生产食物来源的 DNJ 产品，可作为功
能食品供糖尿病患者食用。然而，在冻干的发酵培
养基中 DNJ 的含量仅为 0.7 mg/g，和桑叶中的 DNJ
含量相当［14］。
目前，DNJ 的检测方法有对硝基苯 -β-D-吡喃半
乳糖苷法（PNPG）、反向高效液相色谱法（RP-HPLC）
等。本实验室应用了一种新的方法，在有铜离子存
在下，仲胺与二硫化碳反应，生成有颜色的二烷基
二硫代氨基酸铜［15，16］。DNJ 与二硫化碳的反应式 
如下：
S
2C6H12O4NH + CS2 + Cu
2+ C6H12O4N C 2 Cu + 2H+
S
生产的黄色铜络合物可用有机溶剂萃取后，进
行光度测定。
紫外线诱变用于微生物育种的诱变处理有着悠
久的历史［17］。因此本研究采用简单的紫外线诱变手
段来选育产 DNJ 的高产菌株。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  仪器  压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限
公司医疗设备厂），超净台（苏州净化设备有限公
司），细菌培养箱（上海博彩生物科技有限公司），
摇床（上海博彩生物科技有限公司），低温冷冻离心
浓缩仪（上海和杰科技有限公司），通风橱（Hamilton 
Scientific），荧光多功能酶标仪 Spectrum M5（Molecular 
Devices）。
1.1.2  实验材料  1- 脱氧野尻霉素（上海世峰生物
科技有限公司），二硫化碳、无水乙醇、吡啶、七
水硫酸铜（试剂均为分析纯），LB 培养基（Sigma）。
Bacillus subtilis var. niger-231（以下简称 B-231）为本
室筛选并保藏的产 DNJ 突变株［18］。
1.2  方法
1.2.1  DNJ 标准品的测定方法  用移液器吸取试液
100 μL 至 1.5 mL EP 管中，加入二硫化碳 200 μL，
无水乙醇200 μL，吡啶20 μL和对应量的硫酸铜溶液，
充分振荡后静置分层，取上层有色液于另一干净的
1.5 mL EP 管中，吸取 100 μL 至 96 孔板中，每份试
样做 3个重复，在 440 nm 波长下测定吸光度。取去
离子水 100 μL 至 1.5 mL EP 管中，按上述操作设定
空白对照。
1.2.2  测定 DNJ 标准品的最佳条件探索  实验试剂
的种类、用量对检测结果都会对实验结果产生诸多
影响，因此本实验选择了不同的醇类（乙醇、异丙
醇、异戊醇）和不同用量、不同的 CuSO4 浓度、吡
啶不同加入量，以检测这些条件对反应结果的影响。
为减少实验次数及确定各因子对实验的影响程度我
们设计了正交试验，按照四因素三水平设计实验 
（表 1）。
表 1 正交试验 L9（3
4）正交表头
水平 因子
醇类 醇加入量 /μL CuSO4 浓度 / 
（mol·L-1）
吡啶加入量 /μL
1 乙醇 100 0.01 10
2 异丙醇 200 0.03 20
3 异戊醇 300 0.05 30
1.2.3  紫外诱变方法处理  挑取在 LB 固体培养基
上培养 2 d 的单克隆 B-231 接种到盛有 50 mL 液体
LB 培养基的 250 mL 的三角烧瓶中，37℃、150 r/min
培养 60 h，在 6 500 r/min 4℃下离心 3 min，弃上清，
2016,32(6) 189龙玲等：应用比色法检测枯草芽孢杆菌变异菌株中 1- 脱氧野尻霉素含量
沉淀用 0.9% 生理盐水洗涤 3次，最后用生理盐水制
成约 106 CFU/mL 的菌悬液原液。将原液用生理盐水
按 10-6、10-5 和 10-4 三个稀释度稀释，每个稀释度
取 5 mL 菌悬液于直径为 9 cm 培养皿中，置 15 W 紫
外灯 30 cm 处分别照射 1 min、2 min、3 min、5 min、
