全 文 ：
宋晖，王友绍. 萘胁迫下秋茄 MnSOD 基因和 C4H 基因的实时定量表达分析[J]. 生态科学，2012，31(2)：104-108.
SONG Hui, WANG You-Shao. Expression analysis of MnSOD gene and C4H gene in Kandelia candel under naphthalene stress[J].
Ecological Science, 2012, 31(2)：104-108.

萘胁迫下秋茄 MnSOD 基因和 C4H 基因的实时定量
表达分析
宋 晖 1,2，王友绍 1, 2*
1. 中国科学院南海海洋研究所热带海洋环境国家重点实验室，广州 510301
2. 中国科学院大亚湾海洋生物综合实验站，深圳 518121
【摘要】研究首次探讨了萘胁迫下红树植物秋茄不同组织 C4H 基因和 MnSOD 基因的表达特征。研究结果表明，两个基因在叶
茎根中的表达量有明显的差异，C4H 基因在叶茎中的表达量明显大于根，MnSOD 基因的表达量为叶最大，茎次之，根最小。
在 5 个不同浓度的萘胁迫下，C4H 基因和 MnSOD 基因的表达普遍被诱导，转录水平都随着处理浓度的升高而增强，而且在叶
组织中的表达量和萘处理浓度表现出明显的相关关系，相关系数分别达到 0.846 和 0.902（p< 0.05）， 而在根和茎中并不具有
显著的相关关系。 在萘胁迫下秋茄叶子是最敏感的部位，而 C4H 基因和 MnSOD 基因在叶子中的表达量则为指示萘胁迫强度
的良好生物学指标。
关键词： 秋茄；实时定量 PCR；萘；肉桂酸-4 羟化酶基因；锰氧化物歧化酶基因
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2012.02.002 中图分类号： Q945.78 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2012)02-104-05

Expression analysis of MnSOD gene and C4H gene in Kandelia candel under
naphthalene stress
SONG Hui1, 2,3, WANG You-Shao1,2*
1. State Key Laboratory of Tropical Oceanography, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou
510301，China
2. Marine Biology Research Station at Daya Bay, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518121，China
Abstract The expression of C4H gene and MnSOD gene in leaf, stem and root of Kandelia candel responded to the naphthalene (NAP)
was evaluated in this study. Real-time PCR analysis demonstrated that the regulation patterns in three tissues were different. The
expression of C4H gene in leaf and stem was higher than that in root. The expression level of MnSOD was in the order of leaf
>stem>root. The expression level of C4H and MnSOD increased with the enhancement of NAP. A significantly positive correlation was
also found between NAP and C4H expression in leaf, and the correlation coefficient was 0.846 and 0.902 (p<0.05), respectively.
However, there was no obvious correlation between NAP and C4H expression in stem or root. The results indicated that the C4H and
MnSOD gene regulation systems were the most sensitive in leaf, and the expression analysis indicated that they were good indicators for
NAP stress.
Key words：Kandelia.candel; real-time PCR; naphthalene; C4H; MnSOD




收稿日期：2011-03-29 收稿，2011-10-20 接受。
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划重点项目(2009BADB2B0606); 国家自然科学基金项目(41076070, 41176101); 中国科学院知识创新工程
要方向性项目(KZCX2-YW-Q07-02, KSCX2-EW-G-12C, KZSX2-SW-132).
作者简介： 宋晖（1984—），女，博士研究生，研究方向：红树林生态学，Email：songhuigirl@gmail.com
*通讯作者： 王友绍（1963—）男，博士、教授（二级），E-mail：yswang@scsio.ac.cn
第 31 卷 第 2 期 生 态 科 学 31(2): 104-108
2012 年 3 月 Ecological Science Mar. 2012

