全 文 ：2011 年 21(6) 生 物 技 术
垂丝海棠花色素苷合成基因 MhDFR的克隆
孙桂平1，杨帆1，李卫星2，展蔷3，程立宝2
(1. 扬州市城市绿化养护管理处，江苏 扬州 225007;
2. 扬州大学园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009;3. 扬州大学工程设计研究院，江苏 扬州 225009)
摘要:目的:利用同源克隆法从垂丝海棠(Malus halliana(Voss.)Koehne.)中克隆到花色素苷合成相关酶 DFR(二氢黄酮醇 －
4 －还原酶)基因，这为进一步研究基因表达和基因功能奠定基础。方法:采用 CTAB 法提取垂丝海棠叶片总 RNA，通过 RT －
PCR克隆得到 DFR基因。结果:得到一个长度为 1 181 bp的 DFR基因，该基因编码 394 个氨基酸残基，通过数据库进行比对分
析，表明实验得到的 DFR基因和其他植物中的 DFR基因在编码的氨基酸上具有很高的同源性，因此命名为MhDFR，另外MhDFR
与观赏海棠“王族”的McDFR在进化上亲缘关系最近近。结论:通过MhDFR的克隆，为进一步研究色素的合成及代谢奠定基础。
关键词:垂丝海棠;克隆;二氢黄酮醇 － 4 －还原酶;RT － PCR
中图分类号:Q785 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 06． 139
Cloning of MhDFR Gene Involved in the Anthocyanin Biosynthesis
in Malus Halliana (Voss. )Koehne.
SUN Gui － ping1，YANG Fan1，LI Wei － xing2，ZHAN Qiang3，CHENG Li － bao2
(1. Green Conservation Management Department of Yangzhou City，Yangzhou 225007，China;
2. College of Horticulture and Plant Protection，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China;
3. Design and Research Institute，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China)
Abstract:Objective:Cloning of MhDFR (Dihydroflavonol 4 － reductase)gene involved in the anthocyanin biosynthesis in Malus Halliana
(Voss.)Koehne. using homologous method，was the foundation for further gene expression and gene function study. Method:The total
RNA was extracted by CTAB method from the leaves of M. Halliana，and DFR gene was cloned by RT － PCR. Result:An 1181 bp gene
was obtained，which encoded 394 amino acid residues. This gene showed high homolog to DFR gene family in other plant species when
compared against NCBI database，and so it was named MhDFR. Phylogenetic tree of MhDFR demonstrates that MhDFR showed high rela-
tionship with McDFR in origin. Conclusion:Therefore，it is the foundation for study anthocyanin biosynthesis and metabolism on the base of
cloning of MhDFR in further.
Key words:Malus halliana (Voss.)Koehne.;clone;dihydroflavonol 4 － reductase;anthocyanin
收稿日期:2011 － 05 － 17;修回日期:2011 － 10 － 10
基金项目:江苏省自然科学基金资助项目(BK2008213) ;扬州大学高层
次人才科研启动基金(yd2010006)资助
作者简介:孙桂平(1967 －) ，男，江苏姜堰人，高级工程师，从事园林观
赏植物资源与配置等研究，Emall:415429956@ qq. com;联系作者:李卫
星(1970 －) ，男，江苏徐州人，副教授，从事植物资源开发与利用研究，
Email:liwx@ yzu. edu. cn。
0 引言
植物生长发育过程中，叶片、花和果实会产生不同的颜
色，其中花色素苷起到重要的作用。大量研究表明，花色素苷
是植物花朵、叶片和果实中红色、蓝色和紫色系色泽形成的物
质基础［1］。在花色素苷合成过程中，二氢黄酮醇 － 4 －还原酶
(DFR)的表达起到关键性作用，被认为是关键酶［2］，因此对叶
片、花瓣、果实颜色的形成非常关键。近年来利用基因工程技
术调控花色素苷形成取得显著的效果，蓝猪耳(Torenia fourni-
er)中过表达 DFR后，后代植株花色素苷含量在一定程度上明
显增加，表明 DFR的表达与蓝猪耳花冠色素合成相关。文樵
夫等从观赏海棠中克隆 DFR 基因，并采用实时荧光定量 PCR
技术检测不同叶色品种中 DFR表达量，结果表明 DFR在所有
观赏海棠叶片中均有表达，与叶色密切相关。据报道叶色越
红的品种，其花色苷含量越高，这已经在观赏海棠中得到验
证［3］。
垂丝海棠(Malus halliana)属于蔷薇科苹果属，是中国特
有的植物物种。其树形优美，花色丰富多彩，新叶紫红，成熟
叶片棕绿色，健康美观，所以是园林景观中不可缺少的观赏树
种资源。本文拟以垂丝海棠为试材，利用同源克隆技术，分离
一个与花色素苷合成相关的 DFR 基因，并利用生物信息学技
术对其进行分析，为该基因表达和功能研究奠定基础，为利用
遗传工程培育海棠新品种提供依据。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
