全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):63-67
铁 皮 石 斛（Dendrobium officinale Kimura et Mi-
go），又名黑节草，为兰科石斛属多年生草本植物，
主要分布于浙江、云南及陕西等地。铁皮石斛具有
极高的药用价值和经济价值，其新鲜茎或干燥茎均
可入药，民间有“救命仙草”之美誉，现代药理学
研究表明铁皮石斛具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、
提高免疫力等诸多功效［1］。铁皮石斛自然条件下不
易萌发，生长极其缓慢［2］，对生长环境条件要求苛刻。
由于长期的过度采集加上生态环境的恶化，铁皮石
斛野生资源日趋稀少。为保护这一珍稀物种，近年
来国内外广泛开展铁皮石斛组织快繁技术的研究，
已确定了通过组织培养培育大量试管苗，发展铁皮
石斛人工栽培是解决铁皮石斛资源紧缺问题的有效
途径［3］。
目前铁皮石斛外植体材料选用最为广泛的是种
子和茎段。以种子作为外植体，操作简单，增殖系
数高，分化能力较强［4］，但后代性状不稳定易变异。
而用茎段为外植体诱导时间短、发生过程简单，能
收稿日期 ：2015-05-25
作者简介 ：欧阳凡，男，硕士研究生，研究方向 ：保健食品的研究与开发 ；E-mail ：oouuyyff@163.com
通讯作者 ：董文宾，男，教授，博士生导师，研究方向 ：食品新材料制备及应用 ；E-mail ：452822092@qq.com
铁皮石斛茎段快繁技术的研究
欧阳凡1  董文宾1  付瑜1  樊成2  李雨虹1
（1. 陕西科技大学食品与生物工程学院，西安 710021 ；2. 陕西省产品质量监督检验研究院，西安 710048）
摘 要 ： 通过组织培养建立铁皮石斛快繁体系，为更好利用开发铁皮石斛提供原料。以铁皮石斛茎段为外植体，研究不同
种类和浓度配比的激素和天然添加物对组培过程中不定芽的诱导和丛生芽的增殖的影响，筛选出各阶段最适培养基。结果表明，
不定芽诱导最适激素配比为 NAA 1.0 mg/L + BA 2.0 mg/L，丛生芽增殖最适培养基为 NAA 0.5 mg/L + BA 1.0 mg/L + 香蕉 100 g/L + 活
性炭 100 g/L。以茎段为途径建立铁皮石斛快繁体系高效稳定的获得组培苗是可行的。
关键词 ： 铁皮石斛 ；不定芽 ；丛生芽 ；快繁
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.010
On the Rapid Propagation Technique of Stem Segments of
Dendrobium officinale
OUYANG Fan1 DONG Wen-bin1 FU Yu1 FAN Cheng2 LI Yu-hong1
（1. College of Food & Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021 ；2. Shaanxi Institute of Product
Quality Supervision and Inspection，Xi’an 710048）
Abstract: A rapid propagation system was established by tissue culture in order to provide raw materials for better use and development
of Dendrobium officinale. Using stem segments of D. officinale as explants，effects of the differential kinds and concentrations of plant growth
regulators and natural additives on the induction of adventitious shoots growth and proliferation of cluster shoots were studied ；and the optimal
mediums at different culture stages were selected. Results showed that the optimal hormone ratio for induction of adventitious shoots was NAA 1.0
mg/L and BA 2.0 mg/L，a combination of NAA 0.5 mg/L，BA 2.0 mg/L，banana juice 100 g/L and activated carbon 100 g/L was the optimal
medium for the proliferation of cluster shoots. It is feasible to obtain the efficient and stable plantlets by establishing high efficiency and rapid
propagation system from stem segments of D. officinale.
