全 文 ：第 33卷 第 4期 生 态 科 学 33(4): 704−712
2014 年 7 月 Ecological Science Jul. 2014

收稿日期: 2013-03-11; 修订日期: 2014-07-25
基金项目: 国家自然科学基因项目(41076070, 41176101); “十一五”国家科技支撑计划重点项目(2009BADB2B0606, 2012BAC07B0402); 中国科学院知
识创新工程重要方向性项目(KSCX2-SW-132)。
作者简介: 彭亚兰(1986—), 女, 博士研究生, 研究方向：植物分子生态学, E-mail: pengyalan@scsio.ac.cn
*通信作者: 王友绍(1963—), 男, 教授(二级), E-mail: yswang@scsio.ac.cn

彭亚兰, 王友绍. 红树植物桐花树 EF1A 基因的克隆与表达分析[J]. 生态科学, 2014, 33(4): 704−712.
PENG Yalan, WANG Youshao. Molecular characterization and expression analysis of elongation factor 1 A from mangrove Aegiceras
corniculatum[J]. Ecological Science, 2014, 33(4): 704−712.

红树植物桐花树 EF1A 基因的克隆与表达分析
彭亚兰 1, 王友绍 1, 2,*
1. 中国科学院南海海洋研究所热带海洋环境国家重点实验室, 广州 510301
2. 中国科学院大亚湾海洋生物综合试验站, 深圳 518121

【摘要】 通过 RACE 方法克隆到桐花树(Aegiceras corniculatum)的一个延伸因子基因, 命名为 AcEF1A(GenBank 登录号:
KC416649)。该基因的 cDNA 全长 1 778 bp, CDS 为 1 350 bp, 编码 449 个氨基酸。多序列比对结果表明该氨基酸序列与琴
叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)EF1A 的氨基酸序列高度相似(97.7%)。基因表达分析结果显示 AcEF1A 在茎尖中的表达量最高,
叶片中的表达量次之, 根中的表达量最低。低温、高盐、干旱和重金属 Cd 胁迫下, 桐花树叶片中 AcEF1A 基因的表达水平
有不同程度的上调。这些结果表明 AcEF1A 基因可能参与了植物的生长发育过程及逆境响应过程。

关键词：红树植物; 桐花树; 延伸因子; 克隆; 实时定量 PCR
doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2014.04.012 中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2014)04-704-09
Molecular characterization and expression analysis of elongation factor 1 A
from mangrove Aegiceras corniculatum
PENG Yalan1, WANG Youshao1,2,*
1. State Key Laboratory of Tropical Oceanography, South China Sea Institute of Oceanography, Chinese Academy of Sciences,
Guangzhou 510301, China
2. Daya Bay Marine Biology Research Station, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518121, China
Abstract: An elongation factor 1-alpha (EF1A) gene was isolated from mangrove Aegiceras corniculatum and designated as AcEF1A
(GenBank accession number: KC416649). The Full-length cDNA of AcEF1A is 1778 bp with a 1350 bp open reading frame (ORF)
which encodes 449 amino acids. Multiple sequence alignment revealed that the deduced amino acid sequence of AcEF1A shares high
similarity with the EF1A (XP_002864684) from Arabidopsis lyrata (97.7%). Quantitative real-time PCR was employed to determine
the expression of AcEF1A in different tissues and in response to cold, salt, drought and heavy metal (cadmium, Cd). Results showed
that transcripts of AcEF1A were detected in all tissues (leaves, stems and roots) of plantlets, with the highest expression in stems and
the lowest in roots. The expression of AcEF1A was differentially induced by cold, salt, drought and Cd. These results suggest that the
AcEF1A may play an essential role in plant development and may be involved in the response to abiotic stresses.
