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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):148-154
收稿日期 ：2015-09-03
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81260333），新疆自治区高技术研究发展项目（201110102）
作者简介 ：马晓玲，女，硕士研究生，研究方向 ：肿瘤免疫诊断和治疗的分子基础研究 ；E-mail ：1239598355@qq.com
通讯作者 ：李江伟，男，教授，研究方向 ：肿瘤免疫诊断和治疗的分子基础研究 ；E-mail ：jwli67@sina.com
携带人卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗的构建及其
免疫效应检测
马晓玲  刘红春  李江伟
（新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046）
摘 要 ： 制备携带卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗，并研究其对小鼠的免疫效应。将卵泡刺激素受体胞外区（fshr366）
基因克隆到慢病毒载体上，采用脂质体转染法将重组质粒转染至 293T 细胞中，包装并产生含有目的基因的病毒颗粒 ；分别利用
RT-PCR 和 Western blot 检测感染病毒颗粒的 293T 细胞中 fshr366 在 mRNA 水平及蛋白水平的表达情况 ；用携带 fshr366 的病毒颗
粒单次腹腔免疫 BALB/c 小鼠，分别在免疫 0、14、21 和 28 d 对小鼠眼眶采血，ELISA 法检测免疫小鼠血清的特异性并测定抗体
滴度。酶切和测序结果表明 fshr366 基因片段成功构建到慢病毒载体上。将包装产生的携带 fshr366 的慢病毒颗粒感染 293T 细胞后，
RT-PCR 和 Western blot 检测结果表明细胞在转录水平和蛋白水平均表达 fshr 基因。ELISA 结果显示携带 fshr366 的慢病毒颗粒单次
腹腔免疫小鼠后，免疫 14 d 就激起了机体的体液免疫反应，抗体滴度达到 1∶1 600。成功制备了携带卵泡刺激素受体的慢病毒载
体疫苗，其可以在小鼠体内激发 FSHR 抗原特异的早期持续性免疫反应。
关键词 ： 卵泡刺激素受体 ；慢病毒载体 ；疫苗 ；体液免疫反应
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.024
Development of a Lentivirus Vector-based Vaccine Carrying Follicle-
stimulating Hormone Receptor and Assay of Its Immunological Effect
MA Xiao-ling LIU Hong-chun LI Jiang-wei
（Key Laboratory of Xinjiang Biological Resources and Gene Engineering，College of Life Sciences and Technology，Xinjiang University，
Urumqi 830046）
Abstract: This work aims to prepare lentivirus vaccine with a follicle-stimulating hormone receptor（FSHR）and investigate the
immunological effect of it on mice. The gene（fshr366）of extracellular region of FSHR was cloned into lentivirus vector. The recombinant
plasmids were transfected into the 239T cells by the method of lipidosome transfection，and the virus particles（Lenti-FSHR366）with target
gene were produced after encapsulation. The expressions of fshr366 mRNA and FSHR366 protein in 293T cells infected by Lenti-FSHR366 were
detected by RT-PCR and Western blot. For evaluating the immunological effects，BALB/c mice were intraperitoneally inoculated with single
immunization of fshr366-carring virus，collecting the blood samples from the orbits of mice at day 0，14，21 and 28 after immunization，then
ELISA method was used to detect the specificity of the sera from immunized mice and determine the titer of the antibody. The RE digestion and
DNA sequencing results showed the gene fragment of fshr366 was successfully cloned into lentivirus vector. After transfection to 293T cells with
the encapsulated lentivirus particles carrying fshr366，the detection results by RT-PCR and Western blot indicated the expression of gene fshr
in the cells at transcription and protein level. The results of ELISA revealed that the humoral immune response in mice rose on day 14 after single
immunization through intraperitoneally injection of lentivirus particles carrying fshr366，the titer of antibody was 1∶1 600.
