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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):231-236
收稿日期 ：2014-08-25
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81202084），教育部科学技术研究重点项目（212047）
作者简介 ：温宪春，男，硕士，研究方向 ：肿瘤药理学 ；E-mail ：wenxianchun@sina.com
通讯作者 ：岳丽玲，女，教授，硕士生导师，研究方向 ：肿瘤分子生物学 ；E-mail ：yuell1025@126.com
FUT8 基因 RNAi 慢病毒载体的构建及对 MCF-7 细胞
增殖的影响
温宪春1  韩翠翠1  赵月生2  于海涛1  李成冲1  岳丽玲1
（1. 齐齐哈尔医学院 医药科学研究中心，齐齐哈尔 161006 ；2. 齐齐哈尔医学院附属第三医院 乳腺外科，齐齐哈尔 161006）
摘 要 ： 旨在构建 FUT8 基因 RNA 干扰（RNAi）慢病毒载体并观察其对人乳腺癌细胞 MCF-7 增殖的影响。针对 FUT8 基因
设计 3 组短发夹 RNA 序列，退火合成双链 DNA，通过连接线性化的 pGC-LV-GFP 载体，构建 miRNA 慢病毒载体质粒，并将其转
化至感受态细胞 DH5α ；测序验证正确后进行 FUT8 基因慢病毒载体的包装及病毒滴度测定，将获得的重组慢病毒 pGC-shFUT8 转
染 MCF-7 细胞，利用 Real time-PCR、Western blot 分别验证转染后 MCF-7 细胞中 FUT8 mRNA 及蛋白的表达，MTT 法及克隆形成
实验检测 shFUT8 对 MCF-7 细胞增殖能力的影响。测序证实成功构建针对 FUT8 基因的 RNAi 慢病毒载体 ；慢病毒载体经 293T 细
胞包装成功，测定病毒悬液滴度＞ 5×108 TU/mL ；荧光显微镜下观察各转染组细胞 GFP 的表达，转染效率达 90% 以上 ；Real-time
PCR、Western blot 结果显示干扰组 FUT8 的 mRNA 及蛋白表达水平较对照组显著降低，其中 pGC-shFUT8-2 序列对 FUT8 基因的干
扰效率可达 80%，干扰效果最佳，FUT8 沉默后 MCF-7 细胞增殖能力下降。
关键词 ： FUT8 基因 ；慢病毒载体 ；RNA 干扰 ；MCF-7 细胞
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.035
Construction of FUT8 Gene Lentiviral RNA Interference Vector and
Regulation on Proliferation of Human Breast Cancer Cells MCF-7
Wen Xianchun1 Han Cuicui1 Zhao Yuesheng2 Yu Haitao1 Li Chengchong1 Yue Liling1
（1. Research Center of Medical Science，Qiqihar Medical College，Qiqihar 161006 ；2. Breast Surgery，the Third Affiliated Hospital of
Qiqihaer Medical College，Qiqihar 161006）
Abstract: This study aimed to construct the lentiviral RNA interference（RNAi）vector of human FUT8 gene and determine its effect
on proliferation of human breast cancer cells MCF-7. Designing three short hairpin RNA（shRNA）sequence targeting the FUT8 gene, and then
synthesizing the complementary DNA chains containing the target sequence, miRNA lentiviral vector plasmid with linear pGC-LV-GFP carriers
were constructed and then transformed to DH5α cells. After identified by sequencing, then packaging lentiviral vectors and measuring the virus
titer were done. The recombinant lentiviral vector pGC-shFUT8 was transfected into human MCF-7 cells, and then the expression of FUT8 in
transfected MCF-7 cells was detected by real time-PCR and Western Blotting. The effect of shFUT8 on MCL-7 cell proliferation was measured
by MTT assay and colony formation experiment. Gene sequencing confirmed the successful construction of RNAi lentiviral vector targeting the
FUT8 gene. The lentiviral vectors were packed successfully by 293T cells and the virus titer was more than 5×108 TU/mL. Expressed GFP in
transfected cells were observed under the fluorescence microscope, and the transfection efficiency was over 90%. Real-time PCR and Western
Blotting analysis indicated that the expression levels of FUT8 mRNA and protein in the transfected group significantly reduced when comparing
with the negative control group. Particularly the pGC-shFUT8-2 sequence could interfere 80 % of FUT8 gene expression. The proliferation of
MCF-7 decreased after FUT8 was inactive.