Key words: Dendrobium officinale ；adventitious shoot ；cluster shoot ；rapid propagation
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.364
较好地保持母本的生物学性状和经济性状［5］，但增
值系数低、苗存活率低。本研究探讨了不同激素和
天然添加物对茎段组培过程中丛生芽的诱导和增殖
的影响，并筛选出最佳培养基。
1 材料与方法
1.1 材料
铁皮石斛为浙江雁荡山软杆矮脚品种，由陕西
省略阳县秦脉生物科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 灭菌处理 选取长势良好，均匀，叶片繁茂
的铁皮石斛当年生幼嫩茎段，流动自来水冲洗 10
min 后用滤纸擦净。在紫外线照射 20 min 过的超净
工作台上用剪刀将茎段切成长度为 1-1.5 cm 的带节
小茎段，先用 75% 酒精浸泡 1 min，后用 0.1% 升汞
消毒 10 min，无菌水冲洗 6-7 次待用。
1.2.2 不定芽的诱导
1.2.2.1 单因素实验 将消毒好的茎段接种在添加
不同浓度 6-BA、NAA 和蔗糖的不同处理的 MS 基本
培养基上，进行丛生芽的诱导培养。每个处理接种
外植体 6 瓶，每瓶接种 5 个茎段，重复 3 次。培养
30 d 后统计不定芽的诱导数和诱导率。诱导率（%）
=（诱导出不定芽的外植体数 / 总外植体数）×100%。
1.2.2.2 正交实验设计 根据单因素实验选出每种
因素最优浓度，进行 L9（34）三因素三水平正交实
验设计，实验操作处理同上。
1.2.2.3 丛生芽的增殖 在不定芽诱导培养基中培
养 60 d 后，选取长 1-2 cm 的不定芽切下，接种到
添加不同 6-BA 和 NAA 的 9 种不同处理的 MS 基本
培养基上，进行丛生芽增殖。每个处理接不定芽 6 瓶，
每瓶接种 4 个芽，重复 3 次。培养 30 d 后继代培养，
以 30 d 为一个周期，90 d 后统计丛生芽的繁殖系数。
繁殖系数 = 增殖所得丛生芽的总芽数 / 接种长
出丛生芽的芽数
选取长势均匀一致的丛生芽，接种到附加不同
天然添加物的基本培养基，每个处理接种丛生芽 2
株，每瓶接种 10 瓶，重复 3 次。培养 30 d 后统计
芽的株高、增殖芽数和增殖叶数。
1.2.3 培 养 条 件 实 验 采 用 的 培 养 温 度 为
（25±1）℃，光照强度 2 000 lx，光照时间为 12 h/d。
1.2.4 数据处理 运用 SPSS23.0 进行数据方差分析
和显著性研究。
2 结果
2.1 单一因素对不定芽诱导的影响
生长调节因子植物激素，是植物组织培养中发
挥生物学效力最强的培养因素，在植物组织培养中
最常用的是生长素和细胞分裂素。本实验选用了其
中最具代表性的 NAA 和 BA 来研究。在接种茎段后
的 7-15 d 内，不同处理瓶内的茎段开始萌发出细嫩
小芽。空白对照率先萌芽，添加激素的处理组略有
迟缓，但后期从芽的数目和芽的健壮情况来说都明
显优于空白组。如图 1 所示，随着 BA 的加入会先
减弱不定芽的诱导，随着浓度增高又明显促进了芽
的诱导，当达到 2.0 mg/L 后其对芽的诱导开始起到
抑制作用。如图 2 所示，NAA 对不定芽诱导的影响
是先增大后减小，在 0.6-1.0 mg/L 浓度范围内表现
出显著的促进作用，在 0.8 mg/L 到达最高点。如图
3 所示，蔗糖对不定芽诱导率的影响较为平缓，诱
导率维持在一定水平内波动，可以发现 30 g/L 的蔗
糖添加量有最大的促生芽作用。
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
0
10
20
30
40
50
60нᇊ㣭䈡ሬ⦷%
BA⎃ᓖmg·L-1
图 1 BA 浓度对不定芽诱导的影响
2.2 正交实验分析结果
根据前面单因素实验设计得出每种因素的最佳
浓度，设计三因素三水平正交实验，如表 1 所示。
以 NAA、BA、蔗糖综合作用进行不定芽诱导
正交实验，结果（表 2）表明，3 种因素以适当比例
综合作用比单独使用时不定芽的诱导率要优于任何
一种激素单独处理。处理 8（NAA 1.0 mg/L+BA 2.0
