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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
p53 基因表达沉默的稳定 Vero
细胞系的建立及特性分析
刘超 邱亚峰 沈阳 刘庆伟 马志永
(中国农业科学院上海兽医研究所兽医公共卫生研究室，上海 200241)
摘 要: 利用慢病毒介导的 RNA干扰技术，建立稳定沉默 p53 基因的 Vero细胞模型。设计针对 p53 基因的 shRNA序
列，构建 p53 shRNA慢病毒载体并感染 Vero细胞;嘌呤霉素筛选阳性细胞，局部消化法挑选细胞克隆;利用 RT-PCR 和 West-
ern blot检测 p53 的表达水平;利用虫荧光素酶报告系统，分析 p53 的转录激活功能。RT-PCR 和 Western blot 结果显示，慢病
毒介导的 shRNA有效地沉默 p53 基因表达;与对照组细胞相比，干扰组细胞的 p53 的转录激活功能明显降低。慢病毒介导的
shRNA高效、稳定地沉默了 p53 基因的表达，同时，有效地降低了 p53 的转录激活功能，为研究 p53 的生物学功能提供了有利
的工具。
关键词: p53 慢病毒载体 RNA干扰 筛选 细胞系
Generation and Characteristic Analysis of a Stable Vero Cell Line with
p53 Gene Expression Knocked-down Using Lentiviral
Vector-mediated Short Hairpin RNA
Liu Chao Qiu Yafeng Shen Yang Liu Qingwei Ma Zhiyong
(Laboratory of Veterinary Public Health，Shanghai Veterinary Research Institute，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 200241)
Abstract: The study was to establish a stable Vero cell line with p53 gene silencing using lentivirus-mediated RNA interference
(RNAi)． Vero cells were infected with a recombinant lentivirus expressing a specific shRNA for p53 gene． The positive cell clones were
selected using selective drug of Puromycin，and isolated using the method of partial digestion． The expression of p53 was detected by
semi-quantitative RT-PCR and Western blot． The p53 transcription activity of the negative control and p53 RNAi Vero cells was ana-
lyzed with a luciferase report system． The Vero cell line with p53 gene silencing was obtained． The analysis of semi-quantitative RT-PCR
and Western blot showed that the expression of p53 was substantially down-regulated by RNAi． The p53 transcriptional activity in RNAi
cells was significantly decreased compared with that in negative control cells． The results demonstrated that the lentiviral vector-media-
ted short hairpin RNA has effectively and specifically silenced p53 gene expression and consequently down-regulated the p53 transcrip-
tional activity in the generated-p53 RNAi Vero cell line． This RNAi cell line was appeared to be a useful tool in studying the biological
function of p53．
