全 文 ：第27卷第2期 生 态 科 学 27(2)：90．94
2008年4月 EcologicalScience A” 2008
SCGE技术检测镉对背角无齿蚌血细胞DNA的损伤
周 侃，欧阳珊，吴小平‘，吴甜
南昌大学生命科学学院；南昌大学鄱阳湖湖泊生态与生物资源利用教育部重点实验室，南昌33003l
【摘要】 以背角无齿蚌伪加d锄细讹m施册口伽·彻铴加)为研究对象，利用单细胞凝胶电泳技术检测不同浓度及不同染毒
时间氯化镉对背角无齿蚌血细胞DNA的损伤作用。结果显示，染毒后的背角无齿蚌血细胞均出现了拖尾现象，各染毒组
与对照组相比，拖尾增长明显。剂量效应组中，蚌暴露在不同浓度(O、l、lO、50mg·L．1)的氯化镉中72h，各组蚌血细胞
DNA平均迁移长度及彗尾Dl蛆含量均明显增加，与阴性对照组比较差异显著(p时间效应组中，蚌暴露在10mg·L．1的氯化镉中分别24、48、72、96h，随着氯化镉染毒时间的延长，各染毒组细胞E盱叮A
平均迁移长度及彗尾DNA含量与O时间组比较差异显著(p<0．01)，但时间一效应关系不明显。
关键词：氯化镉；背角无齿蚌： 单细胞凝胶电泳；DNA损伤；彗星图像
中图分类号：Q178．5l+7 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2008)02一090-05
DetectionofDNADamagesinHemoc”esof彳．’阳Dd铴刀口H懈口嗣瞄打刀口Inducedby
CadmiumwithsingleC UGelelectrophoresisAssay
ZHOUI：柚，OIr协NGSh柚，、ⅣUXia0．ping，、VUTi柚
collegec5fL瓣sci吼c嚣．Nancho呜Un毗rs鲰Na眦h骶g：T}leK哕Lab．可P0ynngLalceEcoio斟傩dBio-r嚣ot胛eUtitizntion．
Mi蛾呻西Edtlcntion．Chim，N口∞h硼gUniversi劬N锄ch锄g330031．ch妇
Abstnct：Inllisstlldy，m邺∞ls■肋dD一细wDD翻口，埘wD。棚口，垴)wemctlos∞船the他searcho协∞t．We鹪s器scd也eposslble
DNAdalllageiIlh踟oc叽懿ofmus∞ls惦ingtlIesingle∞llgceI仪=仃ophor％is雒鞠*R豁uItsshowcdll习唰弧Dcytesimag髓which
exposedt0cadimi啪p陀s印tcdcomet诅ils，comparedⅡleexp‘sed伊oupswi廿lnegatiVe∞m仃．ol孕oup，cxi蚰甜significant
di髓崩1c懿．M璐∞lswe托exposedt0di丘．e崩1tcadmi岫chl耐dec∞伽缸眦ions(O，l，10，50mg‘L-I)帕sI，ectivelyfor72hou幅，吐呛
嘲ultssho、ⅣedthattlleavI啪gel朗gtIl0fDNAmi鲫i∞andtailDNA％inallexposedg唧sw笛si印ific锄uyhigll盯tt啪tllat
ofnegativec∞仃olgrol刑ptime-e行ect印叩s(24，48，72，96h)柚dazerotime咖仃olgro叩袱髓setup，tlle鲫啪gel朗gmofDNAmi卿i∞柚dtail
DNA％underdi缗玎entexp(sedtim骼iIlcadTIli岫chl耐dew够signifi啪tIylligh盯tlll锄∞mtiIne伊伽叫p<0．01)，but∞
sig州fi∞mttime-eff酏trelatio粥llip锄ongmetc鲫edconcen删or塔．
KeywortIs：cadmiumchl嘶d!e；爿舯面n细wa优妇M啪优融瞰；single∞ngclelec仃Dpho溺is(SCGE)；DNAdamage；comet
inla|ge
收稿日期：2007．11．15收稿，2008．02．20授受
基金项目：江西省学科学术带头人计划(2003．154)．中德国际合作项目资助
作者简介：周侃(1985一)，女，硕士研究生，主要从事淡水贝类分子毒理学和资源利用研究。E-眦il：zIlouk如906@163．咖