Key words: Aegiceras corniculatum; EF1A; clone; real-time quantitative PCR; gene expression
1 引言
红树林是生长于热带、亚热带河口海湾潮间带
的木本植物群落, 具有提供生物栖息地、维护湿地
生态系统平衡、防风固沙及净化海洋环境等功能[1]。
红树植物的生境独特, 具有高盐、厌氧和周期性水
4 期 彭亚兰, 等. 红树植物桐花树 EF1A 基因的克隆与表达分析 705
淹等特点[2]。近年来, 由于人类活动和全球气候变化
的影响, 红树植物日益面临重金属污染[3]、海平面上
升[4]及冷冻灾害频发[5]等多种非生物胁迫所带来的
威胁。因此, 红树植物抗逆机制的研究具有重要的
意义。
高盐、干旱、低温及重金属等是影响植物生长
和发育的主要环境因子。它们可能对植物细胞造成
多种伤害, 包括抑制光合作用和电子传递链、加速
活性氧(ROS)的产生、影响酶的活性以及导致细胞脱
水和代谢失调等[6]。植物对各种胁迫的响应是一个
积极的应激过程。这个过程依赖于植物体基因表达
结构的迅速调整及多种抗逆相关蛋白的合成[7]。此
外, 在胁迫条件下, 植物细胞内可溶性蛋白含量的
增加可以显著提高细胞的持水能力, 从而缓解高
盐、干旱、低温及重金属等胁迫所造成的细胞脱水
压力[8]。因此, 逆境条件下植物蛋白质的合成对植物
抗逆能力的提高具有重要的作用。蛋白质的生物合
成是一个复杂的过程, 包括转录和翻译过程, 而翻
译过程又分为起始、延伸和终止三个阶段, 分别由
起始因子、延伸因子和释放因子控制[9]。延伸因子
(elongation factor)可以催化氨基酸链在核糖体上的
延伸, 从而控制蛋白质的合成。植物的延伸因子可
分为 EF1 和 EF2, EF1 又由 EF1A(又称 EF-1α或 EF-
Tu)、EF1Bα、EF1Bβ和 EF1Bγ 4 个亚基组成[9,10]。
蛋白质合成的延伸过程中, EF1A·GTP 可催化氨酰
tRNA 结合到核糖体的 A 位点。EF2·GTP 可催化延
长后的肽-tRNA 由 A 位点转移到 P 位点, 使核糖体
在 mRNA 上向前移动一个密码子[9]。EF1B(EF1Bα
和 EF1Bβ)可催化 EF1A·GDP 转变成 EF1A·GTP。植
物细胞的正常生长及蛋白质的合成需要 EF1 和 EF2
等延伸因子基因在细胞内的正常表达。压力状态下,
细胞可通过调节其 EF1 和 EF2 等延伸因子基因的表
达量来调节总蛋白质的合成[11]。EF1A 除了参与蛋
白翻译外, 还具有许多重要的功能, 如EF1A可以作
为分子伴侣保护蛋白免受环境压力的损害, 促进蛋
白的修复, 参与溶酶体对 N 端封闭蛋白的降解, 激
发植物对一些病原菌的免疫和耐性, 以及参与植物
对非生物压力的响应过程[11]。
桐花树是一种中国南方沿海红树林主要的建群
种, 对多种非生物胁迫压力, 如高盐[12]和重金属[13]
等都有很强的耐性。目前已开展了很多关于桐花树
抗逆机制的研究[14-16]。但有关桐花树延伸因子基因
的研究鲜有报道。本文利用同源克隆和 RACE 技术
克隆到桐花树延伸因子EF1A基因的cDNA全长, 并
利用实时荧光定量PCR技术研究了该基因的组织表
达差异和在多种压力胁迫条件下(低温、高盐、干旱
和重金属)的表达水平变化。本实验将为今后进一步
研究桐花树 EF1A 的作用机制提供基础理论依据。
2 材料与方法
2.1 植物材料
无病虫害及机械损伤的桐花树果实采集于深圳
东涌红树林保护区。经 1%高锰酸钾消毒处理后将种
子种植于盛有干净海沙的塑料盆中, 放置在光照培
养箱中培养(25 ℃, 光照/黑暗比为 16 h/8 h)。培养
过程中每周用 1/2 的 Hoagland 营养液浇灌 2 次。当
植株的 4 片幼叶完全展开后, 随机选取 3—6 株生长
一致的植株, 分别收集其自顶端向下的第二对成熟
叶片、茎尖和全根样品, 液氮速冻, –80 ℃保存。
2.2 实验处理
为了研究桐花树 EF1A 基因在多种非生物胁迫
条件下的表达模式, 我们设计了四组实验, 即低温、
