全 文 ：华北农学报·2013，28 ( 4 ) : 208 -213
收稿日期:2013 － 05 － 12
基金项目:现代农业产业技术体系项目(CARS-28) ;山东省科技攻关计划项目(2010GNC10918) ;国家自然科学基金项目(31000891;
31272001) ;山东省“泰山学者”建设工程项目
作者简介:张淑颖(1980 －) ，女，山东文登人，在读博士，主要从事病虫害生物防治研究。
通讯作者:李保华(1961 －) ，男，山东潍坊人，教授，博士，主要从事植物病害流行学研究。
剑麻内生细菌 JM-3 对苹果腐烂病抑制作用的研究
张淑颖1，2，曲田丽3，孙 阳4，董向丽2，王彩霞2，李保华2，肖 春1
(1．云南农业大学 植保学院，云南 昆明 650201;2．青岛农业大学 农学与植保学院，山东 青岛 266109;
3．青岛农业大学 化学与药学院，山东 青岛 266109;4．青岛农业大学 生科院，山东 青岛 266109)
摘要:从剑麻叶片组织内分离获得 6 株内生细菌，其中 JM-3 菌株对离体苹果枝条上苹果腐烂病菌的扩展致病有
较好的抑制效果。JM-3 菌株在培养过程中能产生抑菌物质，其无菌发酵滤液能抑制腐烂病菌菌丝的生长和分生孢子
的萌发，导致菌丝和芽管膨大畸形，最终导致菌丝破裂、原生质外流。JM-3 菌株对多种果树和农作物病原真菌菌丝的
生长都有明显的抑制作用。经 16S rDNA序列分析和 RiboPrinter分析，鉴定菌株 JM-3 为枯草芽孢杆菌。
关键词:内生细菌;枯草芽孢杆菌;苹果腐烂病
中图分类号:S436． 6 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2013)04 － 0208 － 06
Inhibiting Effects of Endophytic Bacterial Strain JM-3 from
Agavesisalana Perrine against Valsa ceratosperma
ZHANG Shu-ying1，2，QU Tian-li3，SUN Yang4，DONG Xiang-li2，
WANG Cai-xia2，LI Bao-hua2，XIAO Chun1
(1． College of Plant Protection，Yunnan Agriculture University，Kunming 650201，China;2． College of
Agriculture and Plant Protection，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China;3． College of
Chemistry and Pharmaceutical Sciences，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China;
4． College of Life Sciences，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China)
Abstract:Six isolates of endophytic bacterial strains were isolated from healthy leaves of Agavesisalana Per-
rine，in which the strain JM-3 inhibited canker lesion expansion of Valsa ceratosperma on excised twigs significantly．
The cell-free fermentation liquid of JM-3 inhibited mycelium growth and conidial germination of Valsa ceratosperma．
The isolates produced anti-fungi substances，which caused malformation of mycelia and germtubes． The malformed