Key words: follicle-stimulating hormone receptor ；lentivirus vector ；vaccine ；humoral response
2016,32(3) 149马晓玲等：携带人卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗的构建及其免疫效应检测
卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）
在人类生殖过程中发挥着重要作用，是促进和维
持正常的性腺发育和生殖功能的重要激素［1］，其
生理功能是通过与卵巢颗粒细胞膜表面的特异性
受体即卵泡刺激素受体（follicle-stimulating hormone
receptor，FSHR） 的 结 合 来 发 挥 的［2］。FSHR 是 一
种跨膜糖蛋白，属于 G 蛋白偶联受体超家族中的糖
蛋白亚家族成员。人的 FSHR 由 695 个氨基酸组成，
其中氨基端 17 个氨基酸为疏水性信号肽，紧接着是
FSHR 的胞外区由 349 个氨基酸构成，其后是 264 个
氨基酸构成的跨膜区，胞内区是 65 个氨基酸组成的
羧基末端［3］。以往对 FSHR 与肿瘤关系的研究主要
集中于卵巢癌，但是最新研究发现 FSHR 除了在卵
巢癌中表达，在其他多种实体瘤血管内皮细胞中也
都有表达，但是在邻近的正常组织中不表达［7］，推
测 FSH 与其受体 FSHR 可能通过不同信号途径参与
促进肿瘤血管形成作用［8］。初步研究表明 FSHR 有
可能作为潜在的肿瘤治疗靶点和肿瘤诊断以及愈后
分子标志物［9，10］。因此，制备基于 FSHR 靶点的抗
体对肿瘤的诊断以及治疗都有重要的意义。
本研究中采用的慢病毒表达载体是以人类免疫
缺陷 I 型病毒（HIV-1）为基础发展起来的基因治疗
载体［11］。它具有可以感染非分裂期细胞、容纳外
源性大基因片段、基因导入效率及表达水平高等优
点［12］，慢病毒载体介导的转基因的表达能持续数
月［13］，从而达到良好的基因治疗效果。
本实验构建了携带人卵泡刺激素受体胞外区的
慢病毒载体疫苗，将包装出的携带卵泡刺激素受体
胞外区的慢病毒颗粒单次免疫小鼠研究其体液免疫
效应，旨在为进一步研究靶向人卵泡刺激素受体的
慢病毒载体疫苗的抗肿瘤机制和效果奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实 验 材 料 pCMV-SPORT6-FSHR 质 粒 购 自
长 沙 赢 润 生 物 技 术 有 限 公 司 ；质 粒 Lenti-EGFP、
pCMV-dR8.91、pCMV-VSVG 购 自 上 海 斯 丹 赛 生 物
技术有限公司 ；大肠杆菌菌株 DH5α 和 293T 细胞
为新疆生物资源基因工程重点实验室提供 ；6-8 周
BALB/c 小鼠，购买于新疆医科大学。
1.1.2 工具酶和主要试剂 Pfx 聚合酶为 Invitrogen
公司产品 ；T4 连接酶、各种限制性内切酶和逆转录
酶为 Fermentas 公司产品 ；质粒小提试剂盒、PCR
产物纯化试剂盒、DNA 胶回收试剂盒购自上海生工
生物工程有限公司 ；兔抗 FSHR 多克隆抗体为上海
江莱生物科技有限公司产品 ；抗 β-actin 鼠单克隆抗
体、羊抗兔 HRP-IgG 单克隆抗体、羊抗鼠 HRP-IgG
单克隆抗体为北京康为世纪生物科技有限公司产品；
Opti-MEM 培养基、DMEM 培养基和胎牛血清购自
GIBCO 公司。脂质体转染试剂为 Promega 公司产品；
polybrene 为 Sigma 公司产品 ；其他试剂均为国产分
析纯。
1.2 方法
1.2.1 FSHR 胞 外 区 的 扩 增 以 pCMV-SPORT6-
FSHR 质粒作为 PCR 扩增 FSHR 胞外区基因序列的
模板，根据 FSHR 胞外区基因序列设计引物 ：P1 ：
5-GGCCTGATCAGCCACCATGGCCCTGCTCCTGGT-