干旱、高盐和重金属胁迫实验。每组实验选取 15
株生长一致的幼苗进行。低温胁迫实验: 将幼苗从
25 ℃培养箱中转移至 5 ℃培养箱, 在培养 0、6、
12、24 和 48 h 后采集叶片样品, 液氮速冻, 并于
–80 ℃保存备用。干旱、高盐和重金属胁迫实验: 分别
用含有20% PEG6000, 30 g·L−1 NaCl 和20 mg·L−1 Cd的
1/2 Hoagland 营养液对植株进行培养, 处理 0、6、12、
24 和 48 h 后采集叶片样品, 液氮速冻, –80 ℃保存。
2.3 桐花树 EF1A 基因 cDNA 全长序列的克隆
2.3.1 总 RNA 的提取
使用植物总 RNA 提取试剂(Tiangen)进行桐花
树样品的总 RNA 提取。在氯仿抽提过程中加入水平
衡酚以去除植物样品中的多糖和多酚。提取的总
RNA的纯度和浓度用Nanodrop ND-2000C微量紫外
分光光度计(Thermo Scientific, USA)进行检测。并取
1 μg 总 RNA 样品进行 0.8 %的琼脂糖凝胶电泳检测
其完整性。
2.3.2 中间片段的合成
以桐花树叶片样品提取的总 RNA 为反转录模
板, 采用大连宝生物公司(TaKaRa)的 M-MLV 反转
录酶和随机引物进行反转录, 合成第一链 cDNA,
706 生 态 科 学 33 卷
用于 RT-PCR 的扩增。根据其他物种中 EF1A 基因的
保守区序列设计上下游简并引物 DgEF1A-F 和
DgEF1A-R(见表 1)进行桐花树 EF1A 基因的中间片
段扩增。PCR扩增体系为25 μL, 包括cDNA模板1 μL,
dNTP Mixture(2.5 mM)4 μL, 上下游引物(10 μM)各
0.5 μL, 10×PCR buffer 2.5 μL, rTaq 酶(5 U/μL)
0.25 μL 和灭菌超纯水。PCR 反应程序为: 94 ℃预
变性 5 min; 94 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 30 s, 72 ℃延
伸 1 min, 35 个循环; 72 ℃延伸 10 min, 4 ℃保存。
扩增结束后取 PCR 产物 5 μL 在 1.2%的琼脂糖凝胶
上电泳验证扩增结果。使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试
剂盒(BioTeke)回收纯化 PCR 特异性扩增产物。纯化
后的目的片段连接至 pMD-18T 载体(TaKaRa), 并转
化感受态大肠杆菌 DH5α。经蓝白斑筛选和菌落
PCR 鉴定获得的阳性克隆子送上海美吉生物测序公
司进行双向测序。
2.3.3 cDNA 全长序列的扩增
根据已获得的桐花树 EF1A 基因的中间片段设
计用于3’和5’ cDNA末端快速扩增(RACE)的基因特
异性引物 GSP(见表 1)。以桐花树叶片样品提取的总
RNA 为反转录模板, 采用 SMARTerTM RACE cDNA
Amplification Kit(Clontech)反转录合成用于 3’或 5’
RACE PCR 的第一链 cDNA。第一轮 3’和 5’RACE
PCR 扩增分别以外侧基因特异性引物 3’EF1A-GSP
或 5’EF1A-GSP 与 SMARTerTM RACE cDNA Ampli-
fication Kit 所带的通用引物 UMP 配对进行。第二轮
3’和 5’RACE PCR 扩增分别以第一轮 3’和 5’RACE
PCR 产物的稀释液为模板, 以内参基因特异性引物
3’EF1A-NGSP 或 5’EF1A-NGSP 与 SMARTerTM
RACE cDNA Amplification Kit 所带的通用引物 NUP
配对进行。两轮 PCR 的反应体系和条件都按照试剂
盒说明进行。PCR 扩增产物的纯化、克隆和测序与
中间片段的克隆所述相同。
2.4 序列的拼接与生物信息学分析
利用 DNAMAN 软件对 3’和 5’RACE 扩增片段
的测序结果进行拼接, 得到 cDNA 全长序列。利用