mycelium burst and protoplasm flow-out finally． JM-3 also showed clear inhibiting effect against mycelial growth of
pathogen from several fruit trees and crop． JM-3 was identified as Bacillus subtilis based on 16S rDNA sequencing
and RiboPrinter results．
Key words:Endophytic bacteria;Bacillus subtilis;Valsa ceratosperma
苹果腐烂病是世界各国苹果生产上的一种极为
重要的病害，近年来对苹果生产造成了巨大危害，已
成为苹果生产的严重障碍。它不仅危害苹果，也危
害海棠等苹果属植物。在我国，苹果腐烂病俗称烂
皮病、臭皮病、苹果癌症，病害流行区主要在东北、华
北、西北和山东等北方苹果产区，其他省份也有分
布。苹果腐烂病主要侵害苹果树的主干和主枝，导
致死枝、死树。
苹果腐烂病菌具有潜伏侵染的特点［1］，正常的
苹果树皮表面的死组织或细胞团中带有潜伏病菌，
其侵入易而扩展难，当寄主衰弱，失去抗性时，它便
从潜伏状态转变为活跃状态而表现出强烈的致病
性，严重时引起主干、大枝以及整树枯死，甚至造成
毁园。一旦发病，病原菌在表皮迅速蔓延，其菌丝已
深达木质部，现今使用的化学药剂均因难以渗透进
入木质部而有效控制病害［2］。内生菌是植物病害
生物防治的天然资源菌，对人畜无毒无害、不污染环
境，可进入植物体内部各组织存活，分泌活性物质有
4 期 张淑颖等: 剑麻内生细菌 JM-3 对苹果腐烂病抑制作用的研究 209
效抑制病原菌生长繁殖，是目前解决苹果腐烂病理
想的防治策略，具有重要的开发应用前景。
1 材料和方法
1． 1 拮抗菌株的分离与筛选
自青岛农业大学校园内采集健康剑麻叶片，清洗
晾干，用酒精和次氯酸彻底消毒表面，切取 5 mm ×
5 mm小块组织，接种于 NA 培养基上，28 ℃黑暗培
养48 ～ 72 h，挑取菌落，纯化后用于拮抗菌的筛选。
将从富士苹果腐烂病斑分离、纯化，并在青岛农
业大学流行学实验室保存的苹果腐烂病菌菌株活化
后，接种到 PDA平板的中央，在菌饼四周，与菌饼等
距离处接种从剑麻组织内分离获得的细菌菌株，每
皿 3 个接种点，以不接种细菌菌株的处理为对照，在
28 ℃黑暗条件下，将苹果腐烂病菌与细菌菌株对峙
培养，72 h后测量苹果腐烂病菌落边缘至细菌菌落
边缘空白带，即抑菌带的宽度。全部试验，在不同时
间重复 3 次。根据抑菌带的有无及宽度，筛选出对
苹果腐烂病菌有拮抗作用的细菌菌株，用于苹果枝
条上的抑菌试验。
将筛选出的对苹果腐烂病菌有拮抗作用的细菌
菌株在 NB 中进行液体培养，获得菌株的发酵液。
选取直径约 1 cm生长健壮的苹果树健康枝条，截成
30 cm 长的枝段，用自来水冲洗和 75%酒精进行表
面消毒后，用直径 5 mm打孔器打除枝条表皮，每个
枝条分上、中、下，用打孔器打 3 个伤口，滴入 60 μL
细菌菌株发酵菌液。6 h 后在滴加发酵液的圆孔
处，接种苹果腐烂病菌的菌饼，用塑料膜包扎。然
后，置于 25 ℃恒温箱中保湿培养，10 d 后解除包扎
膜，检查记录接种伤口是否发病，并测量病斑长度。
全部试验在不同时间重复 3 次［3 － 4］。
1． 2 JM-3 菌株对苹果腐烂病菌的抑菌效果
发酵滤液对苹果腐烂病菌菌丝生长的抑制效
果:将 JM-3 菌株接种到 NB 液体培养基中，在 30 ℃
培养箱中，以 170 r /min 振荡培养 72 h。取发酵上
清液经 0． 2 μm 微孔滤膜过滤，即获得无菌发酵滤
液。在 48 ℃下，将无菌发酵滤液混入灭菌 PDA 培
养基中，混合均匀后倒平板。平板中央接种苹果腐
烂病菌菌饼，27 ℃培养 48 h后测量菌落直径。PDA
培养基中，无菌滤液的最终稀释倍数分别为 20，
100，200，1 000 倍，以加灭菌蒸馏水的处理为对照。
本试验在不同时间重复 3 次。
发酵滤液对苹果腐烂病菌分生孢子萌发的抑制
效果:将 JM-3 的无菌发酵滤液混入灭菌 PD 液体培
养液中，获得稀释 2，5，10，50 倍的发酵滤液。在滤
