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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):135-142
收稿日期：2015-09-16
基金项目：国家自然科学基金项目（81360254），国家科技部支撑计划课题子课题（2011BAC06B12），贵州省科技厅联合基金项目（黔科合
LH字［2014］7076 号），贵州省卫生计生委科学技术项目（gzwjkj2014-2-100），贵州省高等学校创新能力提升计划（07060151306）
作者简介：胡亚，女，硕士研究生，研究方向：医学昆虫免疫及应用；E-mail ：hooyaa@126.com
通讯作者：吴建伟，男，博士生导师，研究方向：医学昆虫免疫及应用；E-mail ：wjw@gmc.edu.cn
家蝇核糖体蛋白 S18 基因的克隆及表达模式研究
胡亚1  卢诚1  魏川川1  修江帆1，2  吴建伟1，2
（1. 贵州医科大学基础医学院，贵阳  550004 ；2. 贵州博康生物工程有限公司，贵阳  550004）
摘 要 ： 旨为证实核糖体蛋白 S18（Ribosomal protein S18，RPS18）基因在家蝇体内的表达稳定性。从构建家蝇幼虫 cDNA 
文库中筛选到核糖体蛋白 S18 基因，以 cDNA 为模板，通过 PCR 扩增，获得 RPS18 基因完整编码序列（登录号 ：KT006855），运
用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建 pET28a/RPS18 重组质粒，转化到大肠杆菌 Transetta（DE3）中进
行诱导表达及蛋白纯化，制备多克隆抗体并进行抗血清特异性分析。应用 RT-PCR、qPCR 及 Western-blot 从转录、翻译水平上分
析 RPS18 基因在家蝇不同发育时期和三龄幼虫不同组织中的表达情况。结果表明，RPS18 基因 ORF 全长 459 bp，编码 152 个氨基
酸，理论分子量为 17 590.5 Da，等电点为 10.48 ；将构建的重组质粒转入大肠杆菌 Transetta（DE3）中，纯化得到 RPS18 蛋白 ；将
该纯化蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体，His 单抗鉴定及抗血清特异性分析显示，其均可见单一条带 ；RT-PCR、qPCR 及 Western-
blot 分析表明，RPS18 基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织均能够稳定表达 ；综合分析表明，该基因在家蝇不同发育时期及幼
虫不同组织均保持较好的表达稳定性。
关键词 ： 核糖体蛋白 S18（RPS18）；家蝇 ；内参基因 ；原核表达 ；表达模式
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.019
Cloning and Expression Pattern of Ribosomal Protein S18 Gene in
Musca domestica
HU Ya1  LU Cheng1  WEI Chuan-chuan1  XIU Jiang-fan1，2  WU Jian-wei1，2
（1. Basic Medical College，Medical University of Guizhou，Guiyang 550004 ；2. Guizhou Bokang Bioengineering Co.，Ltd，
Guiyang 550004）
  Abstract:  This research  is  to confirm the expression stability of  ribosomal protein S18（RPS18）gene in Musca domestica. The 
complete coding sequence（Registration number in NCBI ：KT006855）of RPS18 gene was obtained via PCR amplification using the cDNA of 
RPS18 gene from the cDNA library of M. domestica larva as a template，further the gene and its encoding protein were predicted and analyzed 
by bioinformatics method. The constructed recombinant plasmid of pET28a/RPS18 was transferred into Escherichia coli Transetta（DE3）for 
the induced expression and protein purification，and the polyclonal antibody was prepared as well as the specificity of antiserum was analyzed. 