Key words: p53 Lentivirus vector RNA interfere Screening Cell line
收稿日期:2010-03-15
基金项目:国家自然科学基金青年基金(30700593) ，中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(2006JB06，2010JB20)
作者简介:刘超，男，硕士研究生，研究方向:动物病毒与宿主细胞的相互作用关系;E-mail:liuchao08@ yahoo． com． cn
通讯作者:马志永，男，研究员，博士生导师，研究方向:动物病毒与宿主细胞的相互作用关系;E-mail:zhiyongma@ shvri． ac． cn
在各种动物细胞中，p53 基因具有非常相似的
基因结构，长约 20 kb，都由 11 个外显子和 10 个内
含子组成［1］。而 p53 蛋白在细胞内的信号转导通
路非常复杂，具有参与细胞周期调控［2］，细胞分化
与衰老，DNA修复［3］与诱导细胞凋亡［4］等多种生物
学功能。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
许多研究发现，p53 基因突变在 DNA 肿瘤病毒
的发病机制中起一定的作用。国际癌症登记协会
(International Association of Cancer Registries，IACR)
数据库的资料表明，p53 基因突变是许多自然发生
肿瘤的一个频率极高的特征。p53 基因突变在原发
性肿瘤中约 50%的发生率［1］，而在乳房癌、肺癌和
结肠癌中高达 85%。突变的 p53 等位基因编码缺
陷型蛋白，该蛋白不再具有结合 DNA和激活转录能
力。与人类癌症有关的特定病毒，通过编码能够抑
制肿瘤抑制因子蛋白 p53 活性的病毒蛋白，参与细
胞瘤的形成［5，6］。这就意味着这些病毒在损害 p53
结构与功能中不仅起到直接作用而且还起到间接
作用。
另外，Takaoka 等［7］发现，水泡性口炎病毒
(VSV)在 p53基因敲除的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)
中的病毒滴度比正常对照细胞中的滴度高，从而证
实 p53 可能具有抗病毒作用。Mu珘noz-Fontela 等［8］
通过体内试验发现，水泡性口炎病毒(VSV)在 p53
超级鼠中病毒滴度显著提高。最近，相关研究者又
通过一系列试验证实了 p53 参与细胞先天性抗病毒
免疫反应［9］，成为病毒与宿主细胞相互作用研究的
热点分子之一。
研究 p53 蛋白功能的方法很多，迄今为止，国内
外已有不少学者利用 RNA 干扰技术实现了在不同
细胞内抑制 p53 蛋白的表达［10，11］。众所周知，Vero
细胞是多种病毒的易感细胞。因此，本研究将慢病
毒介导的针对 p53 基因的 shRNA表达载体导入 Ve-
ro细胞，成功抑制了该细胞中 p53 基因的表达，在嘌
呤霉素的抗性筛选下，经过传代获得稳定的 RNA干
扰细胞系，为研究病毒感染与宿主细胞 p53 之间的
相互作用关系提供有用的工具。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 质粒、菌种与细胞
慢病毒载体 pGCSIL-PUR购自上海吉凯基因化
学有限公司;pGL3-p21-Luc 与 pMDM2-Luc 质粒为
本室保存;E. coli DH5α 由本室保存;Vero 细胞购自
中国科学院上海细胞库。
1． 1． 2 试剂
DMEM培养基、胎牛血清、LipofectamineTM2000
和 Opti-MEM 培养基购自美国 Invitrogen 公司;嘌呤
霉素(Puromycin)购自德国 Merck 公司;多柔比星
(Doxorubicin，Dox)购自美国 Sigma 公司;小鼠 p53
单克隆抗体 Do-1 购自美国 Santa Cruz Biotechnology
公司;鼠 β-actin单克隆抗体 AC-15 为 Sigma 公司产
品;羊抗小鼠 IgG-HRP购自美国 Santa Cruz Biotech-
nology公司;ECL发光试剂盒购自美国 Pierce公司;
预染蛋白质 Marker 购自中晶生物公司;显影液、定
影液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物
技术研究所，其它试剂为国产分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 p53-RNA干扰慢病毒载体的构建 根据前
期用化学合成方法和质粒载体介导的 RNA 干扰方
法，筛选出的一条有效的针对灵长类动物猴子 p53
基因序列的小 RNA 干扰序列如下:5-AAGACTC-
CAGTGGTAATCTAC-3，将此序列以正反向组合，
中间添加 loop 环结构，使寡核苷酸可以形成发夹
结构，由此合成靶序列的 oligo DNA(上海吉凯基
因化学有限公司合成) ，具体如下:正义链:5-
CCGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAG-
TAGATTACCACTGGAGTCTTTTTTTG-3;反义链:5-
AATTCAAAAAAAGACTCCAGTGGTAATCTACTCT-
CTTGAAGTAGATTACCACTGGAGTCTT-3。将合成
好的 oligo DNA进行退火形成双链 DNA，将退火产
物经 T4DNA连接酶连至经过 Age I 和 EcoR I 双酶
切后的线性化慢病毒载体 pGCSIL-PUR 中，然后转
化大肠杆菌 DH5α，挑单菌落于 37℃，180 r /min的
条件下振摇培养 12 h，进行菌液 PCR 鉴定并进行
测序进一步验证，挑取阳性克隆菌液进行质粒抽
提并命名为 pGC-Lv-Monkeyp53-RNAi。另外，本试
验中的阴性对照的小 RNA干扰序列为上述 p53 基
因序列的小 RNA干扰序的顺序打乱，按照以上方
法同样处理最终抽提质粒命名为 pGC-Lv-Monke-
yp53-NC。
制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒 pGC-LV-
Monkeyp53-RNAi、pGC-Lv-Monkeyp53-NC 及其两种
辅助包装原件载体质粒 pHelper 1． 0 和 pHelper 2. 0，
质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按 Invitro-
gen公司 Lipofectamine 2000 使用说明进行共转染
293T 细胞，转染后 8 h 更换为完全培养基，培养48 h
48
2010 年第 7 期 刘超等:p53 基因表达沉默的稳定 Vero细胞系的建立及特性分析
后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后
得到高滴度的慢病毒浓缩液，在 293T 细胞中测定
并标定病毒滴度。
1． 2． 2 初筛嘌呤霉素对 Vero细胞的最低致死浓度
在 24 孔板中铺种 Vero 细胞，待细胞生长至 30%
－50%单层时，在 20 孔中加入不同浓度的嘌呤霉
素，使其终浓度分别为 1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0、3． 5、
4． 0、4． 5、5． 0、5． 5、6． 0、6． 5、7． 0、7． 5、8． 0、8． 5、9． 0、
9． 5、10． 0、12 μg /mL，留 4 孔加 DMEM 培养基作为
阴性对照。48 h后观察 24 孔板上细胞死亡情况，得
出使 Vero细胞全部死亡的嘌呤霉素最小浓度，即嘌
呤霉素对 Vero细胞的最低致死浓度。
1． 2． 3 慢病毒感染 Vero细胞及阳性细胞株的筛选
取 200 μL包装好的慢病毒原液，加入 1． 8 mL 含
2% FBS 的 DMEM 培养液将病毒原液按 10 倍系列
稀释，分别为 10 －1、10 －2、10 －3，然后分别接种于长成
30% －50%单层的 Vero 的 6 孔板 3 个孔中，另外分
别设 3 个阴性对照孔。同时每孔加 Polybrene 至终
浓度为 6 μg /mL，于 37℃ 5%的 CO2培养箱培养 24
h后，弃掉旧细胞营养液，换含 10% FBS 的 DMEM
新鲜培养液，同时加 Puromycin至终浓度为 8 μg /mL
进行阳性细胞株的筛选。48 h 后，一传二，用 Puro-
mycin继续筛选，每隔 48 h重新换液加 Puromycin筛
选并及时传代，获得抗性细胞，采用局部消化法获得
单克隆细胞以使细胞系得到纯化。每代均留样置于
－ 70℃冰箱冻存备用。
1． 2． 4 p53 基因 mRNA 表达水平检测 利用半
定量 RT-PCR 技术检测基因表达水平的变化。按
照 Invitrogen Trizol Reagent 说明书抽提细胞总的
RNA，逆转录及 PCR 反应按照试剂盒说明书操
作。根据 p53 基因的 mRNA 序列设计引物 F:5-
AGGTTGGCTCTGACTGTA-3，R:5-CCTCTGTCT-
TGAACATGA-3，预计扩增出 495 bp 左右的目的
基因片段;同时针对内参基因 β-actin 设计引物
F:5-GACCCAGATCATGTTTGA-3，R:5-CAGCT-
TCTCCTTAATGTCA-3，预计扩增出 292 bp 左右的
目的基因片段。上述引物均由上海英骏生物技术有
限公司合成。
PCR反应程序:94℃预变性 2 min，94℃变性
30 s，50℃退火 30 min，72℃延伸 45 s，26 个循环，
72℃延伸 10 min。PCR 产物于 1%的琼脂糖电泳，
电压 120 V，30 min。
1． 2． 5 p53 蛋白表达水平检测 将旧细胞培养液
弃掉，用 PBS 洗细胞 2 次，然后弃掉，用细胞刮将细
胞刮下于 PBS 中，4℃，3 000 r /min离心 5 min，弃掉