Key words: FUT8 gene ；Lentiviral vector ；RNA interference ；MCF-7cells
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5232
糖基化是最常见的翻译后修饰反应之一，糖基
化异常直接影响细胞的识别、黏附、迁移及侵袭等
生物学特性，与肿瘤的发生、发展密切相关。α-1，6
岩 藻 糖 基 转 移 酶（α1，6-fucosyltransferase，FUT8）
是岩藻糖基转移酶基因超家族的一员，其通过形成
α-1，6 糖苷键催化岩藻糖基由 GDP-Fuc 转移至糖蛋
白 N-连接寡糖的核心结构 GlcNAc 上，形成核心岩
藻糖［1］。这种核心岩藻糖基化修饰普遍存在于糖蛋
白中，被认为是对糖蛋白进行重要的翻译后修饰和
功能调控的一种方式［2］。然而，在多种肿瘤恶性演
进的过程中，FUT8 的活性和表达量会逐渐增加［3-8］，
但 FUT8 作用的特异性底物以及核心岩藻糖基化修
饰在乳腺细胞恶性变过程中所发挥的具体生物学功
能尚不清楚。本研究采用 RNA 干扰技术构建针对人
FUT8 基因的慢病毒表达载体，并在人乳腺癌细胞
MCF-7 中表达，旨在为进一步深入研究 FUT8 基因
功能及在乳腺癌发生发展中的作用奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
人乳腺癌 MCF-7 细胞、293T 细胞购自上海中
科院细胞库，DH5α 感受态细胞由本室保存，慢病
毒 载 体 质 粒 pGC-LV-GFP、pHelper1.0、pHelper2.0
为上海吉凯基因化学技术有限公司产品 ；T4 DNA
连接酶、限制性内切酶 Age I 和 EcoR I 购自 NEB，
Lipofectamine 2000、Trizol（Invitrogen 公 司 ）， 质 粒
大提试剂盒（QIAGEN 公司），Taq polymerase、凝胶
回收试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa 公
司），胎牛血清、MEM 培养基（Gibco 公司），FUT8
鼠抗人多克隆抗体（Santa 公司）、HRP 标记的羊抗
鼠 IgG（CST 公司）。Positive clone 测序由上海美季
生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 靶 向 FUT8 基 因 的 shRNA 慢 病 毒 表 达 载 体
的 构 建 从 GenBank 查 找 FUT8 基 因 序 列（GI ：
NM_004480），应用 Ambion 公司的 RNA 干扰设计软
件，设计 3 条针对人 FUT8 基因的特异性 shRNA 序
列（表 1），以通用序列（negative control，NC）作
为阴性对照。将合成好的单链 DNA 退火形成双链
DNA，通过 T4 DNA 连接酶连接线性化的 pGC-LV-
GFP 载体，并转化至感受态细胞 DH5α，菌落 PCR
筛选重组阳性克隆进行测序鉴定。
表 1 针对 FUT8 基因的 3 个 siRNA 靶序列
序列号 shRNA 序列（5-3）
FUT8-shRNA-1 TGGAGTGATCCTGGATATA
FUT8-shRNA-2 CTATAATGACGGATCTATA
FUT8-shRNA-3 ACAATCAAATTGCCATTTA
1.2.2 RNAi 慢病毒的包装 取对数生长期的 293T
细胞按照 1.2×107 个接种于 15 cm 培养皿中，待细
胞达 70%-80% 融合时进行转染。取 20 μg 慢病毒
表 达 质 粒 pGC-LV-GFP-shFUT8、15 μg 的 pHelper
1.0 质 粒、10 μg 的 pHelper 2.0 质 粒 与 2.5 mL Opti-
MEM 混匀后，脂质体 Lipofectamine 2000 介导转染
293T 细胞，培养 8 h 后换为完全培养基，继续培养
48 h 后收集含慢病毒颗粒的细胞上清液，于 4℃，
4 000×g 离心 10 min，上清液用 0.45 μm 滤器过滤，