液中加入在大麦培养的苹果腐烂病菌的新鲜分生孢
子，使孢子浓度达 1 ×106个 /mL。28 ℃下培养 24 h，
显微镜下检查统计各处理中腐烂病菌分生孢子的萌
发率，以 PD培养基中孢子萌发率为对照，计算 JM-3
发酵滤液对苹果腐烂病菌分生孢子萌发的抑制率。
全部试验重复 3 次。
分生孢子萌发抑制率 =(对照萌发率 －处理萌
发率)/对照萌发率 × 100%
JM-3 对苹果离体枝条腐烂病菌扩展的影响:选
取直径约 1 cm、长度 30 cm 的苹果树健康枝条，表
面消毒后，用直径 5 mm打孔器打除枝条表皮，每个
枝条等距离 3 个打孔部位，然后滴加 40 μL JM-3 的
无菌发酵滤液、过滤后的菌体悬浮液和发酵全液，以
苯醚甲环唑(4 μg /mL)为药剂对照，NB培养液为空
白对照［5］。伤口处理 24，48，72 h 后接种苹果腐烂
菌饼，用塑料膜包扎后置于 25 ℃恒温培养箱中培养
10 d后，解除包扎膜，观察接种点的发病情况，并测
量病斑扩展的最大长度。分析 JM-3 对苹果枝条上
腐烂病菌扩展的抑制效果。全部试验重复 3 次，每
次每处理 3 个枝条。
JM-3 菌株对其他植物病原真菌的抑菌效果:将
青岛农业大学植物病害流行学室保存的 12 种主要
果树和农作物的病原真菌活化后，接种于 PDA平板
中央。在病原菌接种点周围接种 JM-3 菌株，每皿共
接种 4 个点，离真菌接种点的距离相等。28 ℃下培
养 120 h，观察测量抑菌圈的宽度。全部试验在不同
时间重复 3 次，每次每种病原菌接种 2 皿。
1． 3 JM-3 菌株的抑菌机制
JM-3 菌株对峙培养 3，5 d 后，取腐烂病菌菌落
边缘的菌丝，以纯净水作负载剂在显微镜下观察菌
丝的形态变化，并照相。
取在不同浓度的 JM-3 无菌滤液中培养 24 h 的
苹果腐烂病菌分生孢子，制片在显微镜下观察孢子
的形态变化，并照相。
1． 4 JM-3 菌株的鉴定
形态观察:用划线法将 JM-3 的纯化菌株接在
NA平板培养基上，30 ℃下培养 1 d，观察菌落的形
态、颜色等特征。挑取菌体，涂布制片，革兰氏染色，
显微镜下观察菌体的形态特征［6］。
16S rDNA 测序:以 27f(5-AGAGTTTGATCCTG
GCTCAG-3)和 1492r(5-GGTTACCTTGTTACGACT
T-3)为 PCR 扩增引物，扩增全长的 16S rDNA 基
因。PCR反应体系(50 μL) :10 pmol 模板 DNA，引
物 27f 和 1492r 各 0． 2 μmol，1 μL dNTP ，5 μL Taq
反应缓冲液，0． 25 μL Taq 酶，加水至 50 μL 。PCR
210 华 北 农 学 报 28 卷
反应参数:预变性 98 ℃ 5 min;95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，
72 ℃ 90 s，35 个循环;72 ℃延伸 8 min。PCR 产物
电泳纯化，送生工生物工程(上海)有限公司测序，获
得 16S rDNA序列，通过 Blast在 GenBank上检索序列
相似性，将其序列与其高同源性(＞99%)的已知菌株
16S rDNA序列在 Mega 5． 0软件中进行分析。
基因指纹鉴定:基因指纹鉴定采用杜邦 Ribo-
Printer全自动微生物基因指纹鉴定系统完成。从
培养皿中挑取单菌落，在缓冲液中悬浮并加热灭活，
将之转移到仪器中自动检测［7 － 8］。
1． 5 数据分析
采用 SAS 9． 0 进行数据统计，用 Duncan氏新复
极差法进行差异显著性分析(P ＜ 0． 05)。
2 结果与分析
2． 1 拮抗菌株的分离与筛选效果
2009 年从剑麻叶片的组织内共分离获得 6 株
菌落形态特征不同的细菌菌株，通过平板对峙培养，
发现其中的 3 株对苹果腐烂病菌有明显的抑菌效
果，分别命名为 JM-1、JM-2 和 JM-3。3 个菌株与苹
果腐烂病菌对峙培养 72 h后，抑菌直径分别为 8． 1，
7． 9，7． 5 mm。将 3 个菌株的发酵液滴加到苹果枝
条上用打孔器打出的圆形伤口中，然后接种苹果腐
烂病菌，10 d 后苹果腐烂病斑的长度分别为 35． 2，