The transcription and translation expressions of RPS18 gene at different growth stages of the M. domestica larva and in the different tissues of 3-year 
larva were analyzed by RT-PCR，qPCR and Western blot. The results showed that the RPS18 ORF was 459 bp in length encoding 152 amino 
acids with a predicted molecular mass of 17 590.5 Da and pI of 10.48. The recombinant plasmid was transferred into E. coli Transetta（DE3），
and the purified protein RPS18 was acquired. The purified protein was immunized to rabbits，then the polyclonal antibody was harvested，
and the single band was visualized by both His single resistance identification and antiserum specificity analysis. The analysis by RT-PCR，
qPCR and Western blot indicated that RPS18 genes expressed stably in different growth stages and different tissues of the larva. In conclusion，
comprehensive analysis suggests that  the gene may maintain solid stability in different growth stages of M. domestica and different tissues of 
larva.
 Key words:  ribosomal protein S18 ；Musca domestica ；reference genes ；prokaryotic expression ；expression pattern
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6136
管家基因又称持家基因，是所有细胞中均表达
的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所
必需的［1，2］。该基因一直处于活性转录状态，表达
水平受环境因素影响较小，而且是在个体各个生长
阶段的大多数，或几乎全部组织中持续表达，它的
表达只受启动序列或启动子与 RNA聚合酶相互作用
的影响，而不受其他机制调节。管家基因被认为在
转录和翻译水平方面保持恒定，其通常作为内参基
因校正上样量及上样过程中存在的实验误差，保证
实验结果的准确性［3］。随着对昆虫功能基因研究的
不断深入，为了获得真实可靠的实验数据，实验通
常采用内参基因进行数据校正和均一化［4］，从而对
内参基因的研究显得极为重要，目前通常以微管蛋
白 基 因（α-tubulin、TUA、β-tubulin、TUB）［5］、 核 
糖体蛋白（如 RPSs、RPLs）［6］、肌动蛋白（如 β- 
actin）［7］、甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶基因（glyceraldeh-
yde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）［8］、转录延 
伸 因 子 基 因（Transcription elongation factors，EF-
1α）、多聚泛素酶基因（ubiquitin，UBQ）、18S 核糖
体 RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）［9］等管家
基因作为内参基因评估昆虫基因的表达［10］。
目 前 在 真 核 细 胞 中 发 现 的 核 糖 体 蛋 白
（Ribosomal protein，RP）有 80 多种，广泛分布于各
种组织中，核糖体蛋白的命名与蛋白在核糖体的大
小亚基有关。小亚基核糖体蛋白命名为 S1-S31，大
亚基核糖体蛋白命名为 L1-L44［11］。越来越多的证
据表明，多种 RP 除组成核糖体、参与蛋白质生物
合成之外，还具有其他的功能［12］，如在哺乳动物和
果蝇中，RPS3 有核酸内切酶的作用，RPS2 基因突
变引起卵子发育停滞，RPS10 参与转录过程中的抗
终止作用，RPS12 参与 RNA 的加工过程［13］。核糖
体蛋白 S18 是真核生物核糖体 40S 亚基的组成蛋白
之一，是一种高度保守的蛋白质，属于核蛋白 S13
超家族成员，由于稳定表达于不同类型的细胞和组
织（如正常细胞和癌细胞）中，而且其表达量近似，