得到的病毒原液命名为 pGC-shFUT8，分装后 -80℃
保存备用。
1.2.3 孔稀释法测定病毒滴度 滴度测定前 1 d，以
8×103 cells/ 孔的密度接种 293T 细胞于 96 孔板，体
积 100 μL。将 10 μL 病毒储存液加入 90 μL 的无血
清培养基中，在 EP 管中做 10 倍梯度稀释，连续 10
个稀释度。选取细胞孔，吸去 90 μL 的原培养基，
然后在每孔中加入 90 μL 慢病毒稀释液，每个稀释
度重复 3 孔，24 h 后每孔加入 100 μL 完全培养基。
4 d 后根据 GFP 表达情况，以最大稀释倍数孔计算
病毒原液滴度，计算公式 ：病毒滴度（TU/mL）= 荧
光细胞个数 ×1 000/ 孔的病毒原液量（μL）。
1.2.4 重组慢病毒感染 MCF-7 细胞 将人乳腺癌
MCF-7 细胞以 4×104 cells/ 孔的密度接种于 6 孔板培
养，细胞 80% 以上融合时进行病毒感染。以预试验
得到的重组慢病毒的最佳 MOL 值 100 侵染人 MCF-7
细胞，同时设立不加病毒的空白对照组和转染病毒
空载体的阴性对照组，8 h 后更换细胞上清为新鲜培
养基。
1.2.5 实 时 PCR 检 测 MCF-7 细 胞 FUT8 mRNA 表
达 转染 96 h 后收集细胞，Trizol 提取细胞总 RNA。
取 1 μg 总 RNA 进 行 逆 转 录 反 应，PCR 反 应 利 用
ABI7300 荧光定量 PCR 仪进行。PCR 反应引物序列
2015,31(5) 233温宪春等：FUT8 基因 RNAi 慢病毒载体的构建及对MCF-7 细胞增殖的影响
如下 ：FUT8 上游引物 ：5-CCATTTCAGGTTTGTTT-
GGTAG-3 ；下 游 引 物 5-ATTGGTCCCGCTTCTCAC-
TT-3 ；内参 β-actin 上游引物为 5-CTGGGACGACA-
TGGAGAAAA-3，下游引物为 5-AAGGAAGGCTGG-
AAGAGTGC-3。PCR 反应条件 ：95℃预变性 30 s ；
95℃变性 5 s，60℃退火 30 s，共 40 个循环。
1.2.6 Western blot 检测 MCF-7 细胞 FUT8 蛋白表达
转染 96 h 后收集各组细胞，加入 RIPA 裂解液，
提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。取 20 μg
总蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，转 PVDF 膜，封闭液
室 温 封 闭 2 h 后 依 次 加 入 鼠 抗 人 FUT8 一 抗（1∶
200），HRP 标 记 的 羊 抗 鼠 二 抗（1∶3 000），TBST
洗膜后 ECL 显色，暗室曝光。以 GAPDH 作为内参，
检测各蛋白条带吸光强度，AFUT8/GAPDH 的比值表示
FUT 8 蛋白相对表达量。
1.2.7 MTT 法分析细胞增殖能力 各组分别取对数
生长期细胞，以每孔 3×103 cells/200 μL 接种于 96
孔板，37℃常规培养 7 d，每天每组取 4 个平行孔细胞，
加入 MTT 液（20 μL/ 孔），继续培养 4 h 后，弃上清，
每孔加入 150 μL DMSO，充分震荡后酶标仪 490 nm
波长处测定 OD 值，绘制细胞生长曲线图。试验重
复 3 次。
1.2.8 平板克隆形成试验 取对数生长期的细胞，胰
酶消化并吹打成单细胞悬液，以 3×103 cells/ 孔的细
胞数接种于 6 孔板中，每组细胞设 3 个复孔。37℃，5%
CO2 静置培养 2-3 周。PBS 清洗，甲醇固定 15 min，
0.2% 结晶紫染色 20 min，流水冲去染液。显微镜下
计数大于 50 个细胞的克隆数，计算克隆形成率 ：克
隆形成率（%）= 克隆数 / 接种细胞数 ×100%。
2 结果
2.1 重组慢病毒载体的测序鉴定
将 3 组重组载体的阳性克隆进行 DNA 测序，测
序结果表明插入片段与设计的 shRNA 核苷酸序列完
全一致（图 1），说明已成功构建针对 FUT 8 基因的
重组慢病毒载体 pGC-LV-GFP-shFUT8。