37． 5，4． 3 mm，与对照相比，JM-1、JM-2 和 JM-3 的抑
菌率分别为 8． 9%，2． 8%，88． 9%(表 1) ，其中 JM-3
的发酵液能显著的抑制苹果腐烂病菌在枝条上的生
长扩展(图 1)。本研究对 JM-3 的生防潜能作进一
步评价。
图 1 JM-1、JM-2 和 JM-3 对苹果枝条
上苹果腐烂病菌生长扩展的抑制效果
Fig． 1 Inhibiting effects of JM-1，JM-2 and JM-3 on
lesion expansion caused by V． ceratosperma on apple twigs
表 1 剑麻内生不同细菌菌株对苹果腐烂病菌的抑菌效果
Tab． 1 Inhibiting effects of different isolates of endophytic bacteria from
Agavesisalana Perrine against growth of V． ceratosperma
抑制指标
Inhibiting index
剑麻内生细菌对苹果腐烂病菌的抑制效果
Inhibiting effects
JM-1 JM-2 JM-3 JM-4 JM-5 JM-6
CK
PDA上抑菌圈直径 /mm
Diameter of inhibiting zone on PDA 8． 1 ± 0． 2 7． 9 ± 0． 1 7． 5 ± 0． 2 0 0 0 0
枝条上病斑扩展长度 /mm
Length of lesions on twigs 35． 2 ± 1． 4 37． 5 ± 1． 5 4． 3 ± 0． 6 － － － 38． 6 ± 2． 7
对病斑扩展的抑制率 /%
Inhititing ratio of lesion expansion 8． 9a 2． 8a 88． 9b － － － －
注:不同字母表示在 P ＜ 0． 05 水平差异显著。表 2 ～ 4 同。
Note:Different letters indicate significant difference at P ＜ 0． 05 level by Duncans multiple range test． The same as Tab． 2 － 4．
2． 2 JM-3 对苹果腐烂病菌抑菌效果
对菌丝生长的抑制效果:JM-3 发酵滤液对苹果
腐烂病菌的生长有明显的抑制效果，且随着稀释倍
数的增加，抑菌效果降低。在添加不同浓度 JM-3 发
酵滤液的培养基上，培养 48 h的苹果腐烂病菌的菌
落直径有显著的差异。在稀释 20，100，200 倍的发
酵滤液培养上，苹果腐烂病菌的菌落直径分别为
8. 3，22． 7，23． 3 cm，与对照有显著差异(P ＜ 0． 05) ;
在稀释1000倍的发酵滤液培养基上，苹果腐烂病菌
的菌落直径为 27． 0 cm，与对照无显著差异(表 2)。
结果表明，JM-3 的发酵滤液稀释 200 倍后仍对苹果
腐烂病菌的菌丝生长有明显的抑制效果。
表 2 不同浓度的 JM-3 发酵滤液对苹果腐烂病菌菌丝生长的抑制效果
Tab． 2 Inhibiting effects of cell-free fermentation liquid of JM-3 at different concentration
against mycelial growth of V． ceratosperma
抑制情况
Inhibition
不同稀释倍数的发酵滤液对腐烂病菌菌丝生长的抑制效果
Inhibiting effects
20 × 100 × 200 × 1000 ×
CK
菌落直径 /mm Diameter of Colonies 8． 3 ± 0． 3a 22． 7 ± 0． 3b 23． 3 ± 0． 3b 27． 0 ± 0． 6c 27． 7 ± 0． 3c
抑制率 /% Inhibiting ratio of growth 69． 9 18． 1 15． 7 2． 4 0
4 期 张淑颖等: 剑麻内生细菌 JM-3 对苹果腐烂病抑制作用的研究 211
对分生孢子萌发的抑制效果:JM-3 的发酵滤液
对苹果腐烂病菌分生孢子的萌发有明显的抑制作
用。在 5 倍稀释液中，苹果腐烂病菌分生孢子的萌
发率 23． 3%，发酵液对分生孢子萌发的抑制率为