2016,32(3) 65欧阳凡等：铁皮石斛茎段快繁技术的研究
mg/L+ 蔗糖 26 g/L）达到了 86% 的最高诱导率（图
4），处理 9 次之，相比于单一因素有显著的综合促
进作用。由表 3 方差分析可知，NAA 和 BA 对不定
芽的诱导影响显著，且 BA 要重要于 NAA，蔗糖对
其影响不显著。综合单因素和正交实验设计，得出
不定芽诱导培养基最优配方为：NAA 1.0 mg/L+BA 2.0
mg/L+ 蔗糖 30 g/L。
2.3 不同激素配比对丛生芽增殖的影响
针对丛生芽的增殖，设计了两因素三水平的完
全随机实验，增殖的丛生芽如图 5 所示。统计结果
（表 4）表明，所进行的激素配比都能显示对芽的增
殖有促进作用。当 NAA 在较低浓度时 BA 浓度的变
化对丛生芽增殖的影响无明显区别，随着 NAA 浓度
的提高，BA 对丛生芽增殖的影响呈现着先增大后减
小的趋势，说明或高过低浓度的 BA 对芽的增殖有
抑制作用。整体来看，NAA 对芽增殖的影响随着浓
度增高而逐渐开始抑制。选取合适的浓度对芽的增
殖有显著的促进作用，其中处理 5（图 5-A）最优达
到了 4.5 倍的繁殖系数，茎秆粗壮叶片繁茂丛生芽
众多，其次处理 1（图 5-B）的繁殖倍数有 3.6，表
明此激素配比下也有明显的促生长作用。综合来看，
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0
10
20
30
40
50
60
70н䈡ሬ⦷ᇊ㣭%
NAA⎃ᓖmg·L-1
图 2 NAA 浓度对不定芽诱导的影响
20 25 30 35 40
0
5
10
15
20
25
30
35
40
нᇊ㣭䈡ሬ⦷% 㭇㌆␫࣐䟿g·L-1
图 3 蔗糖添加量对不定芽诱导的影响
表 1 三因素三水平正交试验设计
因素水平 NAA/（mg·L-1） BA/（mg·L-1） 蔗糖添加量 /（g·L-1）
1 0.6 1.8 26
2 0.8 2.0 30
3 1.0 2.2 34
图 4 不定芽的诱导
表 2 三因素三水平正交试验结果与分析
因素 NAA BA 蔗糖 空白 诱导率 /%
实验 1 1 1 1 1 67
实验 2 1 2 2 2 78
实验 3 1 3 3 3 71
实验 4 2 1 2 3 72
实验 5 2 2 3 1 78
实验 6 2 3 1 2 76
实验 7 3 1 3 2 75
实验 8 3 2 1 3 86
实验 9 3 3 2 1 80
均值 1 72 71.333 76.333 75
均值 2 75.333 80.667 76.667 76.333
均值 3 80.333 75.667 74.667 76.333
极差 8.333 9.334 2 1.333
表 3 三因素三水平正交试验结果的方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F 比 F 临界值 显著性
NAA 105.556 2 29.684 19 *
BA 130.889 2 36.808 19 *
蔗糖 6.889 2 1.937 19
误差 3.56 2
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.366
得出丛生芽增殖的最优激素配比为 ：NAA 0.5 mg/L
+BA 1.0 mg/L。
香蕉汁的功能最全面且显著，活性炭可促进丛生芽
增殖。从而得出丛生芽增殖的最佳培养基为：NAA 0.5
mg/L + BA 1.0 mg/L + 香蕉汁 100 g/L + 活性炭 100 g/L。
A B
图 5 丛生芽的增值
表 4 两因素三水平完全随机实验结果
实验组别 NAA/（mg·L-1） BA/（mg·L-1） 平均繁殖系数
1 0.2 0.5 3.62±0.17b
2 0.2 1.0 3.14±0.12c
3 0.2 2.0 3.20±0.05c
4 0.5 0.5 1.57±0.32f
5 0.5 1.0 4.56±0.38a
6 0.5 2.0 2.85±0.07d
7 1.0 0.5 2.07±0.01e
8 1.0 1.0 2.81±0.03d
9 1.0 2.0 1.66±0.12f
注 ：采用 Duncan’s multiple range test 方法分析，同一列不同字母表示显