宰通讯作者：吴小平，男，教授，博士生导师，E．mail：xpwu@ncIL。du．cIl
万方数据
2期 周 侃，等：SCGE技术检测镉对背角无齿蚌血细胞DNA的损伤 91
l前言(Introdudion)
单细胞凝胶电泳技术(Singlecengel
elec仃ophoresis舔say，SCGE)又称彗星试验(Comet
嬲say)，是近年发展起来的单细胞水平上检测真核细
胞DNA损伤和修复的方法，与其他检测DNA损伤
的细胞遗传学方法如荧光原位杂交、姐妹染色单体
互换和微核试验相比，有很多优点，它不要求细胞的
活跃分裂，无需放射性示踪剂，简便、快速、灵敏，
适合体内外不同类型实验和各种类型细胞。
镉是一种典型的富集型有毒重金属，大量含镉的
污水排入河流湖泊中，通过食物链在各营养级的生物
体内蓄积，造成水生生物肾、肝、骨髓、血液、睾丸
及免疫系统等产生一系列损伤【l捌，除了对机体器官
和细胞的损害外，镉对DNA的损伤将会引起遗传上
的毒害p。】，严重影响了水生生物的健康，导致水生
生物种质资源衰退。
国内外从分子角度利用SCGE技术研究镉对水生
生物的影响已有一些报道，如镉对鲫鱼淋巴细胞和肾
细胞DNA的损伤，对紫贻贝鳃细胞DNA的损伤等
p刁J。不同重金属和化学物质对海洋贝类DNA损伤的
研究较多睁¨】，而对淡水贝类DNA损伤的研究甚少17】。
背角无齿蚌(彳玎D面砒7w0口锄舰wDD诫册口)是
一种常见的淡水贝类，其运动缓慢，对环境变化也较
为敏感，是一种很好的指示生物，可用于长期监测淡
水水体的污染状况。作者应用单细胞凝胶电泳技术研
究镉对背角无齿蚌血细胞的遗传毒性，从遗传毒理学
的角度进行评价，为筛选水环境中基因毒剂指标、进
一步阐明镉的毒理学作用机制、证明SCGE技术为水
环境监测的有效途径提供更多的理论依据。
2材料与方法(Materiafsandmethods)
2．1试剂
CdCl2·2．5H20，分析纯，为上海国药集团化学试
剂有限公司产品；正常熔点琼脂糖删MA)、佰ton
x-100、二四基亚砜(DMSO)、溴化乙锭(EB)、EDlA、
Tris为Amresco公司产品，十二烷基肌氨酸钠(SLS)
为北京军药卫业公司产品；低熔点琼脂糖(LMA)是北
京夏斯生物公司产品：NaCl、Kcl、Na2HP04·12H20、
KH2P04、NaOH、浓HCl、二水柠檬酸三钠、柠檬酸、
葡萄糖均为国产分析纯试剂。
2．2供试蚌及饲养
采自鄱阳湖的背角无齿蚌，置于实验室的水族缸
中，用曝气的自来水暂养，投喂新鲜栅藻以适应实验
室环境。一周后开始染毒实验，实验期间不投食。
23实验方法
2．3．1染毒方案
120个健康背角无齿蚌，平均壳长6．5士0．2cm，
壳宽4．钍0．2cIll。
实验分剂量效应和时间效应两部分。剂量效应
组：在预实验基础上，以蚌不出现急性、亚急性中
毒症状为原则，使氯化镉浓度分别稀释成lmg·L一，
10mg·L．1和50mg·L-1，蚌染毒72h，同时设一个不
投毒的阴性对照组。时间效应组：在lOmg·L-。染毒
条件下，设24h，48h，72h，96h四个时间效应组，
设一个O时间对照组。每个实验条件下放五蚌，设3
个平行组。在室温下(25℃～30℃)进行实验，期
间不换水，不喂食，持续充氧。实验期间未出现死亡
现象。
2．3．2细胞悬液的制备
用一次性注射器从蚌的闭壳肌静脉窦中抽取l
111lL血样，迅速加入含有1mL抗凝剂的离心管中混
匀，PBS缓冲液使血细胞浓度调节至106cells·mL．1。
置于4℃冰箱中保存。
2．3．3单细胞凝胶电泳试验
参照singll【12】等方法略加改进进行碱性SCGE实
验。
(1)制片：采用两层铺胶法。1％的正常熔点琼脂
糖(NMA)铺于载玻片上为第一层胶。75此血细胞悬
液和150uLO．6％的低熔点琼脂糖混匀后滴于第一层
胶上面，迅速用盖玻片压平，置于4℃凝固，此为第
二层胶。
(2)裂解：待凝胶干后，揭去盖玻片，载玻片水
平浸入含细胞裂解液(pHl0，1％十二烷基肌氨酸钠，
O．OlmoI．L。1Tris．HCl．O．1mol·L_EDl’A，用前加1％
TritonX．100和lO％DMsO)的培养皿中，4℃静置
2h。裂解结束后，载玻片用PBS漂洗三次。