CTC-3 包含 Bcl Ⅰ酶切位点，P2 ：5-CCGGGCTAG-
CTCTGAGGATGTTGTACCCCATG-3 包 含 酶 切 位 点
Nhe Ⅰ，此引物扩增的序列为 FSHR 胞外区加信号
肽 的 基 因 序 列（ 即 FSHR 第 1-366 位 氨 基 酸， 共
1 098 bp，将扩增出的片段简称为 fshr366）。
1.2.2 基因克隆、构建及测序 用限制性内切酶
BamH Ⅰ（Bcl Ⅰ的同尾酶）和 Nhe Ⅰ双酶切慢载体
Lenti-EGFP，切胶回收载体。用 Bcl Ⅰ和 Nhe Ⅰ双
酶切 fshr366 基因片段。回收纯化步骤参考上海生工
DNA 胶回收试剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒说明书。
连接产物转化 DH5α 感受态细胞，挑取单克隆，对
PCR 以及双酶切鉴定为阳性的重组子进行测序。
1.2.3 重 组 质 粒 的 转 染 及 编 码 fshr366 的 慢 病 毒
的包装 将提取的无菌处理过的重组质粒 Lenti-
fshr366/Lenti-EGFP∶pCMV-VSVG∶pCMV-dR8.91 按
4∶2∶3 质量比例混于 37℃预热的 Opti-MEM，Opti-
MEM∶三质粒总质量 =50∶1（μL/μg）。充分混匀离
心后将恢复到室温的 fugene HD 转染试剂与三质粒
总质量的比为 3∶1（μL/μg）加到液面下吹打混匀。
室温静置 15 min 后，将混合液滴加到预铺的 293T
细胞中摇匀。分别收集 48-96 h 的病毒上清，用 0.45
μm 滤器过滤，过滤后上清即病毒液。得到空白对照
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3150
病毒液以及含 FSHR 基因的病毒液。
1.2.4 RT-PCR 检测慢病毒 Lenti-fshr366 感染的 293T
细胞中 FSHR 基因的表达 收集未感染的 293T 细胞
和感染了携带 fshr366 的慢病毒颗粒的 293T 细胞，
加入 Trizol 充分裂解细胞后提取细胞的总 RNA，反
转录合成 cDNA。以 cDNA 为模板，fshr366 的上游
引 物 为 ：fshr366-5-AAATCTTAAGAAGCTGAGGGC-
CA-3，下游引物为 ：fshr366-5-GATGAAGCTCAGA-
GATTTGCCG-3 ；内 参 基 因 G3PD 的 上 游 引 物 为 ：
G3PD-5-AGGTCGGAGTCAACGGATTTGG-3， 下 游
引 物 为 ：G3PD-5-AGGCTGTTGTGATACTTCTCATG-
G-3。PCR 扩增慢病毒 Lenti-fshr366 感染的 293T 细
胞中 fshr 基因以及内参基因的表达。
1.2.5 Western blot 检测慢病毒 Lenti-fshr366 感染的
293T 细胞中 FSHR 蛋白表达 收集 293T 细胞、空载
病毒颗粒感染的 293T 细胞和携带 fshr366 的慢病毒
颗粒感染的 293T 细胞，加入细胞裂解液将细胞吹散，
在冰上裂解 10 min 后，12 000 r/min 离心 5 min，弃
细胞碎片，从上清中收集蛋白质。上清经 12％ SDS-
PAGE 凝胶电泳，转膜，3％ BSA 封闭过夜，PBST
洗 5 次后，加入一抗兔抗人 FSHR 多克隆抗体，室
温孵育 2 h，PBST 洗 3 次，加入二抗 HRP-羊抗兔
IgG，室温孵育 1 h 后化学发光显色，观察目的蛋白
的表达情况。
1.2.6 重组慢病毒疫苗对小鼠的免疫效应研究 将
BALB/c 小鼠分为 3 组，每组 7 只，分别为 A、培养
基对照组 ；B、空载体慢病毒组 ；C、携带 fshr366
的慢病毒组。分别单次、腹腔注射 ：A、100 μL 含
10％胎牛血清的 DMEM 培养基 ；B、100 μL 含相当
于 500 ng/mL p24 抗原的空载慢病毒颗粒 ；C、100