ORF (open reading frame) finder 软件 (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)寻找开放阅读框; 利
用 DNAMAN 软件及 NCBI 网站的 BLAST 软件
(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列的验证、翻
译及蛋白质相似性分析; 使用 Compute pI-Mw 软件
(http://cn.expasy.org/tool/pi_tool.html)进行蛋白质等
电点和相对分子质量的计算。使用 SMART 在线软
件(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白质功能
结构域分析; 用 MEGA 5.1 软件的邻接法(Neighbor-
Joining, NJ)构建系统进化树。
2.5 Real-time PCR 分析
分别提取各采集样品的总 RNA, 并检测其浓
度、纯度和完整性(同前所述)。以 1 μg 总 RNA 样品
为模板, 采用 primeScript RT reagent Kit with gDNA
Eraser (perfect Real time)(TaKaRa)试剂盒按操作说
明反转录成cDNA, –20 ℃保存备用。以获得的EF1A
基因全长序列为模板, 利用 primer premier 5.0 软件
设计一对特异性引物EF1A-RT-F和EF1A-RT-R用于
荧光定量 PCR 扩增(见表 1)。为了分析桐花树 EF1A
基因的相对表达水平, 我们选择桐花树 GAPDH 基
因作为内参。本实验室做了桐花树不同压力胁迫下

表 1 核苷酸引物序列
Tab. 1 Sequences of primers
名称 序列(5’-3’) 用途
Dg EF1A-F RGCTGACTGTGCWGTBC
Dg EF1A-R RTDCCAATRCCACCRAT
EF1A 基因中间片段扩增
5’EF1A-GSP GGGAACGAATGGGATCTTGTCAGG
3’EF1A-GSP GGTACAACCCTGACAAGATCCCATTC
第一轮 5’ 或 3’ RACE 扩增
5’EF1A-NGSP AGAGTACTTCGGGGTGGTAGCATC
3’EF1A-NGSP TCGACCAGGTCATAGAGCCCAAGAG
第二轮 5’或 3’ RACE 扩增
EF1A-RT-F ATGGTGATGCTGGTATGGTTAAGAT
EF1A-RT-R CAGTGGGTTCCTTCTTCTCAACGC
AcEF1A 基因的 Real-time PCR
GAPDH-RT-F ACACTCTATTACCGCCACA
GAPDH-RT-R GCTTTCCGTTTAGTTCAGG
GAPDH 基因的 Real-time PCR
4 期 彭亚兰, 等. 红树植物桐花树 EF1A 基因的克隆与表达分析 707
内参基因的优选研究, 证明该基因在多种压力胁迫
下表达相对稳定。在其他一些植物中 GAPDH 也被
认为是适合的内参, 如Swingle citrumelo [17]和Coffea
arabica [18]。我们根据桐花树 GAPDH 基因(GenBank
登录号: DQ884962)的全长序列设计了一对特异性
引物 GAPDH-RT-F 和 GAPDH-RT-R 用于荧光定量
PCR 扩增(见表 1)。荧光定量 PCR 反应扩增体系为
15 µL, 包括 cDNA 模板(100 ng/μL) 2 µL, 上下游引
物(10 µM)各 0.5 µL, 2×SYBR® Premix Ex Taq™ II
(TaKaRa)7.5 µL, 以及灭菌超纯水 4.5 μL。扩增反应
在 iQ5 实时定量检测系统(Bio-Rad, USA)中进行,
每个样品设三个生物学重复和三个技术重复。采用
两步法扩增程序进行 PCR 扩增: 95 ℃预变性 1 min;
95 ℃变性 5 s, 60 ℃退火和延伸 20 s, 45 个循环; 在
60 ℃时采集荧光信号。扩增反应结束后对扩增产