(3)解旋：载玻片并列置于水平电泳槽中，倒入预
冷的电泳缓冲液fO．001m01．L。EDlA，0．3mol·L-1
NaoH)，4℃下避光静置20min。
(4)电泳：电压25V，电流300IIA，在4℃下避
光电泳25min。
(5)漂洗和中和：电泳完毕后，取出载玻片，蒸
万方数据
馏水漂洗和Trisb舔e缓冲液中和三次。
(6)染色和观察：每块胶滴加20烬·rnL川EB染色
20min后，用蒸馏水漂洗三次。盖上盖玻片，在荧光
显微镜(515咖的激发波长)放大倍数lO×20下观察，
并拍照。
以上所有含细胞的操作均需在暗室、黄光或红光
下操作。
23．4分析和统计
用cAsP软件分析图像，每只蚌做一块胶，每
块胶随机分析30个细胞，统计出每个细胞的尾部
DNA含量和尾长的平均值。用单因素方差分析染毒
组和时间组彗尾DNA百分含量、DNA迁移长度与
对照组的差异，sPSS软件分析剂量效应和时间效应
的显著性。
3结果与分析(Resu№andan lysis)
3．1ScGE电泳图像
细胞内的DNA是环状附着在核基质上，在细胞
裂解过程中，核基质被溶解、抽提，细胞膜、核膜及
其它膜结构受到破坏，胞内蛋白质、lⅢA及其它成
分扩散至裂解液中，DNA仍保留一核样结构。染毒
的细胞DNA链上则存在缺口，碱解旋使DNA超螺旋
变得松驰，同时缺口处暴露出带阴电荷的DNA在电
场力作用下向阳极迁移，含DNA链缺口越多，则进
入尾部的DNA越多，彗尾越长。因此，通过测定DNA
尾长或尾部DNA含量来反映DNA损伤程度。未损伤
细胞在电泳中DNA仍停留于核中形成圆形荧光团【l31。
背角无齿蚌用CdCl2染毒后，引起血细胞DNA的
断裂，在电场作用下形成拖尾，在荧光显微镜下观察
DNA被溴化乙锭染成红色，形成彗星状拖尾。
染镉72h后蚌血细胞DNA彗星图像(200×)，经
CAsP软件分析后显示如上(图1a．d)：对照组的正
常细胞呈亮的圆形荧光团图像，几乎没有出现彗星拖
尾，能清晰看到彗星的头部(红色区域)，而看不见彗
星尾部(图1a)；而实验组均出现头尾清晰可辨的彗
星样图像，显示出了彗星的头部(红色区域)和尾部
(紫色区域)。且随着氯化镉浓度的不断增大，背角
无齿蚌血细胞DNA损伤随之加重，彗星尾长也随之
变长(图l¨)。
3．2不同浓度氯化铺对背角无齿蚌血细胞DNA损伤
由表l可知，各剂量组彗星细胞数、彗尾DNA
百分含量、DNA平均迁移长度与阴性对照组比较有
显著差异(p<0．01)：此外，随着氯化镉染毒剂量的
增加，各剂量组彗尾DNA百分含量、DNA平均迁移
长度均逐渐增加。在实验浓度范围内，存在显著的剂
量一效应关系(p<0．01)，浓度与尾长的相关回归方程
为y=0．42x+15．4l，F0．96。
3．3不同染毒时间对背角无齿蚌血细胞DNA损伤的
影响
由表2可知，在10mg·L．1氯化镉染毒条件下，
斟8h之前随着染毒时间的延长，各时间组彗星细胞
数、彗尾DNA百分含量、DNA平均迁移长度随时间
延长逐渐增加，仁72h时达到最大值，仁96h时下降；
与0时间组比较，各时间组的彗尾DNA百分含量、
DNA平均迁移长度明显增加，且差异有显著性
(刚．01)，但未发现明显的时间—效应关系。
4结论与讨论(ConcIusionand scussion)
镉等重金属能提高体内活性氧族(ROS)的活性，
寰l不同浓度■化■对臂角无齿蚌血细奠DNA损伤结果
TIbIelE仃缸ofcadmiumatdjffe咖td懈oⅡDNAdama群inhaemocytesof爿M加缸肋口觑肋枷n加朋
注州d哟：表中值为平均值士标准偏差，‘‘为各剂量组与对照组比较，p<0．们；w汕incolumns。me扑啦S．D．，‘‘旭P嗍tsi印mc卸tdi侬肥nce矗．om
neg撕vcc∞臼Dl，p<0．Ol。
万方数据
2期 周 侃，等：SCGE技术检测镉对背角无齿蚌血细胞DNA的损伤
a．对照组
a．negatiVecon臼olgro叩
b．1Ing·L-l浓度组
b．1mg·L．1conceI!时ation伊oup
c．10mg·L．1浓度组
c．10mg·L。1conc鄂I仃ation伊Dllp
d．50mg-L．1浓度组
d．50Ing·L．1c∞ce曲嘶ongmup