μL 含相当于 500 ng/mL p24 抗原的携带 fshr366 的慢
病毒颗粒。分别在免疫第 0、14、21 和 28 d 小鼠眼
眶取血，分离血清，ELISA 检测小鼠血清中 IgG 抗
体特异性及抗体滴度。其中 FSHR 抗原包被浓度为
8 μg/mL，一抗为不同稀释比例的小鼠血清，二抗为
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L），其稀释比例为
1∶5 000。终止后使用酶标仪于 450 nm 处测量 OD
值，采用 GraphPad Prism5.0 进行分析。
2 结果
2.1 目的基因fshr366的PCR扩增及纯化回收
以 pCMV-SPORT6-FSHR 质粒为 PCR 模板，用
P1、P2 引物 PCR 扩增获得 fshr 包含信号肽的胞外区
的目的基因 fshr366，电泳结果（图 1）显示，在约
1 098 bp 附近处有明显条带。
bp
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6
1098
bp
M ：DNA 分子量标准（DS5000）；1 ：阴性 ；2-6 ：PCR 产物
图 1 PCR 扩增目的基因 fshr366
2.2 目的基因fshr366与载体的酶切、纯化回收
用限制性内切酶 BamH Ⅰ和 Nhe Ⅰ对慢载体
Lenti-EGFP 进行双酶切，用 Bcl Ⅰ（BamH Ⅰ同尾酶），
Nhe Ⅰ对目的基因 fshr366 进行双酶切。凝胶电泳结
果（图 2）显示，酶切结果正确（Lenti-EGFP 为 7.8
kb 和 911 bp，fshr366 为 1 098 bp）。将载体和目的基
因的酶切产物进行切胶回收，得到条带大小正确的
单一的条带。
2.3 重组质粒Lenti-fshr366的鉴定
将重组质粒转化入 DH5α 感受态细胞中，随机
挑取单克隆进行菌液 PCR 扩增鉴定正确重组的基因
克隆，如图 3 所示。因为载体上的 BamH Ⅰ和基因
上的 Bcl Ⅰ为同尾酶，同尾酶连接后，酶的识别位
点改变，所以选用载体和目的基因上都有的酶切位
点 EcoR V 来进行酶切鉴定，载体上在 4 253 bp 处有
EcoR V 酶切位点，目的基因在 1 074 bp 处有 EcoR V
酶切位点，重组质粒酶切后的条带预期大小为 1.3
kb 和 7.5 kb，选取 PCR 鉴定阳性的质粒用 EcoR Ⅴ
进行单酶切鉴定，符合预期片段大小，结果如图
4 所示。对阳性重组基因进行测序，测序结果显示
2016,32(3) 151马晓玲等：携带人卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗的构建及其免疫效应检测
fshr366 已正确连接到慢病毒载体上。
2.4 携带fshr366的慢病毒颗粒的包装及感染
采用脂质体转染法将 Lenti-fshr366/Lenti-EGFP、
pCMV-VSVG、pCMV-dR8.91 共 转 染 入 293T 细 胞，
转染 24 h 后，收集含有病毒颗粒的培养基，即得到
含有目的基因 fshr366 的病毒和空载的病毒（图 5）。
2.5 RT-PCR检测fshr366基因在293T细胞中的表达
收 集 未 感 染 的 293T 细 胞 及 感 染 携 带 fshr366
的 慢 病 毒 颗 粒 的 293T 细 胞， 提 取 各 组 细 胞 中 的
总 RNA，反转后进行 RT-PCR，结果（图 6）显示
fshr366 在携带 fshr366 的慢病毒颗粒感染的 293T 细
胞中表达量明显高于未转染的 293T 细胞组。
2.6 Western blot检测FSHR366蛋白在293T细胞中
的表达
分别用空载慢病毒颗粒和携带 fshr366 的慢病毒
10000
bp
7000
4000
2000
1000
500
250
bp
10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
bp
