全 文 ：·论　著·
[文章编号 ]　 0258-879X ( 2000) 10-0907-03
应用发根农杆菌 Ri T-DNA建立菘蓝的毛状根优质株系和植株再生系统
许铁峰 1 ,　张汉明1 ,　张　威 2 ,　丁如贤 1 ,　李博华 3
[摘要 ]　目的:建立菘蓝 ( Isatis indigotica Fo r t)的毛状根离体培养系统 ,并诱导毛状根再生植株。 方法:分别用发根农杆菌
A4, R1601和 ATCC15834三种菌株感染菘蓝的子叶外植体 ,获得毛状根 ,并筛选了优质株系 ;测定了毛状根的生长曲线 ;在含
不同激素的培养基上诱导毛状根再生植株 ;利用高压纸电泳法对毛状根和再生植株进行 T-DN A转化的检测。 结果:首次利
用发根农杆菌 A4, R1601和 ATCC15834三种菌株成功地从菘蓝中诱导出毛状根 ;菘蓝毛状根在含 BA的 M S培养基中成功
地诱导出再生植株 ;经高压纸电泳检测 ,菘蓝毛状根及其再生植株中均含有甘露碱 ,表明 Ri质粒的 T-DNA已整合进毛状根
和再生植株中。结论: 菘蓝毛状根离体培养和植株再生系统的建立 ,为进一步进行药用活性成分的工业化生产和引入外源基
因改良性状奠定了基础。
[关键词 ]　发根农杆菌 ;毛状根 ;菘蓝 ;再生植株
[中图分类号 ]　 R 282. 71　　　　 [文献标识码 ]　 A
Establishing better lines and regenerating system of hairy roots of Isatis indig-
otica with Ri T-DNA
XU Tie-Feng1 , ZHANG Han-M ing1 , ZHANG Wei2 , D ING Ru-Xian1 , L I Bo-Hua3 ( 1. Depar tment o f Pharmacogno sy , Colleg e
o f Pha rmacy , Second M ilitar y Medica l Unive rsity , Shanghai 200433, China; 2. Depa rtm ent o f Phy siolog y , Ha rbin Medical
Univ ersity; 3. International Joint Cance r Institute , Depar tment of Science Research, Second M ilitary Medical Univ er sity )
[ABSTRACT ]　 Objective: T o establish the culture system o f hairy r oo t o f Isatis indigotica and to induce the regenera tion
plant of hairy roo t. Methods: Hairy roo t of Isatis indigotica was obtained from infected co tyledon explants a fter infection with
Agrobacterium rhizogenes strains A4, R1601 and ATCC15834. The bette r lines w ere selected. The gr ow th curv e was sur-
veyed and ex trinsic facto rs affecting the g row th o f hair y r oo ts w ere investiga ted. The regener ation plant w as induced on M S
media with differ ent ho rmones. The t ransformation of Ri T-DNA w as examined th rough high voltag e paper electr ophor esis.
Results: Th e hairy ro o t w as o rigina lly obtained from Isatis indigotica. The regeneration plant was induced on M S media with
BA. The result of high vo ltag e paper elect ropho resis confirmed the transfo rmation o f T-DN A fr om Ri plasmid to the hair y
r oo t and regeneration plant. Conclusion: The acquisitio n o f hair y ro ot of Isatis indigotica and regener ation plant of it lay a
founda tion fo r th e pr oduc tion o f ac tiv e component and intr oduc tion o f for eign gene.
[KEY WORDS]　 Agrobacterium rhizogenes; hair y r oo t; I satis indigotica; r eg enera tion plant
[ Acad J Sec Mil Med Univ , 2000, 21( 10): 907-909 ]
⒇
　 自从发根农杆菌 Ri质粒被人们发现和认识以
来 ,它在许多领域都显示出极其广泛的应用前景 ,首
先它是植物基因工程理想的载体 ,以 Ri质粒为载体
可将抗虫、抗病基因或其他我们感兴趣的基因转移
到植物基因组并得到表达 ,从而达到改良植物性状、
提高品质的目的。其次 ,利用发根农杆菌转化植物产
生的毛状根建立离体培养系统 ,实现次生代谢物质
的工业化生产以解决中药资源的短缺问题。相对于
常规细胞培养 ,毛状根培养系统具有生长快速、不需
外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定、
向培养液释放部分代谢产物等优点 [1 ]。 我们利用发
根农杆菌 Ri质粒首次成功地从菘蓝中诱导出毛状
根 ,筛选出了各自的、生长快速的优质株系 ,建立了
毛状根离体培养系统 ,为利用毛状根进行次生代谢
物质的生产打下了基础。我们通过适当的激素诱导 ,
获得了再生植株 ,为进一步引进外源基因改良性状、
提高品质奠定了基础。
·907·第 二 军 医 大 学 学 报Acad J Sec Mil Med Univ　 2000 Oct; 21( 10)
⒇ [基金项目 ]　国家自然科学基金资助项目 ( 39870919) .