8 min。设未经紫外照射的菌液为对照组，各取 0.1 
mL 菌液均匀涂布在 LB平板上。
1.2.4  细菌发酵及发酵液的预处理  将 LB平板上经
过紫外诱变处理和对照组生长良好的单菌落用接种
环转接至含有 100 mL LB 液体培养基的三角烧瓶中，
在 30℃，150 r/min 条件下培养 60 h。取细菌发酵液
1 mL，10 000 r/min 离心 3 min，保留上清液。取上
清 800 μL 至 1.5 mL EP 管中，用低温冷冻离心浓缩
仪浓缩冻干，5 h 后加 200 μL 去离子水溶解制备成
细菌发酵浓缩液，备用。
1.2.5  突变 DNJ 高产菌株筛选  用移液器吸取浓缩
菌液 100 μL 至 1.5 mL EP 管中，按 1.2.1 方法，每份
试样做 3 个重复，测定细菌发酵浓缩液中 DNJ 的含
量。同时设定 LB 液体培养基为空白对照。筛选出
DNJ 高产突变菌株。
2 结果
2.1  标准曲线绘制
取 5 mg/mL 1- 脱氧野尻霉素 1 mL，以去离子水
稀释成 0.0625 mg/mL，0.125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 
mg/mL，1.0 mg/mL 的 1- 脱氧野尻霉素溶液，制作
标准曲线。结果（图 1）显示，在一定范围内，DNJ
浓度与 OD 值之间呈较好的线性关系，符合直线回
归方程：y = 1.2254x + 0.22，R2 = 0.9961。
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
O
D
v
al
ue
0 0.2 0.4 0.6
concentration/mg·mL-1y=1.2254x+0.22R2=0.99610.8 1.0 1.2
图 1 DNJ 标准曲线
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
400 430 460 490 520 550
Wavelength/nm
II
_r
n1
580 610 640 670 700
图 2 平行测定 DNJ 溶液在 440 nm 处吸收峰
2.2  精密度
取 0.16 mg/mL 1- 脱氧野尻霉素溶液平行测定 5
次，结果如图 2 所示，DNJ 溶液在 440 nm 处有强
的吸收峰，对应的吸光度 OD 值分别为：0.459 6， 
0.486 1，0.475 2，0.475 1 和 0.430 7，5 次测定 DNJ
溶液吸光度的平均值为 0.345 5，计算出 5 次测定
的偏差分别是：-0.0057，0.020 8，0.009 9，0.009 8
和 -0.034 6。平均偏差 d =0.016 2。
2.3  灵敏度
对浓度为 0.031 2 mg/mL 和 0.015 6 mg/mL 的 1-
脱氧野尻霉素溶液进行同上测定，得到吸光度分别
为 0.172 2 和 0.278 3。结果显示，本法检测 DNJ 标
准品含量的最低检测限为 0.015 6 mg/mL，灵敏度为
0.015 6 mg/mL。
2.4  回收实验（准确度）
取 0.125 mg/mL 的 1- 脱氧野尻霉素溶液 100 μL
三份，按 0.8，1.0，1.2 倍 DNJ 量加入 5 mg/mL 的 1-
脱氧野尻霉素 2.0 μL，2.5 μL，3.0 μL，每份做 3 个 
重复，共测定 9 次。测得回收率分别为 108.5%、
109.2% 和 109.8%。
2.5  稳定性
取浓度为 1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL 和
0.125 mg/mL，0.062 5 mg/mL 的 1- 脱氧野尻霉素溶
液按 1.2.1 的测定方法，在 90 min 内，波长 440 nm
处每隔 10 min 测一次吸光度值，结果见图 3。从上
