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{；o；j霉；二孽i÷蓦}：#警；尊舅i刍；§$二一g§；为
有双子叶植物中⋯根部合成的次级代谫}物大多数都
可以用毛状根来生产，为利用发根培养技术牛产药用重
要植物次级代谢物曲物及食品天然色素、香精香料开
辟了新的途径吐天花粉蛋白质(宇iichos§§th
{n，Tcs)由多年生葫芦科植物藤本栝楼(开拓^∞∞mo^
n·iiiw“)块根中分离纯化制成”J，近年来研究发现，天
花粉蛋白能抑制绒毛膜上皮癌细胞的生长及调节免疫反
应和抗肿瘤活性”J，尤其是天花粉蛋白GLQ22
3能够选择性地抑制艾滋病(AIDs)病毒HIV在感染
的免疫系统细胞内的复制，减低免疫细胞中受病毒感染的
活细胞数；kJ．。本文以广泛分布于华南地区的大苞栝楼
(乃ji厅础棚砌甜6，酣r鲫衄vb碴t)阳。
为外植体，研究了以发根农杆菌R1601和R1＆＆0为诱导菌株
，在不同培养条件下的进行大苞栝楼(开i曲o∞”曲∞6
Mc把口m雾≥i斟)发根的诱导，建立了发根培养体系，为
万方数据
!!! 兰查盟兰一一——————————————————三!童
毒lomin)，无菌水漂洗，然后在湿润的脱脂棉f．．
用70％的乙醇浸泡lmin，再用01％的Hgcl2表而消
黑暗萌发2d(25℃)后，每天12h，光照1900¨w”～，
同样温度下晌发获得无菌苗。待其长到7～8cm时，
将了叶切成1cm×lcm的小片，茎切成1cm的小段，
在无激素的MsPl培养基上预培养2d。
1．2 发根农杆菌的活化 菌株R1000和R1601在含
有AB固体培养基(R16叭需加R耶霉素)的试管斜
面上活化24h(25℃，暗培养)，之后将其用新鲜的
YEB培养基(每升水r{·JJu：蛋白胨5g，酵母浸膏1g，
牛肉浸膏5g，Mgs04·7H200．493g，调节pH到7．0)
稀释成蔚悬液后，转入100mL含有YEB液休培养摹
三角瓶中振荡培养(25℃，110r·min～，暗培养)
24h。然后将菌液离心(4000rpm，5min，室温)，
最后用Ms液体培养基重新悬浮离心的莳液，使其稀
释25～50倍，测得的OD600=o．7左右即用于转化。
1．23不同菌液浓度下的大苞栝楼发根的诱导将发
根农杆菌R16叭和RlooO在液体YEB培养基中活化，
使其O隗f)0达到O，9，然后用Ms液体培养基分别稀释
到OD600=o．8到0．1的系列梯度浓度，用不同浓度的
菌液感染事先预培养24h的外植体(子叶和茎各40，
二个甲行，下同)20min，暗培养2d后将感染后的
外植体在25℃、1900uw·m～，12h·d_1，在含有
250mg·L。的羧苄青霉素)的MS固体培养基上除菌
并除菌直到30d。除菌后的发根在无激素的MS培养
基j：保存和增值，下同。
1．2．4不同光照强度下大苞栝楼发根的诱导外植体
(子叶和茎各40，i个平行，下同)预培养后，进行
感染，然后分别在O、1000、2000和3000“w·m“
的条件r进行发根的诱导。
1．2．5／f：同温度下发根的诱导外植体预培养后，进
行感染，然后分别在20、25和30℃的条件下进行发
根的诱导。
1．2．6不同激素水平下的发根诱导将外植体分别在
Ms+2．4-D(2．4-一氯苯氧乙酸)(o、o．5和I．0mg几)
的培养基}：预培养24h，然后分别用活化好的R1601
和R1000(OD600=O．70)感染20min后共培养2d
(25℃)暗培养，然后在1900uw·m～、12h·d～、
25℃下诱导发根。
1．2．7不同pH条件下的发根诱导活化好的菌株分
别在5．5、6．o、7．o和8．o的pH条件F进行外植体的
感染，然后共培养并除蔺。
l_3农杆菌碱的检测
根据shaWⅢ】等的方法从毛状根提取冠瘿碱，发
根农杆碱的检测参照savaryf91的方法。电泳条件为40
V·cm～。2．5mA·cm～，2．5h。
2结果与讨论
2，1 小同发根农杆菌菌液浓度对诱导大苞栝楼发根
的影响