[作者单位 ]　 1. 第二军医大学药学院生药学教研室 ,上海 200433;
2. 哈尔滨医科大学生理学教研室 ; 3. 第二军医大学科研部国际合
作肿瘤研究所 .
[作者简介 ]　许铁峰 ( 1971-) ,男 (汉族 ) ,博士生 .
1　材料和方法
1. 1　发根农杆菌的活化　将三种发根农杆菌菌株
A4, R1601和 ATCC15834于 - 20℃保存在灭菌甘
油中 ,临用前于 YEB固体培养基、 25℃活化 3次 ,然
后转至 YEB培养液 ( R1601的培养液中加入 200
mg / L卡那霉素 ) ,于黑暗、 25℃ , 100 r /min振荡培
养 , 12 h后用于感染外植体 [1 ]。
1. 2　植物材料　菘蓝种子由上海崇明新海农场提
供 ,并经本室乔传卓教授鉴定。取菘蓝种子用清水洗
净 ,在 75%乙醇中浸泡 1 min,用清水冲净乙醇 ,再
用 0. 1% HgCl2消毒 10 min,无菌水冲洗 5次 ,置于
MS培养基上 , 5 d后萌发。 取生长 3 d左右的无菌
苗的子叶作为外植体 ,于 MS培养基上预培养 24 h
后用于转化。
1. 3　外植体的转化　将上述预培养的外植体分别
浸入处于对数生长期的发根农杆菌 A4, R1601和
A TCC15834菌液中 ,在黑暗条件下 120 r /min振摇
10 min,取出 ,用无菌滤纸吸干多余的菌液 ,置于
MS培养基上共培养 24 h后移至含 300 mg /L头孢
噻肟钠的 MS固体培养基上培养 , 25℃ ,光照 12
h /d,光强度 2 000 lx ,并以未经感染的子叶作对照。
1. 4　毛状根的除菌　将感染后长出的毛状根剪下
移到新的含 300 mg /L头孢噻肟钠的 M S固体培养
基上培养 ,每 5 d转接 1次 ,转接 3次以后 ,将培养
瓶放入 39. 5℃的恒温箱中除菌 , 48 h后将毛状根取
出移到不含抗生素的 MS培养基上。
1. 5　毛状根优质株系的筛选　将 MS培养基上的毛
状根逐一分开 ,挑取 2 cm左右者移入 1 /2 M S培养
液中 , 35 ml培养液 /三角锥瓶 ( 50 m l) ,每瓶 1根 , 20
d后观察生长情况 ,挑选生长迅速的进行继代培养。
1. 6　毛状根生长曲线的测定　取毛状根的优质株
系在 1 /2 M S培养液中进行测定 , 35 ml培养液 /三
角锥瓶 ( 50 ml) ,共 30瓶 ,每 4 d测 1次鲜质量与干
质量 ,每次测 3瓶 ,以平均质量为指标绘制生长曲
线。鲜质量系用布氏漏斗抽滤至无水滴下时测得 ,干
质量系 60℃烘 12 h后测得。
1. 7　甘露碱的检测　取菘蓝毛状根 100 mg,按
Morgan等 [ 2]的方法进行高压纸电泳分析 ,以试管苗
的正常根为阴性对照 ,甘露碱标准品 ( 1 mg /ml )为
阳性对照。
1. 8　毛状根的植株再生　将菘蓝毛状根剪取长 3
cm左右的根尖 ,置于添加有不同配比的苄基腺嘌呤
( BA)和α-萘乙酸 ( N AA)的 MS培养基上 ,诱导不
定芽 ,每个处理组 20个根尖。 当不定芽长至 1～ 2
cm时 ,将其剪下 ,移至生根培养基中生根 ,生根培养
基是在 MS基本培养基中添加下列激素: ① NAA
0. 5 mg /L;②吲哚丁酸 ( IBA) 0. 5 mg /L;③ NAA和
IBA各 0. 2 mg /L。
1. 9　再生植株的甘露碱检测　取再生植株的叶片
100 mg ,方法同毛状根的甘露碱检测。
2　结　果
2. 1　毛状根的获得　经发根农杆菌感染 ,菘蓝子叶
10 d后有根长出 ,大多数具有典型的毛状根特征:
具白色根毛 ,分支多 ,向上、贴瓶壁向上或沿培养基
平长 ,失去向地性 (图 1,见封四 )。 对照子叶出根率
低且向下长入培养基中。 20 d后统计出根率 ,结果
见表 1,可见 A4菌株诱导率较其他两种菌株高。
表 1　 3种发根农杆菌对菘蓝子叶