1 引言（Introduction）

红树林生态系统具有高初级生产力、富含有机
碎屑、沉积物颗粒细及缺氧环境等特征使其成为吸
收和蓄积多环芳烃等污染物的重要场所。对香港、
福建等地的红树林湿地调查研究表明，湿地中多环
芳烃的种类组成相似，以萘、芴和菲为主[1, 2]。多环
芳烃污染湿地后，可以通过多种途径进入植物体内，
对植物的正常代谢造成干扰，并致使植物体内产生
大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）[3, 4]。
为了应对多环芳烃引起的活性氧胁迫环境，生物体
内形成了多种防御机制，包括氧化前防御机制和氧
化后防御机制。氧化前防御机制集中在细胞色素
P450 酶系统，细胞色素 P450 酶系催化多种亲脂性
外源化合物的生物转化，反应底物包括脂类、苯丙
烷类、黄酮类等内源化合物以及多种农药、除草剂、
多环芳烃等外源物质[5, 6]。生物暴露于多环芳烃、
PCBs 等污染物的水平与体内 P450 酶系的表达水平
具有显著相关性，其的表达水平是作为海洋动物暴
露于持续性有机污染物可靠的生物标志物[6]。目前，
对于植物中 P450 的功能和表达特征的研究还比较
少，肉桂酸-4 羟化酶(cinnamate-4-hydroxylase, C4H）
作为一种 P450 单加氧酶，在植物的各组织中均具
有很高的表达活性，参与许多异源物质的羟化反应
[7]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）
是植物体内活性氧清除反应过程中第一个发挥作用
的抗氧化酶，在清除氧自由基，防止氧自由基破坏
细胞的组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤
等方面具有重要的作用[8]。
本研究以红树植物秋茄（Kandelia candel）为研
究对象，以萘作为多环芳烃污染种类人工模拟多环
芳烃污染沉积物，首次开展了秋茄体内 C4H 基因和
MnSOD 基因在萘胁迫下的调控反应研究，以便更
好地了解红树植物在分子水平上的耐受机制，为受
损红树林生态系统修复及其资源保护提供科学依
据。
2 材料与方法（Materials and Methods）
2.1 红树植物培养及基质处理
实验用红树植物秋茄由本实验室培植，秋茄胚轴
采集于深圳东冲河口区。在无多环芳烃污染的沙质
土壤中培养。盆栽苗生长在 25℃、480 µmol· m-2·s-1
光照下，待萌发后每七天用含 10‰ 的 NaCl
Hogland 营养液浇灌一次。待秋茄有两片子叶萌发
时放在预先用萘处理的沙子（方法采用刘亚云等[9]
的处理方式）基质中处理 30 d，取其幼嫩的叶、茎、
根的幼嫩组织用于基因的实时定量表达测定。
实验设 1 个对照组和 5 个不同浓度处理组，对照
组不加多环芳烃，处理组多环芳烃的浓度分别为海
洋沉积物萘污染风险评价中值[10]、中值的 5 倍、10
倍、15 倍和 20 倍，即 2 mg·kg-1、10 mg· kg-1、20
mg· kg-1、30 mg ·kg-1、40 mg· kg-1，分别用 C、N1、
N2、N3、N4、N5 表示。
2.2 组织 RNA 提取和第一链 cDNA 合成
采用 Invitrogen ConcertTM Plant RNA Reagent
RNA 提取试剂盒，按试剂盒操作说明进行。通过
Promega RQ1 RNase-Free DNase（M610）去除基因
组 DNA 后，cDNA 合成参照 Tiangen 公司 M-MLV
反转录说明书进行。反转录原液稀释 10 倍后用
Bio-Rad IQ5 实时定量测试。
2.3 荧光定量 PCR
引物设计根据木榄 C4H 基因(GU478983.1)和
MnSOD 基因(GU433194.1)的序列设计，以秋茄 18s
基因 (AY289625.1) 为内参查看目的基因的表达。
引物详情见表 1。实时定量 PCR 采用 Takara
(DRR081)实时定量试剂，25 uL 扩增体系：12.5 uL
SYBR Premix buffer，9.5 uL ddH2O，0.5 uL 10 umol
正向引物，0.5 uL 10 umol 反向引物，2 uL 模板。扩
增程序为：95℃变性 30s；95℃变性 5s，55℃复性
15s，72℃延伸 30s，循环 45 次；65℃-95℃测定熔
解曲线，每隔 0.5℃测定吸光值。
3 结果与讨论（Results and Discussion）
为了研究红树植物中叶茎根不同组织基因的表
达量差异，分别采集秋茄植物叶茎根的幼嫩组织用
于测定其不同部位的 C4H 基因和 MnSOD 基因表
达。研究表明（如图 1 所示），C4H 基因和 MnSOD
基因在叶子和茎中的表达量远大于根，这与金属硫
蛋白基因在红树植物不同部位的表达结果相似[11]，
但 C4H 基因在叶和茎中的表达量差别不大（如图 1
所示）。
目前，动物 P450 酶系在外界环境胁迫下表达
变化常被作为检测海域石油类化合物、PCBs、其他
卤代化合物以及农药等污染的指标[6]，但是关于植
2 期 宋晖，等. 萘胁迫下秋茄 MnSOD 基因和 C4H 基因的实时定量表达分析 105