结果妻u图1所示。从图中可以看⋯个明显的趋
势是随着感染的菌株浓度的增高，诱导的发根数也跟
着上升，而且两者呈现明显的线性关系。线性刚归得
到的回归方程也证明了这一点，由实验结果回归方程
为(y一转化率，x一菌液浓度)：1)fⅡ|、茎对R1000
菌液浓度：了叶y=O川736x+O．538【相关系数R=
O．934，PO．943，P菌液浓度：子叶v=O．009x十O．687(相关系数R=O．958，
P<0．01)：茎y=0．018lx+0．47I(相关系数R=O．964，
P从发根转化率(％)与活化菌液浓度的回归分析
表明，两者成显著线性相关，从图l中也可以看出，
随着菌液的浓度增加．诱导大苞栝楼发根显著增加，
当菌液的浓发达到OD600=O．7时，无论是菌株R1000
还是R1601，对于子叶或茎的诱导，诱导活性到达最
大，得到最高的发根诱导数。随后葡液的浓度继续增
加，诱导活性稍有下降，到OD600=O，9时，诱导大苞
括楼发根数受到抑制，因此，在实验中均以OD600=
O．70作为最适的诱导转化浓度。这表明发根农杆菌
R1600转化效率较R1000高。诱导率与菌液浓度在一
定范围内呈线性关系，可能是蔚细胞越多越能增加感
染的位点，有更多的菌株的质粒能够整合外植体的基
因组中。而随着浓度的增大又呈现非线性F降关系，
则可能与菌浓度过高后对外植体细胞的损伤。
2．2光照强度对发根诱导的影响
图l菌液浓度对发根诱导的影响
Figl E船ts0fstain鲫Iu6仰conc蛐tmti0Ⅱsonthe
induceⅡ峨L
万方数据
万方数据
2．6大苞栝楼发根培养体系的建立
2．6．1 发根农杆碱的检测结果如图5所示。从结果
}：看，以实生体了叶和茎作为对照，从了叶和茎上露
导出的发根的农杆碱检测呈现阳性，而且其迁移率与
标样相同，浇明转化成功。
图5大苞栝楼发根农杆碱的检测
F电5 Thedetenionofagmpineinthehairyootsof
THchosanth嘲bracteat丑Voigt
1收扦碱标样：2于叶发根表杆碱：3茎发根杜杆碱；4宾生体子叶农杆
碱：5．实牛体墓农杆碱
I．Ago砷Inem_rkeH2．Agropine0fhairymo忸fmmc tykdon；3，A即pine
ofh_irymobhmmstem；4．Agm—neofcotyledo毗曼Agmpineof日em
2．62发根培养体系的建寺发根农杆菌感染R1601
和R1000感染大苞杆楼外植体7d后，从子叶的形态
学下端中脉和边缘附近产生白色和淡黄绿色的愈伤组
织，并陆续长山发根(图6．1)。茎的生态学上端也有
瞬6发根培养体系
Fig6 Thehairy阳ots0f1Hchosanthe¨racteataVoigt
l了叶上诱导出的蔑根，2些L诱导山的垃根：3．无激素Ms培养基上培
养的笈报
Sed；onl：hairymobfmmcotyledon；s盹60n2：h_iryoots帅m“em；
sec“on3：h_i叫rDotsg唧nonMSmed；umf代eDfphytohomorn牯
愈伤组织的产牛，但足不如子叶的明显．且都为白色。
茎上的发根(图6．2)比子叶晚2d长出。部分发根具
有向上生长。发根比实生根粗而牛长迅速。把生长迅
速的发根从距根尖1cm处剪下，转移到无激素的Ms
培养基上培养，建立了发根培养体系(图6．3)。
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万方数据
不同培养条件对大苞栝楼发根诱导的研究
作者： 徐明芳， 曹焕生， 李定坚
作者单位： 徐明芳(暨南大学生物工程学系)， 曹焕生,李定坚(暨南大学水生态研究所,广州,510632)
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGIC SCIENCE
年，卷(期)： 2003,22(3)
被引用次数： 3次

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