物进行熔解曲线分析。熔解曲线的程序为 65 ℃至
95 ℃缓慢升温, 温度每上升 0.5 ℃检测荧光信号 1
次。两基因扩增产物的熔解曲线都呈现特异的单峰,
表明扩增产物是特异性片段。将 cDNA 模板梯度稀
释后做标准曲线, 结果显示EF1A和GAPDH基因的
扩增效率分别为 100.5 %和 99.0 %。基因相对表达量
的计算采用 2-ΔΔCt 法进行。试验结果为平均值±标准
差(n=3)。组间数据的比较采用单因素方差分析和
Tukey test, p<0.05 为差异显著。
3 结果与分析
3.1 桐花树 AcEF1A 基因全长 cDNA 的克隆
如图 1A 所示, 采用改进后的 Tiangen 提取试剂
盒方法提取的总 RNA 完整性很好。紫外分光检测结
果显示总 RNA 样品的 OD260/OD280 值均在 1.8-2.1
之间, 说明提取的总 RNA 纯度高, 提取过程有效去
除了蛋白和酚的污染。以桐花树叶片 cDNA 为模板,
用简并引物进行扩增得到了长为 300多 bp的特异片
段(如图 1B 所示)。测序后进行 Blast, 结果显示该片
段与油菜(Brassica napus)的 EF1A 基因序列的同源
性高达 99%, 表明该片段为桐花树 EF1A 基因的中间
片段。根据扩增得到的中间片段序列, 分别设计了用
于 3’和 5’末端快速扩增的两对引物。经过 3’和
5’RACE 的第一轮和第二轮 PCR, 分别扩增得到基因
的 3’和 5’末端特异片段(如图 1C)。这些片段的测序
结果用 DNAMAN 软件进行拼接, 并提交 NCBI 进行
Blast 同源分析, 最终我们确认了一条正确编码的核
苷酸序列, 命名为桐花树延伸因子 1A基因(Aegiceras
corniculatum elongation factor 1A, AcEF1A)。我们将该
序列提交到NCBI 的GenBank, 登录号为KC416649。
3.2 桐花树 AcEF1A 基因的序列分析
AcEF1A 基因的 cDNA 全长 1 778 bp, 其中包括
85 bp 的 5’非编码区(5’ TUR), 443 bp 的 3’非编码区
(3’ UTR), 和1 350 bp的开放阅读框(ORF), 编码449
个氨基酸(图 2)。加尾信号(ATTAAA)及 Poly-A 尾分
别位于 3’ UTR 区距离终止密码子 32 bp 和 314 bp
处。序列编码蛋白的理论等电点为 9.19, 分子量为
49.38 kDa。保守区域分析结果表明该蛋白序列具有
1 个 GTP_EFTU 结构域、1 个 GTP_EFTU_D2 结构
域和 1 个 GTP_EFTU_D3 结构域, 分别位于氨基端
的第 5—226、248—315 和 321—430 位。在
GTP_EFTU保守结构域中发现了8个保守的GTP/Mg2+
结合区和 1 个 GTP 酶(GTPase)活性位点。8 个保守的
GTP/Mg2+结合区分别位于氨基端的第 9—38、50—
82、84—110、128—156、162—183、188—201、203—
213 和 215—227 位; GTP 酶(GTPase)活性位点位于氨
基端第 62—77 位(图 2)。


图 1 (A)部分样品总RNA 的琼脂糖凝胶电泳图; (B)AcEF1A中间片段扩增产物的电泳图; (C) AcEF1A 基因 5’和 3’RACE的第一
轮和第二轮 PCR 产物电泳图。M: DNA Marker DL2000。5-1, 5-2, 3-1, 3-2: 5’和 3’RACE 第一轮和第二轮 PCR 的扩增产物。
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA (A), AcEF1A fragment (B), and PCR products of 3’ or 5’ RACE(C). M: DNA
Marker DL2000. 5-1, 5-2, 3-1, 3-2: products of first or second 5’ or 3’ RACE PCR.