往下曲线依次对应浓度为 1.0 mg/mL，0.5 mg/mL，0.25 
mg/mL，0.125 mg/mL，0.062 5 mg/mL，在 90 min 内，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6190
为 10-5 的平板在诱变 0 min、1 min、2 min、3 min、
5 min 及 8 min 后菌落数分别为 28、15、6、4、1 和 0；
菌悬液稀释度为 10-6 的平板在诱变 0 min、1 min、
2 min、3 min、5 min 和 8 min 后菌落数分别为 6、2、 
0、1、0 和 0。菌落数在 4 个及以上时，随机挑取 4
个单克隆液体发酵，菌落数小于 4 的则全部转接至
液体 LB发酵。
2.8  应用比色法测定细菌发酵液中的DNJ含量
在发酵 36 h、48 h 和 60 h 之后，测得菌株 B-231
发酵液中的 DNJ 产量分别为 17.6 μg/mL，20.4 μg/mL
和 33.8 μg/mL ；测得诱变菌株发酵液中 DNJ 含量，
发现其中有一株突变菌发酵液中 DNJ 含量特别高，
在发酵 36 h、48 h 和 60 h 其发酵液中 DNJ 含量分别
为 48.7 μg/mL，55.6 μg/mL 和 87.3 μg/mL，该菌株编
号为 B. subtilis var. niger- 431（以下简称 B-431）。结
果如表 3 所示。其余菌株诱变后其发酵液中 DNJ 含
量没有显著提高（数据未附上）。
表 3 诱变前后细菌发酵液中 DNJ 含量
发酵时间 
细菌发酵液中 DNJ 含量（μg·mL-1）
初始菌株 B-231 诱变菌株 B- 431
36 h 17.6 48.7
48 h 20.4 55.6
60 h 33.8 87.3
2.9  和RT-HPLC法测定细菌发酵液中DNJ含量的
比较
参照 Kim 等［19］柱前衍生化反向高效液相色谱
法，取细菌发酵液 20 μL 至 1.5 mL EP 管，加入 5 
mmol/L FMOC-Cl 40 μL，再加入 0.4 mol/L 硼酸钾缓
冲液（pH8.5）50 μL，充分混匀后 25℃反应 25 min，
加 入 890 μL 0.1% 乙 酸，0.22 μm 针 滤， 取 10 μL 
上 样， 测 得 B-431 发 酵 60 h 后 DNJ 含 量 为 73.2 
μg/mL。如图 4，FMOC-DNJ 的出峰时间为第 8.053-
8.073 min。
3 讨论
应用比色法测定 1- 脱氧野尻霉素标准品，结
果在一定浓度范围内取得良好线性关系，拟合优度
R2 = 0.996 1 ；5 次平行测定平均偏差为 0.878%，结
果显示出很好的重复性；加标回收实验所得回收率
0.798
0.665
0.532
0.399
0.266
0.133
0
0 540 1080 1620 2160 2700ᰦ䰤/sOD 3240 3780 4320 4860 5400
图 3 90 min 内 DNJ 溶液的吸光度变化
随着 DNJ 溶液浓度的提高，产物的 OD 值随时间变
化而降低得更快。
2.6  测定DNJ标准品的最佳条件
正交试验结果见表 2，根据正交试验原理，极
差越大，说明该因子对实验结果影响越大。因此本
次试验中，对实验影响大小：醇类 > CuSO4 浓度 > 
醇加入量 > 吡啶加入量；K 值越大，对应因子的水
平越好，因此本次实验最优水平也即本法最有反应
条件为：乙醇，200 μL，CuSO4 浓度 0.03 mol/L，吡
啶 20 μL。
表 2 正交试验结果
试验号 醇类
醇加入
量 /μL
CuSO4 浓度 / 
（mol·L-1）
吡啶 /μL OD 值
1 1 1 1 1 1.1694
2 1 2 2 2 1.92755
3 1 3 3 3 0.54745