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
M1 1
911
7800
bp
M2 2
7800
bp bp
M3 3
1098
A B C
A ：M1 ：DNA 分子量标准（DL10000）；1 ：Lenti-EGFP 载体 BamH Ⅰ和 Nhe Ⅰ双酶切产物。B ：M2 ：DNA 分子量标准（DL10000）；
2 ：Lenti-EGFP 载体 BamH Ⅰ和 Nhe Ⅰ双酶切产物的回收。C ：M3 ：DNA 分子量标准（DL1500）；3 ：fshr366 的酶切产物
图 2 Lenti-EGFP 载体和目的基因 fshr366 的酶切及回收
bp
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8
1098
bp bp
10000
7000
4000
2000
1000
500
250
M 1
7500
bp
1300
M ：DNA marker（DS5000）；1 ：阴性对照 ；2-8 ：随机挑选克隆
图 3 菌液 PCR 鉴定重组质粒 Lenti-fshr366
M ：DNA 分子量标准（DL10000）；1 ：重组质粒 EcoR Ⅴ酶切鉴定
图 4 重组质粒 Lenti-fshr366 的酶切鉴定
A
B
图 5 空质粒 Lenti-EGFP（A）和重组质粒 Lenti-fshr366
（B）转染 293T 细胞（10×）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3152
颗粒感染 293T 细胞，感染 48 h 后收集并裂解细胞，
Western blot 结果（图 7）显示，与空载慢病毒颗粒
转染组和未转染 293T 细胞相比较，只有携带 fshr366
的慢病毒颗粒感染的 293T 细胞中有 FSHR366 蛋白
的表达。
激起小鼠的体液免疫反应有一定的影响。但免疫后
14、21 和 28 d，实验组与空载病毒组相比差异显著
（P<0.05），与培养基组相比差异极显著（P<0.01）。
数据结果（图 8）表明，携带 fshr366 的病毒颗粒单
次免疫 BALB/c 小鼠后能激起小鼠的体液免疫反应。
根据抗体滴度测定结果（图 9）显示，实验组免疫
后 14 d 和 21 d 抗体的滴度均为 1∶1 600，在 28 d
时达到 1∶3 200，表明此慢病毒疫苗激起早期的持
续性体液免疫反应。
bp
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
M
G3PD fshr366
1 2 3 4 5 6
M ：DNA 分子量标准（DL1500）；1，4 ：Lenti-fshr366 转染组的 G3PD 基因
和 fshr366 的表达 ；2，5 ：293T 细胞组 G3PD 基因的表达和 fshr366 的表达 ；
3，6 ：H2O
图 6 RT-PCR 检测 293T 细胞中 fshr366 的表达
1
FSHR366
β-actin
2 3
1 ：未转染 293T 细胞组 ；2 ：Lenti-EGFP 空载体转染组 ；3 ：Lenti-fshr366 转
染组
图 7 Western blot 检测感染携带 fshr366 的慢病毒颗粒感
染的 293T 细胞中 FSHR366 蛋白的表达
0 7 14 21ݽ⯛ཙᮠd
ษޫส㓴
Lenti-EGFPⲴធᙗ⯵∂仇㋂
Lenti-fshr366Ⲵធᙗ⯵∂仇㋂
28
O
D
45
0
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
图 8 ELISA 检测小鼠血清中 IgG 抗体水平
0.3
0.2
0.1
0
O
D
45
0n
m
0 4
ݽ⯛ਾ㹰␵ ݽ⯛ࡽ㹰␵
8 12 16㹰␵〰䟺∄ֻ×10020 24 28 32 36
图 9 ELISA 测定 fshr366 的病毒颗粒免疫 28 d 小鼠血清
中抗体的滴度
3 讨论