65． 7%;当发酵滤液稀 10 倍后，对苹果腐烂病菌的
分生孢子的萌发仍有显著的抑制效果(表 3)。
表 3 不同浓度的 JM-3 发酵滤液对苹果腐烂病菌孢子萌发的抑制效果
Tab． 3 Inhibiting effects of cell-free fermentation liquid of JM-3 at different
concentration against conidial germination of V． ceratosperma
抑制情况
Inhibition
不同稀释倍数的发酵滤液对分生孢子萌发的抑制效果
Inhibiting effects
10 × 50 × 100 × 500 ×
CK
萌发率 /% Germination ratio of conidia 0 ± 0a 23． 3 ± 0． 9b 55． 3 ± 0． 9c 65． 3 ± 1． 9d 68． 0 ± 0． 6d
抑制率 /% Inhibiting ratio against germination 100 65． 7 18． 7 4． 0 －
对苹果枝条上病斑扩展的抑制作用:用 JM-3 的
发酵液、菌体悬浮液和发酵滤液处理苹果离体枝条
上的伤口后，24 h 接种苹果腐烂病菌菌饼。10 d 后
JM-3菌体悬浮液处理伤口上的病斑长度为 49． 4 mm，
与对照无显著差异，表明 JM-3 的菌体对苹果腐烂病
菌在枝条上的扩展没有明显的抑制效果。JM-3 发
酵液和发酵滤液处理伤口上的苹果腐烂病斑长度分
别为 16． 6，25． 7 mm，显著短于对照 47． 8 mm(P ＜
0. 05) ，与苯醚甲环唑处理的伤口没有显著差异，表
明 JM-3 发酵液和发酵滤液都对苹果腐烂病菌在苹
果枝条上的扩展有显著的抑制效果，但 JM-3 发酵液
和无菌发酵滤液之间无显著差异(表 4)。表明 JM-
3 的菌体本身对苹果腐烂病菌无拮抗作用，而其发
酵液，即菌体在生长发育过程中分泌到体外的物质
对苹果腐烂病菌有抑制作用。
表 4 JM-3 菌体悬浮液、发酵液和发酵滤液
对离体苹果枝条腐烂病菌扩展抑制作用
Tab． 4 Inhibiting effect of fermentation liquid，cell
suspension and cell-free fermentation liquid on lesion
expansion of V． ceratosperma on excised apple twigs
处理
Treatments
病斑长度 /mm
Means of
lesion lengths
发酵液 24 h Fermentation liquid of 24 h 16． 6 ± 0． 9ab
菌体悬浮液 24 h Cell suspension liquid of 24 h 49． 4 ± 2． 3d
发酵滤液 24 h Cell-free fermentation liquid of 24 h 25． 7 ± 2． 3ab
发酵液 48 h Fermentation liquid of 48 h 22． 3 ± 2． 1ab
菌体悬浮液 48 h Cell suspension liquid of 48 h 49． 1 ± 2． 7d
发酵滤液 48 h Cell-free fermentation liquid of 48 h 21． 1 ± 1． 7ab
发酵液 72 h Fermentation liquid of 72 h 25． 2 ± 1． 9ab
菌体悬浮液 72 h Cell suspension liquid of 72 h 44． 8 ± 2． 5cd
发酵滤液 72 h Cell － free fermentation liquid of 72 h 17． 6 ± 1． 6ab
苯醚甲环唑 Difenoconazole 13． 1 ± 1． 4a
无菌水 Sterile water 47． 8 ± 2． 4d
用 JM-3 菌体悬浮液、发酵液和发酵滤液处理离
体苹果枝条伤口后，48，72 h 接种苹果腐烂病菌形
成苹果腐烂病斑的长度与 24 h 后接种无显著差异
(表 4)。表明 JM-3 产生的抑菌物质在自然条件下