4 2 1 2 3 1.39295
5 2 2 3 1 0.7547
6 2 3 1 2 0.58035
7 3 1 3 2 0.2508
8 3 2 1 3 0.14405
9 3 3 2 1 0.1045
k1 1.214800 0.937717 0.631267 0.676200
k2 0.909333 0.942100 1.141667 0.919567
k3 0.166450 0.410767 0.517650 0.694817
极差 R 1.048350 0.531330 0.624017 0.243367
2.7  紫外诱变结果
菌悬液稀释度为 10-4 的平板在诱变 0 min、
1 min、2 min、3 min、5 min 及 8 min 后平均菌落数
分别为 131、89、44、18，3 和 1 ；菌悬液稀释度
2016,32(6) 191龙玲等：应用比色法检测枯草芽孢杆菌变异菌株中 1- 脱氧野尻霉素含量
在 50% 以上，准确度良好；该方法检测下限达到
15.625 μg/mL DNJ 水溶液；稳定性实验表明，在半
个小时内完成对产物的检测，结果可行度比较高。
本法灵敏度、准确度高、操作简便快速，而 PNPG
法采用大鼠的肠黏膜 α-糖苷酶作为催化剂，利用
DNJ对 α-糖苷酶的抑制作用从而间接得出DNJ含量。
由于酶活性易受较多因素影响，如温度、pH、各种
离子浓度、抑制剂或活化剂、同源分子的干扰等，
此法对测定结果带来一定的误差，且重复性较差［19］。
RP-HPLC 法中的衍生化反应程度不易控制，硼酸钾
缓冲液的 pH 对衍生产物结果影响较大，衍生化产
物不稳定易降解［20］，并且检测需要高效液相色谱仪
器，检测成本高。本研究采用的比色法检测细菌发
酵液中 DNJ 的含量具有快速、灵敏的优点，与反向
高效液相色谱法相比较，本法所测的细菌发酵液中
DNJ 含量稍微偏高，这可能与细菌培养液中含有较
多的氨基酸有关，后者带来一定的系统误差。总体
来说两种方法测定结果比较接近，而在操作上 RT-
HPLC 更加繁琐且成本更高。因此本法更适于测定
细菌发酵液中 DNJ 含量。由于本方法尚属于初步建
立，在实际应用中可能存在各种干扰因素，目前仅
用于测定高纯度 DNJ 和细菌发酵液中 DNJ 含量，后
续工作中，我们正在实际应用于其他样品中以了解
其各种干扰因素和可行性，目前正在试图用该方法
测定桑树叶中的 DNJ 含量以证明该方法的普适性。
紫外线诱变育种的原理是，通过紫外线照射使
DNA双链之间或同一条链上的两个相邻的胸腺嘧啶
形成二聚体，并阻碍双链的分开、复制和碱基的正
常配对，从而引起基因突变，最终导致微生物表形
变化，紫外诱变是一种最常用的物理诱变因素，它
经常被用于微生物育种。 因此本文采用紫外诱变
来选育产 DNJ 高产菌株。通过紫外光照射处理细菌
B-231，最终筛选到一株高产 DNJ 的菌株，命名为
B-431，其产生 DNJ 的量较原始菌株 B-231 提高了 4.2
倍，DNJ 含量达 87.3 mg/L，比 Zhu 等［13］31 mg/L 的
DNJ 含量也有了很大提高。最佳发酵时间为 60 h，
这与 Zhu 等［21］的最佳发酵时间 66 h 结论较为一致。
4 结论
本实验应用比色法测定 1- 脱氧野尻霉素标准
品，结果在一定浓度范围内取得良好线性关系，采
用遗传诱变手段来处理枯草芽孢杆菌，使其 DNJ 产
量达 87.3 mg/L，较原始菌株原突变株提高了 4.2 倍。
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100
50
0
-50
0 5 10 20 25
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15
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（责任编辑  李楠）