外植体感染的诱导率
Tab 1　 Root inducing rates of Insatis indigotica
transformed by 3 kinds of A. rh izogenes
Number of
ex plan ts
Number of
roo ted explants
Ind uction
rate (% )
A4 30 17 56. 7
R1601 30 5 16. 7
ATCC15834 30 9 30. 0
Cont rol 30 4 13. 3
2. 2　毛状根快速生长的优质株系的筛选　在 1 /2
M S培养液中培养 20 d后 ,观察各瓶中毛状根生长
状况 ,选出分枝多、生长快速的毛状根的优质株系:
IR5株 ,来源于 A4菌株。
2. 3　毛状根生长速率测定　结果见表 2,表明菘蓝
毛状根的质量随时间的延长而快速增加 , 24 d时质
量达到最大 , 增长 20倍 ,以后逐步下降。
表 2　菘蓝毛状根生长速率测定
Tab 2　 Growth rate of the hairy
root of Isat is indigotica
(x-±s )
Time( t /d) Fresh (m /g ) Dry (m /g) Increased
mul tiples
0 0. 18± 0. 03 0. 019± 0. 004 0
4 0. 30± 0. 02 0. 035± 0. 004 1. 84
8 0. 64± 0. 04 0. 074± 0. 003 3. 89
12 1. 08± 0. 13 0. 128± 0. 008 6. 73
16 1. 79± 0. 23 0. 191± 0. 010 10. 05
20 2. 71± 0. 22 0. 273± 0. 018 14. 37
24 3. 65± 0. 20 0. 386± 0. 018 20. 32
28 3. 28± 0. 13 0. 342± 0. 022 18. 00
·908· 第二军医大学学报　 2000年 10月 ,第 21卷
2. 4　毛状根诱导植株再生　 BA对诱导毛状根的植
株再生效果最好 ,单独使用或与 NAA配合使用均能
诱导再生不定芽 ; N A A对毛状根的愈伤组织诱导效
果较好 ,结果见表 3。菘蓝毛状根在含 BA的培养基上
培养 , 20 d后开始有毛状根变绿、变粗 , 1个月后转变
成不定芽 ,没有经过愈伤组织阶段。 将不定芽移到生
根培养基上培养 ,获得再生植株 ,再生植株同正常植
株相比 ,根系普遍生长迅速、多根毛、多分枝、缺乏向
地性、大部分根着生在培养基平面以上 ,其余部分同
正常植株无明显差别 (图 2,见封四 )。
2. 5　毛状根中甘露碱的检测结果　高压纸电泳检测
结果表明菘蓝毛状根中含有甘露碱 ,说明毛状根中确
已含有农杆菌 Ri质粒转入的 T-DNA (图 3,见封
四 )。对照正常根的高压纸电泳图谱无甘露碱斑点。
表 3　不同的激素对菘蓝毛状根不定
芽和愈伤组织诱导的影响
Tab 3　 Ef fect of dif ferent hormones on the dif ferentiat ion
of hairy root of Isatis indigotica
Auxins(dB /mg· L- 1 ) Grow th s tateof buds Grow th stateof callus
BA ( 0. 2) + -
BA ( 0. 5) + + -
BA ( 1. 0) + + + -
BA ( 2. 0) + + + -
NA A( 0. 2) - + +
NA A( 0. 5) - + +
NA A( 1. 0) + + + +
NA A( 2. 0) - + +
BA( 1. 0)+ NAA( 0. 2) + + + + +
Cont rol + -
　 - : No grow th; + : Grow th; + + : Obvious grow th;