保存 72 h，其抑菌效果并没有降低。
对其他病原菌的拮抗作用:与其他病原真菌对
峙培养结果表明，JM-3 对苹果炭疽病、轮纹病等多
种果树、农作物的病原菌都有抑制效果(表 5) ，抑菌
谱广泛。
表 5 JM-3 菌株对部分植物病原菌菌丝生长的抑制作用
Tab． 5 Antagonistic activity of JM-3 against several
pathogenic mycelial growth
病原菌
Pathogens
抑菌圈半径 /mm
Radius of
inhibiting zone
苹果炭疽病 Glomerella cingulate 7． 1
苹果轮纹病 Botryosphaeria dothidea 7． 8
苹果霉心病 Alternaria alternate 12． 6
拟茎点霉菌 Phomopsis brevistylospora 7． 9
玉米纹枯 Rhizoctonia solani 7． 2
玉米弯孢 Curvularia lunata 11． 4
玉米圆斑 Bipolaris carbonum Wilson 8． 5
牡丹叶斑病 Cladosporium paeoniae 9． 8
棉花枯萎病 Fusarium oxysporum 8． 4
小麦赤霉病 Fusarium graminearum 9． 0
青霉病 Penicillium expansum 5． 5
左．对照;中．培养 3 d;右．培养 5 d
Left． Control;Middle． 3 days;Right． 5 days
图 2 在 JM-3 发酵滤液中培养不同时间的
苹果腐烂病菌菌丝形态
Fig． 2 The mycelial morphology of V． ceratosperma
cultured in cell-free fermentation liquid of JM-3 at
different concentration and different days
212 华 北 农 学 报 28 卷
2． 3 JM-3 抑菌机理的初步探讨
显微观察发现(图 2) :正常菌丝细长，分支少。
在发酵滤液中 3 d后，菌丝分支增多，膨大变粗或畸
形，未端膨大，或从菌丝侧壁突起，培养 5 d 后膨大
或突出部分破裂，原生质外露。菌丝顶端膨大、破
裂，预示抑菌物质影响菌丝细胞壁的生长和发育。
左．对照;中． 10 倍液;右． 5 倍液;箭头．未萌发的分生孢子。
Left． Control;Middle． 10 times dilution;Right． 5 times dilution;
Arrow． Conidial disgermination．
图 3 不同浓度 JM-3 发酵滤液对苹果
腐烂病菌分生孢子萌发的影响
Fig． 3 Inhibiting effects of cell-free fermentation liquid
of JM-3 at different concentration against conidial
germination of V． ceratosperma
JM-3 发酵滤液的 10 倍稀液中，培养 24 h 的苹
果腐烂病菌分生孢子芽管长度只有正常萌发孢子的
1 /3 ～ 1 /2，而且有少量孢子端部膨大。在 5 倍稀液
中，腐烂病菌的分生孢子只是膨大，不产生芽管或产
生很短的芽管。在 2 倍稀液中，没有发现膨大的分
生孢子。在不加 JM-3 发酵滤液的培养液中，苹果腐
烂病菌分生孢子萌发时，体积先膨大，体积是原孢子
的几十倍，然后再萌发产生芽管。苹果腐烂病菌分
生孢子的芽管很长，培养 96 h 后，芽管的长度是孢
子长度 20 ～ 30 倍。在 50 倍稀液中，苹果腐烂病菌
孢子的萌发基本上看不出异常变化(图 3)。
2． 4 JM-3 的鉴定
JM-3 菌株的菌体杆状，周生鞭毛，革兰氏染色
呈阳性，产芽孢，好氧或兼性厌氧。在平板上菌落灰
白色，圆形或近圆形，边缘不整齐，凸起，表面干燥，
不透明(图 4)。
图 4 JM-3 在 NA培养基上的菌落形态
Fig． 4 The growth of strain JM-3 in NA medium
对 JM-3 16S rDNA 序列测定结果发现，JM-3 菌