著性差异（P<0.05，n=3），下同
2.4 不同天然添加物对丛生芽增殖的影响
在铁皮石斛的组培快繁中，天然添加物的加入
往往会对组培苗的生长造成一定的影响。本次实验
中选用了香蕉汁、椰子汁、马铃薯汁和活性炭，结
果（表 5）显示，对比空白组，香蕉汁（图 6-a）在
株高、增殖芽数和增殖叶数都有一定的升高，尤其
是叶片数显著增多，表明香蕉汁对丛生芽的生长有
综合性多方面的促进作用，尤其是促进叶的发育。
椰汁与空白对照相比无明显的差异，可见椰汁的加
入对生长无明显促进或抑制作用。马铃薯汁的加入
有效增加了株高和增殖芽数，说明马铃薯汁能促进
茎和芽的生长，但对叶的增殖有抑制作用，可能是
马铃薯所含的活性物质影响了叶的增殖机制。活性
炭的加入（图 6-B）显著促进了丛生芽各项生长指标，
可能与吸附代谢废物改善生长环境有关。比较来看，
A B
图 6 不同天然添加物对丛生芽增殖的影响
3 讨论
培养基中生长素与细胞分裂素的浓度及配比对
铁皮石斛组织培养中芽的诱导与分化起着决定性的
作用，这在本实验中有着明显体现。由实验结果可
以看出，单一的 NAA 或 BA 在一定浓度内对不定芽
的诱导有明显促进作用，过高或过低可能起到抑制
作用。在 NAA 和 BA 交叉配比的实验结果分析，明
显优于单一激素作用，也证明了生长素与细胞分裂
素的协同调控作用在组织培养中的重要性。在正交
实验过程中发现，诱导率最高的激素配比组诱导出
的芽不一定是最为健壮的，诱导率低的处理组长出
的芽可能更为健壮，可能是因为同一外植体诱导出
的芽越多其吸收的营养物质得到分流越多，影响了
长势。要使芽诱导率既高且健壮，可能需研究芽诱
导的动力学过程，检测指标也不应是单一的诱导率。
另外，进行不定芽诱导的实验中所有处理组都直接
诱导出了不定芽，并未出现宋顺等［6］实验中诱导出
原球茎的现象，可能是原球茎的诱导需要更高浓度
的 BA。
控制细胞分裂素类和生长素类两者的浓度，
可以控制芽或根的分化，细胞分裂素 / 生长素的
比值大时有利于芽的形成，比值小时则有利于生
根［7］。本实验也证明了在基本培养基中添加低浓度
的 NAA、6-BA 能促进腋芽诱导和增殖，高浓度的
2016,32(3) 67欧阳凡等：铁皮石斛茎段快繁技术的研究
NAA、6-BA 不利于腋芽的萌发和分化，选取合适的
浓度和配比对组培苗的生长有关键性作用。另外与
前人研究出的激素配比［8，9］不同，可能与选用石斛
品种和外界环境控制有关。
天然添加物的加入往往是利用其丰富的营养物
质，使组培苗更易能适应于培养基环境，从而达到
快速繁殖的目的。本实验发现香蕉汁对丛生芽有显
著促生长作用，尤其是叶片增殖上。马铃薯汁对从
生芽增殖效果不明显，甚至还会抑制叶片生长。这
与蒋林等［10］的实验结论一致，香蕉泥对石斛芽的
增殖和生根壮苗效果突出而土豆泥主要用于壮苗。
活性炭的加入有效促进了组培苗生长不褐化，可能
与吸附了代谢产生的废物和减弱光照有关。
4 结论
以茎段为途径建立铁皮石斛快繁体系高效稳定
的获得组培苗是可行的。生长素与细胞分裂素的协
同调控作用在组织培养中很重要，得到的不定芽诱
导最适激素配比为 ：NAA 1.0 mg/L+BA 2.0 mg/L ；丛
生芽增殖最适培养基为 NAA 0.5 mg/L+BA 1.0 mg/L+
香蕉 100 g/L+ 活性炭 100 g/L ；香蕉汁和活性炭的加
入能有效促进组培苗生长。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）
表 5 不同天然添加物对丛生芽增殖的影响
实验组别 天然添加物种类 平均株高 /cm 平均增殖芽数 平均增殖叶数
1 空白 1.85±0.07d 2.44±0.08d 3.52±0.03b
2 香蕉汁 2.08±0.03b 2.76±0.05c 6.47±0.06a
3 椰子汁 1.94±0.07cd 2.52±0.09d 3.55±0.01b
4 马铃薯汁 2.03±0.05bc 3.16±0.11b 3.34±0.07c
5 活性炭 2.51±0.04a 3.47±0.72a 3.60±0.04b
注 ：采用 Duncan’s multiple range test 方法分析，同一列不同字母表示显著性差异（P<0.05，n=3）