并无显著性差别，近年来已有实验将其作为内参基
因进行研究［14］。
家蝇（Musca domestica）呈世界性分布，是重
要的媒介昆虫，对环境适应能力强，有强大的先天
性免疫系统及生长代谢调节功能［15-17］。近年来，对
于家蝇功能基因的系统研究已成为研究热点，从核
酸和蛋白水平评估基因的时空表达变化是研究功能
基因的基础。在家蝇中，仅在转录水平上对内参基
因进行优化选择研究［18］，但对于蛋白翻译水平，到
目前仍未见相关研究报道。本研究通过对家蝇核糖
体蛋白 S18（RPS18）基因完整开放阅读框序列进行
基因克隆及原核表达，并通过 RT-PCR、qPCR 及采
用Western-blot 从转录、翻译水平上分析其在家蝇不
同发育时期和不同组织中的表达情况，评估 RPS18
基因作为家蝇内参基因的可靠性，旨在为今后进行
家蝇功能基因的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  动物材料与菌种  家蝇由贵州医科大学病原
生物学教研室常规饲养；清洁级新西兰大白兔，由
贵州医科大学实验动物中心提供；宿主菌感受态细
胞 Trans1-T1 和 Transetta（DE3）购自北京全式金生
物技术有限公司；载体 pMD18-T 和 pET28a（N 端
6×His 蛋白纯化标签）购自 TaKaRa 公司。
1.1.2  主要试剂和仪器  限制性内切酶、T4 连接酶、 
rTaq 酶、MiniBEST 小量质粒抽提纯化试剂盒，DNA 
Marker DL2000、羊抗兔 IgG/HRP、抗 His 标签抗体、
protein marker、 总 RNA 提 取 试 剂 TRIzol Reagent、
PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit、DNA 凝胶回收试
剂盒均购自 TaKaRa 公司；考马斯亮蓝 R-250、EZ-
buffers H10*TBST buffer 购自上海生工生物工程有限
公司；卡那霉素；RPS18 抗体由实验室自制；所用
引物由上海生工生物工程公司合成。JY92-IIN 超声
波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司），
PCR 扩增仪（德国 Eppendorf 公司），冷冻高速离心
机（德国 Eppendorf 公司），凝胶成像系统 IQuant400
（美国 Amersham Pharmacia 公司）。
1.2  方法
1.2.1  家蝇幼虫总 RNA 的提取及 cDNA 合成  总
RNA 的提取按照 TaKaRa 公司 TRIzol 说明书进行操
作。分别对家蝇不同发育时期（卵、一龄幼虫、二
龄幼虫、三龄幼虫、蛹、雌蝇、雄蝇）和三龄幼虫
不同组织（体壁、马氏管、脂肪体、肠道、唾液腺）
提取总 RNA，总 RNA 经电泳检测，GeneQuant 公司
2016,32(6) 137胡亚等：家蝇核糖体蛋白 S18 基因的克隆及表达模式研究
核酸定量分析仪测定 A260/280 比值及浓度，以 1 μg 总
RNA 为模板，按照 cDNA 合成试剂盒说明书分别合
成 cDNA第一链，三龄幼虫作为基因克隆的模板。
1.2.2  引物设计  根据 NCBI 公布的家蝇基因组
RPS18 基因预测序列，筛选到编码该基因的 ORF 序
列，运用 Primer 5.0 软件设计基因克隆引物（F1、
R1），成熟肽原核表达引物（F2、R2）。以上引物由
生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列
如下：F1：5-ATGTCGCTCGTTATCCCAGAAAAG-3，
R1 ：5-TTACTTCTTCTTGGATACACCGACA-3 ；F2 ：
5-CGCGGATCCATGTCGCTCGTTAT-3，R2 ：5-CCC
AAGCTTTTACTTCTTCTTGGAT-3。
1.2.3  pMD18-T/RPS18 克隆载体的构建  以上述
家蝇幼虫 cDNA 为模板，应用基因克隆引物进行 
PCR 扩增，扩增条件：94℃预变性 5 min ；94℃ 30 
s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环；72℃延伸 10 
min。取 PCR 产物检测：2%的琼脂糖凝胶电泳。用
DNA 凝胶回收试剂盒，纯化 PCR 产物。将 PCR 产
物连接到 pMD18-T 载体上，转化 Trans1-T1 感受态
细胞，涂布于 Amp+ 抗性的 LB固体培养基平板培养，
次日挑单克隆进行 PCR鉴定，扩大培养后提取质粒，
送生物公司测序。
1.2.4  生物信息学分析  利用瑞士生物信息学研
究所的蛋白分析专家系统（Expert Protein Analysis 
System，ExPASy，http://ca.expasy.org/）提供的生物
信息学工具分析家蝇 RPS18 基因的特点；运用 NCBI 
Blast 对基因序列进行同源比对，用 ProtParam 分析
蛋白等电点、分子质量；ProtScale 分析蛋白质的疏
水性；SignaIP4.1 分析信号肽位点；免疫表位数据库
分析资源 IEDB Analysis Recource 网站（http://tools.
immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input） 分 析 抗 原 
表位。
1.2.5  pET28a/RPS18 表达载体的构建  以 pMD18-
T/RPS18 质粒为模板，应用表达引物（F2、R2）扩
增 RPS18 序 列，PCR 反 应 条 件 为：94℃ 预 变 性 
5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环；
72℃延伸 10 min。取 PCR 产物检测：2% 的琼脂糖
凝胶电泳。PCR 产物用胶回收试剂盒回收纯化，将
纯化的 PCR 产物与原核表达载体 pET28a 重组，连
接产物转化 Transetta（DE3）感受态细胞，涂布于
含 Kan+ 抗性的 LB 平板上，37℃培养过夜，随机挑
取 10 个阳性克隆，扩大培养后，用质粒提取试剂盒
抽提质粒，测序并鉴定。
1.2.6  家蝇 RPS18 重组蛋白的诱导表达和纯化及
Western-blot 鉴定  将重组质粒 pET28a/RPS18 转入
Transetta（DE3）。挑取阳性克隆接种于 5 mL LB 培
养液中 37℃，200 r/min 过夜培养。取菌液 3 mL 于
100 mL LB培养液中37℃培养。当OD600检测值是0.6
时，加入 IPTG 至终浓度为 0.25 mmol/L，34℃，继
续培养 18 h。用 12% SDS-PAGE 检测重组蛋白表达
情况。诱导菌液离心 10 000 r/min，10 min 收集菌体，
裂解缓冲液重悬菌体，超声裂解悬浮液（160 W，超
声 2 s，间歇 5 s，循环数 90）。悬浮液 4℃、13 000 
r/min 离心 30 min，收集上清和沉淀，根据 Ni-IDA 
Agarose 蛋白纯化说明书操作进行纯化，12% SDS-
PAGE判断重组蛋白的可溶性。用兔来源的抗6×His 
单克隆抗体（1∶2 000）为一抗，羊抗兔 IgG-HRP
（1∶2 000）为二抗，进行 Western blotting 鉴定纯化
的家蝇 RPS18 融合蛋白。
1.2.7  多克隆抗体的制备及抗血清特异性分析  将
纯化好的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，600 
μg 分为 4 次注射，蛋白质与等体积的完全弗氏佐剂
充分混匀，皮下多点注射新西兰大白兔，初次注射
量为 300 μg。加强免疫每次间隔 10 d，蛋白质与等
体积的不完全弗氏佐剂充分混匀，皮下多点注射新
西兰大白兔，注射量为 100 μg，4 次免疫后间隔 7 d
再进行采血，并分离血清。500 μL/ 管分装，-80℃保 
存。同时以注射 PBS的新西兰大白兔作为阴性对照。
以新西兰大白兔抗家蝇 RPS18 重组蛋白血清和
初次免疫前新西兰大白兔阴性血清为一抗（1∶20），
以羊抗兔 IgG-HRP 为二抗（1∶2 000），进行 West-
ern blotting 分析家蝇 RPS18 重组蛋白的免疫原性。
1.2.8  RPS18 基因转录水平研究  通过 RT-PCR 方
法，以家蝇不同发育时期（卵、一龄幼虫、二龄幼虫、
三龄幼虫、蛹、雌蝇、雄蝇）和三龄幼虫不同组织（体
壁、马氏管、脂肪体、肠道、唾液腺）cDNA为模板，
用 F1、R1 为引物扩增 RPS18 序列，PCR 反应条件
为：94℃预变性 5 min ；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 
1 min，30 个循环；72℃延伸 10 min。取 PCR 产物
检测：2%的琼脂糖凝胶电泳检测家蝇不同发育时期
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6138
和不同组织 RPS18 基因的表达。
RPS18 的 qPCR，按照 TaKaRa SYBR Premix Ex 