　+ + + : Ex t remely obviou s g row th
3　讨　论
农杆菌诱导获得的毛状根中共生有大量农杆
菌 ,必须除去农杆菌以使毛状根大量、快速生长。除
去农杆菌的方法一般是采用抗生素除菌培养 ,但因
为抗生素对毛状根的生长有影响 ,有时还会导致愈
伤组织化 ,所以有人采用温度除菌法 [3 ]。本研究经过
反复摸索条件 ,认为采用抗生素除菌和温度法相结
合 ,除菌效果较好 ,即将共生有农杆菌的毛状根在含
300 mg /L头孢噻肟钠的 MS培养基上经过 3次继
代培养 ,农杆菌的生长受到了抑制 ,而毛状根的生长
状态较为良好 ,这时将培养瓶置 39. 5℃的恒温箱中
除菌 48 h。该方法简单有效 ,对毛状根影响不大。
有研究认为 ,发根农杆菌的转化只发生在细胞
分裂的 S期 (即 DNA合成期 ) ,因此幼嫩的、生长旺
盛的组织对农杆菌更敏感 ,这也是我们选择无菌幼
苗的子叶作为外植体的原因。由于一条毛状根起源
于一个细胞 [4 ] ,所以我们把获得的毛状根逐一分开 ,
作为单克隆进行培养。这样的培养物性能稳定 ,有利
于提供稳定的次生代谢产物。
通常认为转化植株具有侧根高度发达且失去向
地性、叶片皱缩、节间缩短等异常表型 [5 ]。 本研究获
得的菘蓝转化植株的根系具有多根毛、多分枝、失去
向地性等异常表型 ,但未观察到叶片皱缩、节间缩短
等异常表型 ,这同董金兰等 [6 ]在甘草毛状根的再生
植株 ,卜学贤等 [ 7]在毛白杨毛状根的再生植株中观
察到的结果相一致。
植物激素在毛状根的植株再生过程中起着关键
的作用。本研究结果表明 , BA对菘蓝毛状根的植株
再生的作用最为重要 ,这与何玉科 [8 ]在甘蓝毛状根
植株再生中观察到的结果相一致。
[参 考 文 献 ]
[1 ]　王关林 . 发根农杆菌 Ri质粒载体转化 . 见:王关林 ,方宏筠 主
编 . 植物基因工程原理与技术 [M ]. 北京:科学出版社 , 1998.
237-238.
[2 ]　 Morgan AJ, Cox PN , Tu rner DA, et al . Trans format ion of
tomato using an Ri plasmid v ecto r [ J ]. Plant Sci, 1987, 49( 1):
37-44.
[3 ]　张荫麟 ,周新华 ,杨　岚 ,等 . 甘草的发状根培养 [ J ]. 中草药 ,
1990, 21( 12): 23-26.
[4 ]　戴均贵 ,朱蔚华 . 发根培养技术在植物次生代谢产物生产中的
应用 [ J] . 植物生理学通讯 , 1999, 35( 1): 69-75.
[5 ]　张荫麟 ,宋经元 ,祁建军 ,等 . 农杆菌转化后植株再生 [ J ]. 中国
中药杂志 , 1997, 22( 5): 274-275.
[6 ]　董金兰 ,李洪泉 ,李红卫 . Ri质粒介导的 DN A转移及诱发甘
草毛状根植株再生 [ J] . 生物技术 , 1991, 1( 1) : 21-28.
[7 ]　卜学贤 ,林忠平 ,陈维伦 . 农杆菌对毛白杨的转化及完整转化
植株的获得 [ J] . 植物学报 , 1991, 33( 3): 206-212.
[8 ]　何玉科 . 甘蓝 Ri T-DN A转化根的植株再生 [ J ]. 生物工程学
报 , 1990, 6( 2): 120-125.
[收稿日期 ]　 2000-06-09　　　　 [修回日期 ]　 2000-07-20
[本文编辑 ]　汪立鑫
·909·第 10期 . 许铁峰 ,等 .应用发根农杆菌 Ri T-DN A建立菘蓝的毛状根优质株系和植株再生系统
应用发根农杆菌 Ri T- DNA建立菘蓝的毛状根
优质株系和植株再生系统
(正文见第 907页 )
第二军医大学学报
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