708 生 态 科 学 33 卷

图 2 AcEF1A 基因 cDNA 序列全长(上)及其编码的氨基酸序列(下)。GTP/Mg2+结合区用下划线表示, GTP 酶活性位点区用
阴影表示, 3’UTR 的加尾信号 ATTAAA 用方框表示。
Fig. 2 Nucleotide acid sequences of AcEF1A cDNA and the encoding amino sequences. The GTP/Mg2+ binding domains are
underlined. The GTPase activate domain is shaded. The canonical polyadenylation signal sequence (ATTAAA) is boxed.
3.3 同源性分析以及蛋白系统进化树的构建
将桐花树 EF1A 编码蛋白的氨基酸序列与木薯
(Manihot esculenta)、油菜(Brassica napus)、毛果杨
(Populus trichocarpa)、大豆(Glycine max)及琴叶拟南
芥(Arabidopsis lyrata)的 EF1A 氨基酸序列进行比对,
结果发现各序列之间具有高度相似性, 仅有少数氨
基酸差异(如图3), 它们的GTP_EFTU结构域序列高
度保守。AcEF1A 基因的氨基酸序列与这些物种的氨
基酸序列的相似性分别为 95.7%、95.3 %、95.8 %、
96.4 %和 97.7 %。综上结果, 可以确定我们扩增获得
的序列为桐花树的 EF1A 序列。利用 MEGA5.1 软件
的邻接法将 AcEF1A 氨基酸序列与从 NCBI 的
GenBank 中下载的多条植物 EF1A 序列构建进化树,
结果显示 AcEF1A 氨基酸序列与琴叶拟南芥和番茄
(Solanum lycopersicum)等的EF1A序列聚为一支, 表
明 AcEF1A 基因可能与它们的亲缘关系更近(图 4)。
3.4 桐花树 AcEF1A 基因在不同组织中的表达
采用荧光定量 PCR的方法比较了AcEF1A基因
在桐花树不同组织(叶、茎和根)中的表达水平。设定
AcEF1A 基因在桐花树成熟叶片中的表达水平为 1, 根
据 AcEF1A 基因在各组织中的相对表达量作柱形图。
如图 5 所示, AcEF1A 基因在茎尖中的表达量高于根中
的表达量(p<0.05), AcEF1A 基因在叶中的表达量与茎
尖和根中的表达量没有显著差异(p>0.05)。
4 期 彭亚兰, 等. 红树植物桐花树 EF1A 基因的克隆与表达分析 709

图 3 EF1A 蛋白的多序列比对结果
Fig. 3 Multiple alignment of the amino acid sequences of EF1A proteins
3.5 桐花树AcEF1A基因在不同压力胁迫下的表达
利用荧光定量 PCR 技术对 AcEF1A 基因在低
温、高盐、干旱和重金属 Cd 等多种压力胁迫下的表
达水平变化进行分析。设 AcEF1A 基因在未受胁迫
的桐花树叶片(对照)中的表达量为 1, 计算出受压力
胁迫后的桐花树叶片中 AcEF1A 基因的相对表达量,
710 生 态 科 学 33 卷

图 4 利用 MEGA 5.1 软件构建的基于 EF1A 氨基酸序列的 NJ 系统进化树
Fig. 4 NJ Phylogenetic tree based on EF1A amino acid sequences using MEGA 5.1