TaqTM II（Perfect Real Time）试剂盒说明，使用 ABI 
PRISM 7500（ABI，USA）进行 Real-time PCR，每
个反应 3 个重复。反应体系总体积为 20 μL，其中
SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μL、上下游引物（10 
μmol/L）各 0.8 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.4 
μL、cDNA 2.0 μL ；灭菌蒸馏水补足体积。反应程序
为：95℃预变性 30 s ；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 个循 
环。反应结束后，确认 qPCR 的熔解曲线鉴定产物
的特异性。
1.2.9  RPS18 基因翻译水平研究  提取不同发育时
期（卵、一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、蛹、雌蝇、
雄蝇）家蝇及家蝇三龄幼虫不同组织（体壁、马氏管、
脂肪体、肠道、唾液腺）总蛋白，用Western-blot 检
测 RPS18 的表达情况。
2 结果
2.1  家蝇pMD18-T/RPS18克隆载体构建 
选用克隆引物进行 PCR 鉴定重组质粒，结果
（图 1 第 1 泳道）显示，提取重组质粒进行测序鉴定，
确定插入片段连接方向正确。
的理论分子量 17 590.5 Da，其等电点为 10.48。280 
nm 处的摩尔消光系数为 16 960 M-1cm-1，0.1% 浓度
的 ABS 为 0.964。若其成熟肽 N-末端为蛋氨酸时，
在哺乳动物网织红细胞体外表达的半衰期为 30 h，
在酵母和大肠杆菌中表达的半衰期分别 >20 h 和 >10 
h。在溶液中 RPS18 的不稳定指数为 47.41，其性质
不稳定，RPS18 的疏水指数为 90.99，疏水性较高 
（图 3）。
2000
bp
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4 5
M：DL2000 DNA Marker ；1 ：克隆重组质粒 PCR；2：表达重组质粒 PCR ； 
3 ：T7F 和 T7R ；4 ：RPS18F 和 T7R ；5 ：T7F 和 RPS18R
图 1 pMD18-T/RPS18 及 pET28a/RPS18 重组质粒 PCR
鉴定
2.2  生物信息学分析
家蝇 RPS18 蛋白基因全长为 459 bp，编码 152
个氨基酸（图 2）。 序列已上传 NCBI GenBank，登
录号：KT006855。ExPASy 中 ProtParam 预测 RPS18
1
46
91
136
181
226
271
316
361
406
451 459
图 2 RPS18 基因开放阅读框 cDNA 序列及对应编码的氨
基酸序列
2.0
1.5
1.0
0.5
0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
Sc
or
e
20 40 60 80
Position
100 120 140
图 3 ProtScaler 软件 RPS18 的疏水性分析
2016,32(6) 139胡亚等：家蝇核糖体蛋白 S18 基因的克隆及表达模式研究
2.3  家蝇pET28a/RPS18表达载体构建
选用组合引物：表达目的基因上游 +下游组合；
质粒 T7 启动子 + 质粒 T7 终止子；目的基因上游 +
质粒 T7 终止子；质粒 T7 启动子 + 目的基因下游进
行 PCR 鉴定重组质粒。结果（图 1 第 2、3、4、5 
泳道）显示，提取重组质粒进行测序鉴定，显示表
达载体构建成功。
2.4  家蝇pET28a/RPS18重组蛋白表达、纯化鉴定
及抗体制备
2.4.1  家蝇 pET28a/RPS18 重组蛋白表达及纯化 
将鉴定为阳性的重组表达质粒导入到表达菌株
Transetta（DE3）中，经终浓度为 0.25 mmol/L 的