380 390 400 410370
380 390 400 410370
380 390 400 410370
C
B
A
A ：FUT8-shRNA-1 序列 ；B ：FUT8-shRNA-2 序列 ；C ：FUT8-shRNA-3 序列
图 1 慢病毒重组载体 pGC-LV-GFP-shFUT8 的测序结果
A B C
A ：转染 pGC-shFUT8-1 组 ；B ：转染 pGC-shFUT8-2 组 ；C ：转染 pGC-shFUT8-3 组
图 2 重组慢病毒载体转染 293T 细胞后观察绿色荧光蛋白表达（40×）
2.2 重组慢病毒的滴度测定
荧光显微镜下观察，重组慢病毒载体转染 293T
细胞 48 h 后各转染组细胞均可见强绿色荧光（图
2），说明转染成功。将病毒原液倍比稀释分别感染
293T 细胞后，计数各孔中表达绿色荧光的细胞数，
本试验最终测得 pGC-shFUT8-1、2、3 病毒原液滴度
值分别为 8×108、1×109 和 5×108 TU/mL，表明病
毒包装成功。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5234
2.3 重组慢病毒感染MCF-7细胞的结果
重组慢病毒感染 MCF-7 细胞 96 h 后，荧光显微
2.5 慢病毒转染MCF-7细胞后下调FUT8的蛋白
表达
重组慢病毒载体转染 MCF-7 细胞后 Western blo-
tting 检测结果（图 5）显示，3 个 RNAi 组的 FUT8
蛋白相对表达量较空白对照组与阴性对照组明显降
功转染 MCF-7 细胞。
2.4 慢病毒转染MCF-7细胞后下调FUT8的mRNA
表达
Real-time PCR 结 果（ 图 4） 显 示， 空 白 对 照
组与阴性对照组在 mRNA 表达水平方面差异无统
计学意义（P>0.05）；与对照组相比，pGC-shFUT8
实 验 组 的 FUT8 mRNA 表 达 水 平 均 有 不 同 程 度 降
低，shFUT8-1、2、3 的抑制率分别为 30%、54% 和
40.82%，其中 pGC-shFUT8-2 在 mRNA 表达水平抑
制效果最为显著（P<0.05）。
A B
A1 B1
C D
C1 D1
A，A1 ：转染病毒空载体组 ；B，B1 ：转染 pGC-shFUT8-1 组 ；C，C1 ：转染 pGC-shFUT8-2 组 ；D，D1 ：转染 pGC-shFUT8-3 组
图 3 慢病毒转染 MCF-7 细胞后荧光显微镜观察绿色荧光（100×）
*
*
*
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Blank NC pGC-
shFUT8-1
pGC-
shFUT8-2
pGC-
shFUT8-3
FU
T8
2-ƸƸCt 
* 与空白对照组和阴性对照组比较，P<0.05，下同
图 4 Real-time PCR 检测 FUT8 基因的 mRNA 表达水平
*
*
*
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Blank NC shFUT8-1 shFUT8-2 shFUT8-3
FU
T8
p
ro
te
in
re
la
tiv
e
ex
pr
es
si
on
le
ve
l
FUT8
Bl
an
k
NC shF
UT
8-1
shF
UT
8-2
shF
UT
8-4
GAPDH
图 5 Western blotting 检测 FUT8 蛋白表达水平
镜下可见 90% 以上细胞发出绿色荧光（图 3），细胞
传代后绿色荧光仍可持续表达，证明重组慢病毒成
2015,31(5) 235温宪春等：FUT8 基因 RNAi 慢病毒载体的构建及对MCF-7 细胞增殖的影响
低，shFUT8-1、2、3 组 分 别 下 降 了 43.08%、80%
和 69.23%， 其 中 pGC-shFUT8-2 组 抑 制 效 果 最 佳
（P<0.05）；空白对照组与阴性对照组间 FUT8 蛋白
表达量无显著性差异（P>0.05）。
2.6 细胞体外增殖分析
MTT 检 测 结 果 发 现， 接 种 第 3 天 起，pGC-