人类免疫缺陷病毒 -1（HIV-1）来源的慢病毒
载体是目前基因治疗中研究较多的载体，近来在疫
苗研制领域也显现出极大的应用潜力［14］。与通常使
用的腺病毒、腺相关病毒以及逆转录病毒载体相比，
具有感染非分裂期细胞及容纳外源性目的基因片段
大和免疫源性低等优点。本研究针对 FSHR 基因构
建慢病毒载体疫苗，进一步证明了慢病毒载体可以
2.7 ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平
分别用培养基、空载病毒颗粒、携带 fshr366 的
病毒颗粒单次腹腔免疫 BALB/c 小鼠，在免疫第 0、
14、21 和 28 天对小鼠进行眼眶取血，用 FSHR349
蛋白作为抗原，ELISA 检测血清中 IgG 抗体特异性
及抗体滴度。
利用 Graphpad Prism 5 对 ELISA 结果进行单因
素方差分析后得出，在小鼠血清稀释比例为 1∶200
时，检测携带 fshr366 的病毒颗粒免疫的小鼠的血
清抗体水平，发现在第 14、21 和 28 天的抗体水平
与免疫前相比有显著差异（P<0.05）。空载病毒颗粒
免疫的小鼠免疫 14、21 和 28 天后与免疫前相比抗
体水平有显著差异（P<0.05），表明空载病毒颗粒对
2016,32(3) 153马晓玲等：携带人卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗的构建及其免疫效应检测
作为激发体液免疫反应的有效工具。
以往基于慢病毒载体的疫苗的研究主要用于产
生细胞免疫反应［15-18］，作为产生体液免疫反应的应
用并不多见，但 Iglesias 等［19］通过构建基于西尼罗
病毒的 E 型包膜糖蛋白的慢病毒载体疫苗，首次研
究了慢病毒疫苗激起机体特异性和保护性的体液免
疫。本研究结果扩展了慢病毒载体疫苗的应用，更
有价值的是，在本研究中我们构建的携带 FSHR 胞
外区的慢病毒载体疫苗，仅通过单次小剂量的病毒
颗粒免疫小鼠便得到了持续时间达到 28 d 的抗体
反应，抗体滴度达到 1∶3 200。这些结果与 Iglesias
等［19］的研究相类似，表明慢病毒载体可以激发早期、
持续性的体液免疫反应。由此显示，慢病毒载体具
有作为一种主动免疫疫苗载体的潜能。
本实验所研究的靶点为 FSHR，FSHR 以往被
认为主要表达在生殖细胞中，其与配体 FSH 共同
作用促进卵巢内卵泡的发育。但由于 FSHR 本身结
构的多态性及在正常组织及癌变组织中表达的差
异性［20］，使得 FSHR 与卵巢癌的发生发展有一定
的联系。Zhang 等［21］通过 FSH 肽将抗肿瘤药物紫
杉醇靶向导入 FSHR 阳性的卵巢癌细胞，在体内外
获得了显著的抗肿瘤效应，同样，董俊等［22］通过
FSH 肽将卵巢癌发生发展相关的趋化因子 1（CXC-
L1）的 siRNA 靶向导入 FSHR 阳性的卵巢癌细胞，
抑制了卵巢癌细胞的生长、迁移及侵袭，都证明
了靶向 FSHR 的治疗方法是可行且有效的。最近
又发现 FSHR 在多种实体瘤血管内皮细胞内特异表
达，这强烈提示 FSHR 可以作为肿瘤治疗的一个很
好的切入点，激起了研究人员对该蛋白新的研究兴
趣。Stilley 等［23］发现，FSH 与其受体结合可以促进
HUVEC 细胞的血管形成作用。本研究通过构建的携
带 FSHR 的慢病毒疫苗初步证明，该疫苗可以激发
持续的抗 FSHR 抗体，其产生的抗体有望阻断肿瘤
血管细胞表面 FSHR 与配体的结合从而可能获得抗
肿瘤效应。关于这一部分工作需要后期进一步的抗
肿瘤动物实验验证。
4 结论
本研究构建了携带 FSHR 的慢病毒载体疫苗，
单次腹腔免疫 BALB/c 小鼠，ELISA 结果显示在免疫
28 d 时抗体滴度达到 1∶3 200，说明疫苗在小鼠体
内获得了持续的体液免疫反应。证明了慢病毒载体
疫苗在激起机体体液免疫方面具有的潜在应用价值。
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（责任编辑 李楠）