图 5 AcEF1A 基因的组织表达分析
Fig. 5 Spatial expression of AcEF1A under normal
condition
作柱形图(如图 6)。从图中可以看出, 在压力胁迫下,
AcEF1A 基因的表达量有不同程度的上调。在低温胁
迫过程中AcEF1A基因的表达量在胁迫6 h时呈现微
量增加(1.8 倍, p<0.05); 高盐胁迫过程中 AcEF1A 基
因的表达量在胁迫 12 h 时呈现微量增加(2.1 倍,
p<0.05)。在干旱和重金属 Cd 胁迫过程中, AcEF1A
基因的表达峰值均出现在胁迫 12 h 时, 分别为 2.7
倍和 3.5 倍(p<0.05); 胁迫 48 h 后, 其表达水平仍然
明显高于对照 (p<0.05)。我们的研究结果表明 ,
AcEF1A 基因的表达可能受高盐、干旱和重金属胁迫
的诱导。

图 6 AcEF1A 基因在不同压力胁迫条件下的表达分析
Fig. 6 Time-course of AcEF1A gene expression in leaves of
A. corniculatum in response to different abiotic stresses.
4 讨论
本试验通过基因同源克隆技术和 RACE 技术成
功获得了桐花树的一种延伸因子基因, 命名为AcEF1A。
该基因序列全长 1 778 bp(GenBank 登录号: KC416649),
包括一个 1 350 bp的开放阅读框(ORF), 编码一个分
子量为 49.38 kDa, 具有 449 个氨基酸的多肽。该基
因在 3’非编码区(3’UTR)具有一个唯一的加尾信号
(ATTAAA), 该加尾信号在距终止密码子 32 bp 处,
距 Poly-A 尾 282 bp 处。
EF1A 是蛋白合成过程中主要的翻译因子, 其
结构在进化过程中非常保守。多序列比对结果表明
4 期 彭亚兰, 等. 红树植物桐花树 EF1A 基因的克隆与表达分析 711
桐花树 AcEF1A 基因的推导蛋白序列与其他多种高
等植物的 EF1A 氨基酸序列具有高度同源性, 其
中与琴叶拟南芥的 EF1A 氨基酸序列相似性高达
97.7%。SMART 分析结果表明 AcEF1A 基因编码的
氨基酸序列具有 EF1A 蛋白保守的 GTP-EFTU 结构
域、GTP-EFTU-D2 结构域和 GTP-EFTU-D3 结构域,
分别位于肽链氨基端的第 5-226、248-315 和 321-430
位。GTP-EFTU 结构域是 GTP 依赖性蛋白的典型结
构, 在植物的EF1A和EF2蛋白中都非常保守, 它的
主要功能使非启动的 tRNA 结合到核糖体上。该保
守结构域中存在多个GTP/Mg2+结合位点和1个GTP
酶(GTPase)活性位点, 该结构域可能参与了 EF1A
蛋白与 GTP 的结合及 GTP 的水解过程。EF1A 蛋白
的 GTP-EFTU-D2 结构域具有 β桶结构, 据推测, 该
结构域可能参与了 EF1A 蛋白与 GTP 的结合过程。
GTP-EFTU-D3结构域是EF1A蛋白典型的C端结构
域, 同样具有 β桶结构, 据推测, 该结构域可能参与
了EF1A与负载 tRNA的结合以及与EF1B的结合[9]。
桐花树 AcEF1A 氨基酸序列的保守结构表明该基因
编码的蛋白与其他植物的 EF1A 蛋白一样, 在蛋白