上清留细胞沉淀，用细胞裂解液将细胞裂解后释放
蛋白，超声 2 s，煮沸2 min，4℃，12 000 r /min 离心 5
min，用 BCA蛋白浓度测定法定量蛋白，总蛋白上样
量为 20 μg，进行 SDS-PAGE 电泳后，转膜，加一抗，
二抗，然后 X-胶片曝光，暗室显影。
1． 2． 6 外源性药物 Dox 刺激检测 p53 表达抑制效
果 取不同代次筛选的已鉴定为 p53 RNA 干扰阳
性的 Vero细胞铺种 35 mm培养皿，同时设相应的对
照组细胞，细胞数均为 105个 /mL，置 37℃，5% 的
CO2培养箱培养至 24 h 后，加入一种特异性刺激
p53 表达的药物 Dox 至终浓度为 0． 6 μg /mL 刺激
Vero细胞，作用 24 h后，将旧细胞培养液弃掉，处理
方法按照 1． 2． 4。
1． 2． 7 p53 转录激活功能的检测 在 35 mm 培养
皿中分别铺种阴性对照组与 p53-RNAi 干扰组 Vero
细胞，24 h 后均转染携带有荧光素酶报告基因的
pGL3-p21-Luc和 pMDM2-Luc 真核表达质粒，质粒
总量均为 2 μg /35 mm 培养皿，Lipofectamine 2000
用量为 2 μL /35 mm培养皿，对照组与 p53-RNAi 干
扰组细胞均加入 Dox 药物刺激细胞，作用 24 h 后，
将细胞旧培养液弃掉，PBS 洗细胞 2 次，然后弃掉，
加入 500 μL 1 × Passive Lysis Buffer 于细胞中于恒
温摇床振摇裂解 30 min。按仪器操作说明书开启荧
光测定仪，将测定间隔时间设为 2 s，测定时间设为
10 s。每个样品测定时，取 10 μL加入 17 μL荧光素
酶检测试剂，用微量移液器适当混匀后，测定 RLU
(relative light unit)。结束后，加入 17 μL荧光素酶
底物以相同方式测定 RLU(relative light unit)。在
以 Renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧
光素酶测定得到的 RLU 值除以 Renilla 荧光素酶
测定得到的 RLU 值，根据得到的比值来比较不同
样品间目的报告基因的激活程度。
2 结果
2． 1 p53-RNA干扰慢病毒载体的构建
针对灵长类动物猴子 p53 基因设计的 shRNA
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
(图 1-a) ，将此序列正反向组合，形成双链 oligo
DNA，同时两端含有相应的 Age I 和 EcoR I 酶切粘
性末端(图 1-b) ，然后被连接到 U6 启动子的下游，
成功构建 pGC-LV-Monkeyp53-RNAi慢病毒载体(图
1-c)。
a．针对 p53 基因设计的特异的 shRNA;b．针对 p53 基因
特异的 shRNA的双链寡核苷酸 DNA 序列;c． p53-RNA
干扰慢病毒载体
图 1 结构示意图
2． 2 嘌呤霉素对 Vero细胞的最低致死浓度
24 孔板中的 Vero细胞加入不同浓度的嘌呤霉
素作用 48 h后，与阴性对照组相比，细胞全部死亡
的嘌呤霉素最低浓度为 8 μg /mL，此即为嘌呤霉素
对 Vero细胞的最低致死浓度。
2． 3 半定量 RT-PCR检测结果
取前 6 代筛选的 RNA 干扰细胞与对照细胞用
Trizol法分别抽提 RNA，进行 RT-PCR分析。结果显
示，内参基因 β-actin在干扰组与对照组细胞中表达
水平基本一致，而 p53 基因在干扰组的表达水平明
显低于对照组(图 2)。
2． 4 Western blot检测结果
2． 4． 1 稳定细胞系 p53 蛋白水平分析 取前 6 代
筛选的 RNA 干扰组细胞和对照组细胞抽提总细胞
蛋白进行Western blot分析。结果显示:从蛋白表达
水平上看，内参基因 β-actin在干扰组与对照组细胞
中表达水平基本一致，RNA干扰组 p53 基因表达明
显低于对照组(图 3)。
1 － 6．不同代次 Vero细胞系的阴性对照组;1 － 6．不同
代次的 RNA干扰组 Vero 细胞的 p53 基因;a． 阴性对照
组 Vero细胞系和 RNA干扰组 Vero细胞系中 p53 基因;
b．阴性对照组 Vero细胞系和 RNA 干扰组 Vero 细胞系
中 β-actin基因
图 2 半定量 RT-PCR分析结果
1 － 6．不同代次 Vero细胞系的阴性对照组;1 － 6．不同
代次的 RNA干扰组 Vero细胞的 p53 基因;7．第 13 代阴
性对照组细胞;7．第 13 代 RNA 干扰组 Vero 细胞中的
p53 基因;a．阴性对照组 Vero细胞系和 RNA干扰组 Ve-
ro细胞系中 p53 基因;b． 阴性对照组 Vero 细胞系和
RNA干扰组 Vero细胞系中 β-actin基因
图 3 Western blot结果
2． 4． 2 外源性药物 Dox orubicin刺激检测 p53 基因