表 1 实时定量引物序列
Table 1 Real-time PCR primers
基因
Gene
引物序列
Primer sequence
序列号
Access number
扩增片段长度(bp)
Amplicon size (bp)
F 5CCTGAGAAACGGCTACCACATC 3 18s rRNA
R 5ACCCATCCCAAGGTCCAACTAC 3
AY289625.1 256
F 5CCAGCAAAAGGGAGAGAT 3 C4H
R 5TCAGGGTGGTTTACAAGC 3
GU478983.1 126
F 5TGGAAGTATGCCAGTGAAGTGTATGAGA 3MnSOD
R 5TGACCCGTTGAGGAACCGAAAA 3
GU433194.1 247
C4H
0
0.5
1
1.5
Leaf Stem Root
不同组织 Different tissues
相
对
表
达
量
Re
la
ti
ve
F
ol
d
Ex
pr
es
si
on

MnSOD
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Leaf Stem Root
不同组织 Different tissues
相
对
表
达
量
Re
la
ti
ve
F
ol
d
Ex
pr
es
si
on

图 1 C4H 基因和 MnSOD 基因在秋茄不同组织表达量的差异
Fig. 1 Differential expression of C4H and MnSOD gene in different tissues of K.candel
A C4H
0
1
2
3
4
5
6
C N1 N2 N3 N4 N5
处理 Treatment
校
正
表
达
量
No
rm
al
iz
ed
F
ol
d
Ex
pr
es
si
on
*
**
B C4H
0
2
4
6
8
10
12
C N1 N2 N3 N4 N5
处理 Treatment
校
正
表
达
量
No
rm
al
iz
ed
F
ol
d
Ex
pr
es
si
on
*
*
*
*
C C4H
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
C N1 N2 N3 N4 N5
处理 Treatment
校
正
表
达
量
No
rm
al
iz
ed
F
ol
d
Ex
pr
es
si
on
*
*
*
* *
*

图 2 秋茄叶（A）、茎（B）、根（C）中 C4H 基因在不同萘处理水平下的表达量
Fig. 2 The expression of C4H gene in leaf(A), stem(B), root(C) of K.candel under different NAP treatment

物中细胞色素 P450 酶系统的功能与表达的报道还
较少。Durst 等人[12]的研究表明，外界环境胁迫对
小麦、甘薯、以色列菊芋等作物的 P450 含量有明
显的诱导作用。在萘的胁迫下，红树植物秋茄 C4H
基因的表达也明显被诱导（如图 2A 所示），C4H 基
因在叶子中的表达量随着萘处理浓度的升高而逐渐
升高，相关分析表明 C4H 基因的表达量和萘的浓度
的相关系数达到 0.846（P<0.05），说明在萘的处理
下，叶子中 C4H 基因的表达普遍受到诱导。而蒙
古扁桃在干旱胁迫下 C4H 的活性也表现出相似的
相关关系[13]，表明 C4H 酶的表达在植物抗性方面具
有一定程度的广适性，是构成植物抵抗外界逆境胁
迫的重要支撑系统。而茎在低浓度时（N1, N2），
C4H 表达量明显升高（如图 2B），但在浓度升高时
（N3-N5），C4H 基因的表达量显著降低，其结果与
金属硫蛋白在 Zn 胁迫下的表达结果相似 [11]，说明
植物不同部位在萘胁迫下的响应临界值不同。在根
中 C4H 基因表达水平除了在 N2 处理水平下显著增
强外（如图 2C 所示），其它处理水平下 C4H 基因
的表达都受到了明显的抑制。这说明在萘胁迫下，
106 生 态 科 学 Ecological Science 31 卷

A MnSOD
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
C N1 N2 N3 N4 N5
处理 Treatment
校
正
表
达
量
No
rm
al
iz
ed
F
ol
d
Ex
pr
es
si
on
* *
B MnSOD
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
C N1 N2 N3 N4 N5
处理 Treatment
校
正
表
达
量
No
rm
al
iz
ed
F
ol
d
Ex
pr
es
si
on
* * *
C MnSOD
0
20
40
60
80
100
120
C N1 N2 N3 N4 N5
处理 Treatment
校
正
表
达
量
No
rm
al
iz
ed
F
ol
d
Ex
pr
es
si
on
*
*
* *
*