shFUT8-2 组细胞增殖速率明显低于空白对照组与阴
性对照组（P<0.05），而阴性对照组与空白对照组相
比较，增殖未见改变（P>0.05，图 6）。同时，克隆
形成试验也显示，转染 pGC-shFUT8-2 组细胞克隆形
成率（16.96%）远低于空白对照组及阴性对照组（分
别为 41.38%、39.67%），差异显著（P<0.05），而阴
性对照组与空白对照组比较无显著性差异（P>0.05，
图 7）。
作用途径［17，18］。因此，FUT8 基因在肿瘤细胞的生
长和转移过程中发挥着重要的调节作用。
RNA 干扰（RNAi）是一种准确和有效的基因沉
默的方法，是由短双链 RNA（dsRNA）诱导的同源
mRNA 高效特异性降解，从而导致目的基因表达沉
默［19］。常用的 siRNA 的表达载体有质粒、腺病毒、
慢病毒，其中病毒载体感染效率更高。慢病毒作为
外源基因载体具有感染范围广、表达稳定长效、基
因装载量大等优点，是目前进行基因功能研究和基
因治疗的有力工具。本研究设计合成 3 对靶向 FUT8
基因的 shRNA，构建 siRNA 表达的慢病毒干扰载
体，并利用病毒感染人乳腺癌 MCF-7 细胞，以期通
过 RNAi 机制实现对 MCF-7 细胞中 FUT8 基因的沉
默。经荧光显微镜观察显示，本试验构建的 3 组慢
病毒干扰载体 pGC-shFUT8 均可高效率转染 MCF-7
细 胞， 转 染 效 率 均 在 90% 以 上， 并 能 有 效 抑 制
FUT8 的 mRNA 及蛋白的表达，其中 pGC-shFUT8-2
为最佳靶向 FUT8 的干扰序列。另外，我们对 FUT8
基因的功能进行了初步研究，选用干扰效果最佳的
pGC-shFUT8-2 序列转染 MCF-7 细胞，MTT 检测发
现 FUT8 干扰的 MCF-7 细胞生长增殖能力较正常的
MCF-7 明显下降 ；同样反映细胞增殖能力的克隆形
3 讨论
细胞恶性转化过程中总伴有糖链结构的改变，
并且这种改变与肿瘤细胞的黏附、迁移及侵袭等多
种运动功能相关［9］。核心岩藻糖是位于 N-型糖链核
心部位的唯一的岩藻糖糖基，FUT8 是催化核心岩
藻糖基反应的酶［10］。现已证明核心岩藻糖基对多种
生长因子和黏附分子（如 EGF、E-cadherins、TGF-β
和 Integrin 等）的信号传导是必不可少的［11-15］。如
FUT8 基因缺失小鼠表现出肺气肿样改变的表型和严
重的发育迟缓，出生后 3 d 之内有 70% 的死亡率［16］。
在肿瘤细胞常常可以见到 FUT8 的改变，其通过催
化多种底物蛋白，如芳基硫酸酯 A（ARSA）、5T4
糖蛋白癌胚抗原、甲胎蛋白、纤连蛋白和钙粘蛋白等，
参与底物分子对肿瘤发生、发展及转移潜能相关的
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1 2 3 4 5 6 7ᰦ䰤/dOD 490nm MCF-7MCF-7-NCMCF-7-shFUT8-2 * * **
图 6 各组 MCF-7 细胞生长曲线图
0
10
20
30
40
50
MCF-7 MCF-7-NC MCF-7-shFUT8-2
Th
e
pe
rc
en
ta
ge
o
f C
ol
on
y-
fo
rm
in
g/
%
*
MCF-7 MCF-7-NC MCF-7-shFUT8-2
A
B
A ：细胞平板克隆结晶紫染色图 ；B ：平板克隆计数统计图
图 7 各组 MCF-7 细胞平板克隆形成能力分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5236
成试验也显示转染 pGC-shFUT8-2 后，MCF-7 细胞的
克隆形成率比转染前显著降低，表明 FUT8 干扰后
对乳腺癌细胞增殖具有抑制作用，而 FUT8 基因的
其它生物学功能及其调控机制尚需进一步深入研究。
4 结论
本研究成功构建靶向人 FUT8 基因的 RNAi 慢病
毒载体，并筛选出高效干扰 MCF-7 细胞 FUT8 基因
表达的有效靶点，初步证实沉默 FUT8 对乳腺癌细
胞具有增殖抑制作用。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）