表达抑制效果 用一种特异性刺激 p53 基因表达的
药物 Dox orubicin刺激第 7 代 RNA干扰组与对照组
细胞，24 h后收集细胞，裂解细胞，测细胞总蛋白浓
度进行 Western blot分析。结果(图 4)显示，从对照
组可以看出，加药物比未加药物 p53 蛋白表达水平
升高，说明药物特异性刺激 p53 基因表达是有效的，
而 RNA干扰组看，加药物比未加药物 p53 蛋白表达
水平没有升高，说明 p53 基因干扰效果良好。
NC．阴性对照组;RNAi． p53-RNA干扰组
图 4 经 Doxorubicin刺激阴性对照组细胞与 p53基因
RNA干扰组细胞后的 p53基因表达的Western blot结果
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2010 年第 7 期 刘超等:p53 基因表达沉默的稳定 Vero细胞系的建立及特性分析
2． 5 p53 转录激活功能的检测
选择 p53 蛋白两个下游基因 p21 与 MDM2，取
第 8 代筛选的 RNA 干扰组与对照组细胞分别转染
携带有荧光素酶报告基因的质粒后，24 h 后收细胞
样品进行 Luciferase 测定分析。结果显示，RNA 干
扰组 p21 与 MDM2 分子与对照组蛋白表达活性相
比明显降低，说明 Vero 细胞中 p53 基因被沉默之
后，p53 蛋白分子的转录激活功能明显受到抑制(图
5)。
NC．阴性对照组;RNAi． p53-RNA干扰组
图 5 阴性对照组细胞与 p53 基因 RNA干扰组细胞中的 p21(a)
与MDM2(b)的相对荧光素酶表达活性测定结果
3 讨论
RNA干扰是目前研究基因功能常用的方法之
一，其中慢病毒载体介导的 RNA干扰具有免疫原性
低，能感染分裂相细胞和非分裂相细胞，能将其自身
片段整合于宿主细胞基因组的特点。慢病毒能在各
类哺乳动物细胞中表达 siRNA，长期稳定抑制特定
基因的表达［12 － 14］，是 RNA 干扰的高效基因转导
工具。
p53 蛋白作为生物体内重要的调控蛋白，其信
号转导通路非常复杂。目前研究 p53 蛋白功能方法
很多，但多是通过 p53 的过表达而实现的，往往会产
生较大的偏差。同时，由于灵长类的基因敲除技术
尚不成熟，很难通过基因敲除技术在灵长类细胞上
研究 p53 的功能及生物学作用。因此，我们采用目
前较为有效的慢病毒载体介导的 RNA 干扰技术抑
制 p53 基因的表达，克服了常规直接转染 siRNA 效
率低、易降解、不能实现稳定的 RNA 干扰的缺点。
迄今为止，刘扬等［11，15，16］分别采用不同的慢病毒载
体在人胚胎肾细胞、H1299 细胞和 293T细胞中实现
了人 p53 基因的表达沉默，但未对 Vero 细胞进行相
关研究。为研究 p53 信号转导通路在病毒感染过程
中的相关作用，本研究以 Vero 细胞为模型，采用慢
病毒载体介导的 RNA 干扰技术建立了 p53 基因沉
默的稳定 Vero 细胞系。半定量 RT-PCR 分析结果
显示 p53 基因在 RNA干扰的 Vero 细胞系中的表达
水平相对于对照组显著下降;Western blot分析 RNA
干扰的 Vero细胞系中的 p53 蛋白含量相对于对照
组也发生较为明显的降低。Western blot 分析结果
与半定量 RT-PCR 分析结果完全吻合，说明 p53
RNA干扰试验取得成功。
为进一步说明 p53 干扰效果的稳定性，加入一
种特异性刺激 p53 表达的药物 Dox 来刺激 Vero 细
胞系，结果发现，RNA 干扰组 p53 蛋白表达并没有
明显增加，而对照组表达增多;另外，p21 和 MDM2
为 p53 下游的靶基因，本试验转染了携带有 p21 与
MDM2 荧光素酶报告基因质粒于 Vero 细胞中，Lu-
ciferase测定发现，p53 RNA 干扰组中 p21 与 MDM2
基因表达活性比对照组也有下降。这两个试验从不
同的方面表明 RNA干扰试验达到了预期目的，获得
成功。孙宝昌等［17］报道 p53 RNA 干扰的细胞中，
p53 下游靶基因 p21 的表达变化不明显，这有可能
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
与细胞种类有关。
总之，本研究采用慢病毒载体介导的 RNA干扰
技术成功抑制了 Vero细胞中 p53 基因的表达，最终
获得了稳定抑制内源性 p53 表达的 Vero 细胞株。
迄今为止，这是首次采用慢病毒载体介导的 RNA干
扰技术在 Vero细胞中对 p53 基因进行有效干扰的
报道，为研究 p53 信号转导通路在病毒感染过程中
所起的相关作用机制提供了有用的工具。
致谢:感谢中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生
虫病重点实验室提供的实验设备。
参 考 文 献
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