啊l CASP软件分析背角无齿蚌血细_IDNA损伤的蕾■圈●
Fig．1CAsPoftwa忡anaIyzeSCGEimageofhaem∞ytesof彳．帅伽妇刀口枷Dd勋撑4inducedbycadmiumchlor埘e．
衰2不同时间段氯化铺对背角无齿蚌血细臆DNA损伤结果
1’abIe2 E仃酏tOfcadm．umOnDNAdamageinhaem仳yt鹤Of／|^口db一缸朋l伽妇甩4M口口妣加underifrerentexpOsed6m鹤
注(Note)：表中值为平均值士标准偏差，。‘为各时间组与O时间组比较，p(o．Ol；withincolumns，me帅s士s．D．，‘+rclw℃鲫ltsi印i6camdiffbr朗∞fi_om
ncgativc咖缸口I’p<0．Ol。
ROS能攻击各种各样的生物大分子，例如DNA，蛋白
质和脂质，引起氧化损伤，在哺乳动物中，已发现氧
化损伤将致细胞死亡，组织损害，致癌作用和老化【141。
JuheG．【71等利用斑马蚌进行体内试验，暴露于4、
40、100¨M的氯化镉中一星期后，发现其血细胞彗
尾DNA百分含量随着氯化镉浓度的增加呈现显著的
剂量效应。国内研究者将鲫鱼腹腔注射O．】25、O．313、
0．626和1．250mg．kg。‘的氯化镉，各剂量组淋巴细胞
DNA平均迁移长度逐渐增加，在实验浓度范围内，
存在明显的剂量一效应关系‘31。同样有关镉致哺乳动
万方数据
物DNA损伤报道也屡见不鲜，应用SCGE研究镍和镉
对人外周血淋巴细胞的DNA损伤作用，发现氯化镉
会致DNA单链、双链断裂和DNA．蛋白质交联【15】。本
实验蚌血细胞彗星细胞数随着染镉剂量的增加逐渐
增多，彗尾DNA含量、彗尾长度与镉剂量呈显著的
剂量效应。
本实验发现在48h内，彗星细胞数、彗尾DNA含
量、彗尾长都随着染毒时间的延长而变大，卢72h时
DNA的损伤达到最大值，在96h时下降，未发现有明
显的时间一效应关系。很多研究也己发现，动物在较
长时间的毒素体内暴露后，DNA损伤的指标并没有
显著升高，甚至呈现降低的趋势。这可能是因为DNA
损伤修复系统的激活和酶系统的反作用，或是由于随
着暴露时间的延长，DNA断裂程度较高，以致在电
泳时断片可能丢失【4·15。1引。当然，体内、体外染毒方
式的不同，各种动物的细胞对某种毒素的敏感度不
同，将引起的细胞损伤时间段和修复时间段的不同。
实验中发现未染毒的对照组的少量细胞也出现
了彗星拖尾，这可能是因为离开活体的细胞不可避免
地会受到某些非生理条件的不利影响，如日光的照射
等，导致了微量DNA在电泳中迁移。
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SCGE技术检测镉对背角无齿蚌血细胞DNA的损伤
作者： 周侃， 欧阳珊， 吴小平， 吴甜
作者单位： 南昌大学生命科学学院;南昌大学,鄱阳湖湖泊生态与生物资源利用教育部重点实验室,南昌
,330031
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGICAL SCIENCE
年，卷(期)： 2008,27(2)
被引用次数： 3次

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刊论文]-公共卫生与预防医学2005,16(1)
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究[期刊论文]-工业卫生与职业病2007,33(1)

引证文献(4条)
1.汪桂玲.苏翔.李家乐.白志毅 背角无齿蚌基因组(GT)n微卫星DNA特征[期刊论文]-生态学杂志 2011(1)
2.党炳俊.王君.杜启艳.常重杰 单细胞凝胶电泳检测百草枯对大鳞副泥鳅血细胞DNA的损伤[期刊论文]-水生态学杂
志 2011(5)
3.曹哲明.杨健 背角无齿蚌不同组织的基因组DNA甲基化分析[期刊论文]-生态环境学报 2009(6)
4.汪桂玲.苏翔.李家乐.白志毅 背角无齿蚌基因组(GT)n微卫星DNA特征[期刊论文]-生态学杂志 2011(1)


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