IPTG 诱导 18 h 获得重组蛋白。SDS-PAGE 电泳分析
结果（图 4）显示，在约 21 kD 处有外源蛋白表达
条带出现（pET28a 载体 His 标签及部分载体蛋白大
小约为 3.2 kD），与预期分子量一致。将蛋白进行纯
化，结果（图 3第 7泳道）证明目的蛋白纯化成功。
大白兔的抗血清相互作用，在约 21 kD（图 6 第 1、 
2、5、6、9、10 泳道）可见一明显的免疫反应条带，
其大小与预测 RPS18 重组蛋白分子量相近，阴性对
照血清（图 6第 3、4、7、8、11、12 泳道）在相应
的位置未识别出条带，说明制备的多克隆抗体能与
RPS18 蛋白产生特异的免疫印迹反应。
kD
97.2
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
M 1 2 3 4 5 6 7
M：蛋白 Marker ；1 ：pET28a 未经 IPTG 诱导；2：pET28a 经 IPTG 诱导；
3：pET28a/RPS18 未 经 IPTG  诱 导；4：pET28a/RPS18 经 IPTG 诱 导；5：
pET28a/RPS18 经 IPTG 诱导后的沉淀；6：pET28a/RPS18 经 IPTG 诱导后的
的上清；7：pET28a/RPS18 经 IPTG 诱导表达后纯化蛋白
图 4 12% SDS-PAGE 分析 pET28a/RPS18 在大肠杆菌
Transetta（DE3）中表达纯化效果
2.4.2  HIS 单克隆抗体检测 RPS18 重组蛋白  用兔
来源的抗 6×His 单克隆抗体作为 Western-blot 中的
一抗，其能够识别家蝇 RPS18 纯化蛋白，出现特异
性目的条带，结果进一步证实 RPS18 基因原核重组
表达成功，重组蛋白带有His 纯化标签（图 5第 1、2、
5、6、9、10 泳道）。
2.4.3  RPS18 重组蛋白抗血清特异性检测  将纯化
的 RPS18 重组蛋白分别与重组蛋白免疫的新西兰
kD
170
130
96
72
55
43
34
26
17
10
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M：蛋白 Marker ；1，2，5，6，9，10 ：目的蛋白；3，4，7，8，11，12 ：
阴性对照
图 5 His 单克隆抗体鉴定纯化的 RPS18 重组蛋白的表达
kD
170
130
96
72
55
43
34
26
17
10
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M：蛋白 Marker ；1，2，5，6，9，10 ：目的蛋白；3，4，7，8，11，12 ：
阴性对照
图 6 RPS18 重组蛋白的抗血清特异性分析
2.5  RPS18基因转录水平的研究
2.5.1  RT-PCR 检测 RPS18 基因的表达  以家蝇不
同发育时期和三龄幼虫不同组织 cDNA 为模板，进
行 RT-PCR 扩增，均能扩增出特异性条带（图 7，图
8），说明 RPS18 基因在家蝇不同发育时期及不同组
织间呈一致性表达，且表达量较为稳定。
2.5.2  qPCR 检测 RPS18 基因的表达  通过软件
GraphPad Prism 5，采用 CT 值法对 RPS18 基因在家
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6140
蝇生活史中各龄期及不同组织中的表达进行统计学
分析并以 CT Value 为纵坐标、各龄期或三龄幼虫
不同组织为横坐标作图。结果表明，RPS18 基因的
qPCR 分析，CT 值线性范围为 19-21 之间（图 9，
图 10）。
2.6  RPS18基因翻译水平的研究
将提取的家蝇不同发育时期及三龄幼虫不同组
织总蛋白进行 Western-blot 分析，结果（图 11，图
12）显示，约在 21 kD 处均显示有目的蛋白。
3 讨论
选择理想的内参基因对获得准确的基因表达结