图 3 秋茄叶（A）、茎（B）、根（C）中 MnSOD 基因在不同萘处理水平下的表达量
Fig. 3 The expression of MnSOD gene in leaf(A), stem(B), root(C) of K.candel under different NAP treatment

植物根部 P450 酶系统是最容易受到伤害的组织，
这可能与根部直接接触多环芳烃污染物有关。C4H
基因转录水平在叶茎根中的表达特征说明在萘胁迫
下，红树植物秋茄不同组织中有不同的表达机制。
MnSOD 是植物细胞线粒体内消除超氧离子、
保护线粒体不受活性氧伤害的关键性酶。CuZnSOD
和 FeSOD 对 KCN 和 H2O2 敏感，而 MnSOD 不受
两种抑制剂的影响[8]。研究表明在外界光、百草枯、
干旱及水淹等胁迫发生时，多种植物叶片中 SOD
酶基因的表达能够强烈的被诱导[8]。这说明在逆境
胁迫时，植物可能具有相同的抗逆机制。本研究结
果表明，在低浓度萘处理下，秋茄叶子中 MnSOD
基因的表达量没有变化，但在高浓度胁迫时，叶子
中 MnSOD 基因的表达则受到了强烈的诱导(如图
3A)。 这说明在高浓度时，植物通过增强 MnSOD
基因的转录水平，提高 MnSOD 酶的表达量，从而
有效的清除氧自由基含量，抵抗萘胁迫的危害；这
与玉米在高渗压剂胁迫、水稻在干旱胁迫下
MnSOD 表达量迅速上升的结果相似[15, 16]。MnSOD
在茎中表达则与叶子中相反（如图 3B 所示），在较
低浓度时，表达量升高，在高浓度时，其表达量则
显著降低，说明在高浓度萘胁迫下，达到茎中的抗
氧化系统防御机制的临界值，而会抑制该酶系统的
有效表达。在根中，除了 N1、N2 处理显著增加了
MnSOD 基因量的表达外，N3、N4 处理时显著降低，
在 N5 时又明显升高(如图 3C)。说明在低强度胁迫
时，MnSOD 的表达量显著增加来对抗萘引起的氧
化胁迫环境，而随着胁迫强度的增大该基因的调控
则明显降低，在更高强度时，则进一步启动解毒防
御机制，这种表达机制说明萘可以调节植物内部该
基因的表达与调控。而多种胁迫下的研究结果也表
明 MnSOD 基因的表达受各种环境胁迫的控制，不
同的环境胁迫导致不同的 SOD 基因表达，可能是因
为不同的逆境胁迫引起不同的亚细胞结构中活性氧
有较多积累，从而启动不同的酶表达系统，协调一致
的应对外界胁迫所引起的高氧化环境[[8, 17, 18]。

表 2 基因表达量和萘处理水平的相关关系（相关系数）
Table 2 Correlation (coefficient) between the gene
expression and the NAP treatment level
基因 Gene 叶 Leaf 茎 Stem 根 Root
C4H 0.846* -0.418 -0.344
MnSOD 0.902* -0.311 -0.194
*说明在 P<0.05 的水平上. Indicated the significance at
p<0.05.

李昕馨等人的研究表明，小麦细胞色素 P450 可
以作为土壤多环芳烃污染的良好生物标记物[19]，而
本研究的相关分析也得出相同的结论（如表 2 所
示），萘胁迫的强度和 C4H 基因及 MnSOD 基因在
叶子中的表达量成明显的正相关性，而在茎和根中
则无明显相关关系；因此，秋茄叶子中 C4H 基因和
MnSOD 基因的表达含量是指示萘胁迫强度的良好
指标。
4 小结（Summary）
本研究首次对萘胁迫下红树植物秋茄体内
C4H 基因和 MnSOD 基因的调控响应机制进行了探
讨；实时定量研究结果表明，两基因在转录水平上
的表达调控均受到萘胁迫的强烈诱导，叶子的响应
最敏感，其在叶子内的表达含量和外界萘的处理浓
2 期 宋晖，等. 萘胁迫下秋茄 MnSOD 基因和 C4H 基因的实时定量表达分析 107

度呈明显的正相关关系；因此，C4H 基因和 MnSOD
基因的表达含量为表征萘胁迫强度的良好生物学指
标。
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108 生 态 科 学 Ecological Science 31 卷