株与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)同源性均达到 99%
以上。
经 RiboPrinter鉴定，所测试 JM-3 菌株的 4 个样
品都为枯草芽孢杆菌(图 5)。根据 16S rDNA 测序
结果和 RiboPrinter鉴定结果，结合形态学、生理生化
特性，将 JM-3 菌株鉴定为枯草芽孢杆菌，学名为
Bacillus subtilis。
图 5 RiboPrinter基因指纹鉴定结果
Fig． 5 Results of gene finger mark in RiboPrinter
3 结论与讨论
剑麻生性强健，耐寒、耐旱、耐湿、耐瘠薄，抗病
虫。本研究从剑麻叶片组织内分离获得 6 株内生细
菌，其中 1 个菌株命名为 JM-3，对离体苹果枝条上
苹果腐烂病菌的扩展致病有较好的抑制效果。JM-3
菌株在培养过程中能产生抑菌物质，其无菌发酵滤
液能抑制苹果腐烂病菌菌丝的生长和分生孢子的萌
发，导致菌丝和芽管膨大畸形，最终导致菌丝破裂、
原生质外流。JM-3 菌株对多种果树和农作物病原
真菌菌丝的生长都有明显的抑制作用。
目前，细菌鉴定常采用 16S rDNA 序列分析，当
序列同源性大于 97%时，可以认定 2 株细菌属于同
一个属，通过后续的生理生化分析可以进一步鉴定
至种。但 16S rDNA基因测序技术在菌株层面上的
分辨率较低。RiboPrinter 系统通过检测 16S rDNA、
23S rDNA、5S rDNA 和间隔序列杂交信号而得出基
因指纹特征，与数据库比对得出鉴定结果。Ribo-
4 期 张淑颖等: 剑麻内生细菌 JM-3 对苹果腐烂病抑制作用的研究 213
Printer数据库目前涵盖 6950 种菌种的杂交图谱，数
据库较为全面，对常见细菌的检测非常准确［9］。枯
草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌的 16S rDNA 同源性
序列达到 99%以上，难以将两者区分。RiboPrinter
可以明确区分 B． amyloliquefaciens 与 B． subtilis 菌
株［10 － 11］。本研究虽测定了 JM-3 的 16S rDNA序列，
仍难以确定其属于哪个种，经 RiboPrinter 鉴定，将
JM-3 菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌是自然界广泛存在的、对人畜无
毒无害、不污染环境、对农业生态系统安全、能分泌
多种抗菌素和酶，对许多植物病原生物具有拮抗作
用的非病原微生物，符合现代社会对农业生产及有
害生物综合防治的要求和农业的可持续发展战略目
标［12 － 16］。国内外许多利用枯草芽孢杆菌开发的生
物农药已投入市场。美国迄今有 4 株枯草芽孢杆菌
生防菌株获得商业生产许可，分别是 GB03、
MB1600、QST713、FZB24。我国利用枯草芽孢杆菌
防治植物病害应用的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰
宁、纹曲宁等。
内生菌防病机制有拮抗作用、与病菌竞争生态
位和营养物质、寄生作用、促进寄主植物生长、提高
寄主植物的抗逆能力、诱导植物产生抗性等［17 － 18］。
通过以上试验，初步断定:枯草芽孢杆菌在测试 10 d
内对苹果腐烂病的作用机制是分泌拮抗物质抑制离
体枝条腐烂病斑扩展，其作用效果与农药苯醚甲环
唑(4 μg /mL)没有显著差异。芽孢杆菌产生的抗菌
物质可以分为两大类，一类是由非核糖体合成的
iturin、surfactin、fengycin等，另一类是由核糖体合成
的抗菌蛋白。JM-3 无菌发酵滤液经硫酸铵沉淀的
蛋白有良好的抑菌效果(已测) ，判定 JM-3 能产生
抗菌蛋白抑制病原菌生长。如果 JM-3 可在苹果树
内生定殖，可将其直接喷洒或浇灌 JM-3 预防苹果腐
烂病，如若不能内生定殖，则可将其产生的抗菌蛋白
涂抹腐烂病斑以抑制其扩展。但该拮抗蛋白成分鉴
定、能否在苹果树内生定殖及田间防护效果有待于
进一步评估。
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