果是至关重要的，选择适当的内参基因以减少检测
标本间的差异是必须的［19］，因此内参基因的表达水
平应相对稳定且受环境影响较小。家蝇孳生于杂乱
菌丛的环境中传播疾病，是重要的媒介昆虫，其免
疫防御、免疫协助得到很多研究者的关注，而目前
为止没有一个内参基因能够作为家蝇功能基因研究
的参照和参考依据，但对于其他昆虫（如娥［20］发
现 β-tubulin 和 β-actin 基因在金纹细蛾不同发育阶段
虫态间表达最稳定；β-actin 和 18S 基因在金纹细蛾
成虫不同组织间表达最稳定；蚊［21］rspL40、BTF3
在不同组织中表达最稳定，rspL40、rsp5 在吸血不
M 1 2 3 4 5
2000
bp
1000
750
500
250
100
M：DNA Marker ；1 ：体壁；2：唾液腺；3：肠道；4：脂肪体；5：马氏管
图 7 家蝇不同组织 RPS18 基因的扩增结果
M 1 2 3 4 5 6 7
2000
bp
1000
750
500
250
100
M：DNA Marker；1：卵；2：一龄幼虫；3：二龄幼虫；4：三龄幼虫；5：蛹；
6：雌蝇；7：雄蝇
图 8 家蝇不同发育时期 RPS18 基因的扩增结果
25
20
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图 9 RPS18 基因在家蝇生活史不同发育时期的表达
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图 10 RPS18 基因在家蝇三龄幼虫不同组织的表达
21
kD
M 1 2 3 4 5
M：蛋白Marker ；1 ：体壁；2：唾液腺；3：脂肪体；4：马氏管；5：肠道
图 11 家蝇不同组织 RPS18 蛋白的表达
21
kD
M 1 2 3 4 5 6 7
M：蛋白Marker；1：卵；2：一龄幼虫；3：二龄幼虫；4：三龄幼虫；5：蛹；
6：雌蝇；7：雄蝇
图 12 家蝇不同发育时期 RPS18 蛋白的表达
2016,32(6) 141胡亚等：家蝇核糖体蛋白 S18 基因的克隆及表达模式研究
同时相表达最稳定）已有关于稳定内参基因的相关
报道，此外对于家蝇内参基因的研究仅限于转录水
平［18-22］，且在不同组织及发育时期能够稳定表达，
与本研究结果一致，对于翻译水平，到目前仍未见
相关研究报道。本研究从家蝇幼虫 cDNA 文库中筛
选到核糖体蛋白 S18 基因序列，全长 459 bp，编码
152 个氨基酸，理论分子量为 17 590.5 Da，等电点
为 10.48。成功克隆了 RPS18 基因，并插入 pET28a
表达载体，选用 pET 系统是因为该载体具有很强的
表达重组蛋白的能力，而本实验选用的 pET28a 载
体本身包含 His 序列，使载体表达的重组蛋白含有
His 融合标签，获得高纯度和高浓度的重组蛋白，
并成功制备血清抗体，His 单抗鉴定及抗血清特异
性分析其均可见单一条带。本研究从转录水平和翻
译水平上对家蝇不同发育时期、三龄幼虫不同组织
间 RPS18 基因的表达稳定性进行了研究，结果显
示 RPS18 基因在家蝇不同发育时期及幼虫不同组织
间均能够稳定表达。综合分析显示，该基因在家蝇
不同发育时期及幼虫不同组织均保持了较好的表达
稳定性，同时在一定程度上证明此次家蝇内参基因
筛选结果的准确性和可靠性，但对于不同胁迫条件 
（冷、热刺激、微生物感染等）下该基因的稳定性有
待进一步研究。本研究将为今后家蝇基因表达的研
究提供依据和参照，为进一步对家蝇功能基因的研
究奠定基础。
4 结论
本研究成功构建 pET28a/RPS18 重组原核表达
载体并表达出 RPS18 蛋白，获得纯化蛋白及其抗体。
在转录和翻译水平上证明，RPS18 基因在家蝇不同
发育时期及幼虫不同组织间均保持了较好的表达稳
定性，同时证实此次家蝇内参基因的筛选结果是准
确可靠的。
参 考 文 献
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（责任编辑  马鑫）