质合成的延伸过程中起着重要作用。
本试验利用荧光定量 PCR 方法检测了 AcEF1A
基因在桐花树不同组织中的表达情况, 结果显示该
基因在植株茎尖中的表达水平最高, 成熟叶中的表
达量次之, 全根中的表达量最低。这一结果表明
AcEF1A 基因的表达水平可能与桐花树的生长状况
有关。茎尖组织是植株细胞生长最旺盛的组织, 在
这一组织中有大量的蛋白进行合成和修复, 这可
能是 AcEF1A 基因在茎尖中的表达量较高的原因
之一。与我们的研究结果相似, 潘刚等[19]发现桑
树(Morus alba)的延伸因子基因 MaREF 在快速生
长的幼叶中的表达量最高 , 其次为茎和芽 , 而在
根中表达量最低。同样, Vijaykumar 等[20]也发现甘
蔗(Saccharum officinarum)的 EF1A 基因在生长叶片
中的表达量显著高于根中的表达量。这些研究结
果说明植物的延伸因子基因在其生长发育过程中
起着重要作用, 其表达水平同细胞生长及繁殖速
度相关。
EF1A 蛋白是一种多功能蛋白, 除了参与蛋白
质的生物合成外, 还参与了许多其他的生理过程[11]。
本试验利用荧光定量PCR方法检测了桐花树叶片中
AcEF1A 基因在高盐、干旱、低温和重金属胁迫下的
表达情况, 结果显示低温、高盐、干旱和重金属胁
迫下 AcEF1A 基因的表达量有不同程度的上调。与
我们的研究结果相似, 其他多种植物的 EF1A 基因
也可以被非生物胁迫压力诱导, 如盐地碱蓬(Suaeda
salsa)的延伸因子基因 SsEF-1α可以被高盐、高渗和
低温胁迫等条件诱导[21], 玉米(Zea rnays)叶片中的
EF1A 基因可以被低温诱导 [22], 红树植物白骨壤
(Avicennia marina)的 EF1A 基因可被高盐诱导[12]。最
近的一项研究[23]通过蛋白质组学方法证实了马铃薯
(Solanum tuberosum)组织培养细胞的 EF-1α 蛋白的
表达量可以被PEG介导的高渗压力及高盐压力所诱
导。EF1A 是细胞蛋白质合成过程的重要调控因子。
受到非生物压力胁迫后, 植物细胞为了抵御胁迫带
来的伤害会及时调整细胞内基因组的表达结构, 在
细胞内大量合成多种抗逆蛋白[7]。压力胁迫下细胞
内蛋白质合成量的增加可能是导致 EF1A 基因表达
量增加的原因。此外, EF1A 基因表达量的增加也可
能是由于 EF1A 蛋白参与了压力胁迫响应的其他重
要过程。我们的实验结果表明 AcEF1A 基因可能参
与了植物响应非生物胁迫压力的过程, 但 AcEF1A
蛋白在非生物胁迫压力的响应过程中的具体作用机
制还有待进一步的研究。
综上所述, 本研究通过 RACE 方法从桐花树中
分离到一个延伸因子基因(AcEF1A), 并利用荧光定
量PCR技术对该基因的组织表达特性及其在多种压
力胁迫下的表达水平变化进行了分析。研究结果显
示该基因在快速生长的茎尖中表达量最高; 该基因
的表达受低温、高盐、干旱和 Cd 等多种非生物胁迫
的诱导。这些结果表明 AcEF1A 基因可能参与了植
物的生长发育过程及植物对多种压力的响应过程。
今后进一步的研究应集中在 AcEF1A 编码蛋白在逆
境胁迫下的作用机制和功能, 以及桐花树中其他
EF1A 同源基因的克隆和表达分析, 这些研究将有
助于进一步揭示桐花树的抗逆机制。
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