植物材料垂丝海棠(Malus halliana(Voss. )Koehne. )由扬
州大学园艺与植物保护学院提供(5 月份室外采收，生长平均
温度为 24℃，平均湿度为 70%)。采集垂丝海棠叶片后，进行
液氮速冻，置于 － 80℃保存备用。
1. 1. 2 试剂
实验过程中所用到的克隆载体为 pMD18 － T，来源于
TaKaRa公司。感受态细胞为大肠杆菌 DH5α，购自 TaKaRa公
司。生化试剂有:反转录酶 (Tiangen，China) ，EcolI (TakaRa
公司)、RNase H 酶、Taq 聚合酶、dNTP (Tiangen，China)、DNA
分子量标准购自 TaKaRa公司，DNA胶回收试剂盒购自爱思进
公司，引物合成由上海生物工程技术有限公司完成。
1. 1. 3 仪器
PCR仪、摇床、冰箱、离心机、移液器、烘箱等。
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生 物 技 术 2011 年 21(6)
1. 1. 4 培养基
采用的培养基主要为 LB液体和 LB固体培养基。
1. 2 方法
1. 2. 1 RNA提取与 cDNA第一条链的合成
叶片总 RNA的提取采用 CTAB法［4］，在 RNA提取过程中
利用 DNaseⅠ处理防止 RNA污染。按照反转录酶使用方法进
行合成 cDNA 第一条链，20μL PCR 反应体系含有:模板总
RNA量为 1μg;dNTP(20mmol·L －1) :2μL;5 × RT buffer:5μL;
RNase抑制剂(10U·μL －1) :1μL;反转录酶:1U;上下游引物
各 2μL(表 1) ;利用 RNase － Free ddH2O 补足至 20μL。PCR
反应程序:37℃ 10min，42℃ 40min，99℃ 5min，4℃ 10min。合
成后的 cDNA于 － 20℃保存备用。
1. 2. 2 垂丝海棠 MhDFR序列的克隆
以上述得到的垂丝海棠叶片 cDNA为模板，利用同源克隆
方法进行基因克隆。首先找到其它物种的二氢黄酮醇 － 4 －
还原酶基因，通过同源性比对后，找到该基因的保守序列，然
后再根据保守序列设计引物 F 和 R(表 1)进行 PCR 扩增，反
应体系为 25μL:cDNA 1μL，上下游引物各 1μL，rTaq 酶
0. 125μL，dNTP 2 μL，MgCl2 1μL，ddH2O 16. 875μL;PCR 反应
体系为:94℃预变性 4min，40 个循环(94℃ 45s、62℃ 40s、72℃
2min) ，72℃延伸 10min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收
目标片段，纯化后与 pMD18 － T Vector 连接，转化 DH5α 感受
态细胞，蓝白斑筛选后测序，测序由上海英俊生物有限公司
(invitrogen)完成。
表 1 试验所用引物序列
Table 1 Primers of PCR reactions
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5＇－ 3＇)
备注
Note
R11466 GCAGGACTGCAGCTGACTGACTGACTA
cDNA 合成
Synthesization of cDNA
F AGAGCTCGCAGGACTGCAGCAGCTGACTGACTAC
DFR基因扩增
Amplification of DFR
R CACATCCTCAGCAGGAACTG
DFR基因扩增
Amplification of DFR
1. 2. 3 序列分析
利用生物学软件 BLASTn 和 BLASTp 将该基因序列及推
测的氨基酸序列进行序列同源性分析后，找到垂丝海棠二氢
黄酮醇 － 4 －还原酶基因的编码序列，同时对基因结构进行分
析。使用 Clustal X对序列进行多重比对后，利用 MEGA4 构建
垂丝海棠 MhDFR分子系统进化树［5］。
2 结果与分析
2. 1 垂丝海棠 MhDFR基因的克隆及序列分析
以垂丝海棠叶片为材料进行 RT － PCR 扩增，获得了一个
长度为 1 181 bp目标基因片段 (如图 1 所示) ，ORF(开放阅读
框)为 978 bp，编码 394 个氨基酸(图 2)。对测序结果进行
BLAST比对，结果显示该基因序列与观赏海棠“王族”(Gen-
bank 登录号:FJ817487［3］)DFR的同源性为 98%，因此命名为
MhDFR。序列分析表明，MhDFR 序列中从第 22 个碱基到第
84 个碱基编码的多肽为“VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY”，这
是 DFR与 NADP 的结合点，此结合位点在不同的物种中具有
高度保守性，因此 MhDFR属于 DFR 家族，为垂丝海棠花色素
苷合成途径中的关键酶。
图 1 MhDFR基因的克隆
M:DL2000 marker;1 ～ 2:MhDFR基因 PCR结果。
Fig． 1 Cloning of MhDFR gene
M:DL2000 marker;1 － 2:PCR result of MhDFR gene.
利用 DNAMAN 进行多重序列比对，结果如图 3 所示，
MhDFR与苹果(Malus domestica)、葡萄(Vitis vinifera)、西洋梨
(Pyrus communis)等不同树种的 DFR序列有较高的同源性，含
有该家族同源基因相似的中央编码区，具有典型的 DFR 蛋白
功能结构域，分属于短链的脱氢酶和还原酶(SDR)家族，这类
酶多数为 NAD －或者 NADP －依赖的还原酶。另外从序列比
对结果来看，来源不同树种中的 DFR 具有很高的同源性，一方
面说明 DFR 在基因进化过程中高度保守，另一方面也暗示
DFR 在花色素形成过程中起到重要的作用。
2. 2 MhDFR分子进化树分析
为了研究植物中 DFR 的分子进化，我们利用 MEGA4 软
件，对 MhDFR与观赏海棠“王族”、苹果、葡萄、西洋梨等植物
的 DFR 结构域蛋白进行进化树分析，从图 4 中可以看出
MhDFR编码的氨基酸序列与其他物种来源的 DFR 具有较高
相似性。特别是与观赏海棠“王族”的 McDFR相似性最高，为
98%，根据以上结果可以看出分子进化和植物进化具有高度
的一致性。因此我们初步推测垂丝海棠 MhDFR 与观赏海棠
“王族”的 McDFR功能相似，和叶片着色密切相关，能够影响
海棠叶片的颜色。
3 讨论
植物花色会随着代谢的进行而改变，而花色的改变一方
面由外界环境所致，另外也受到内部遗传物质的调控［6 － 9］。
通过花色的改变，植物一方面可以起到保护花器官的作用，另
外也可以帮助植株完成授粉，进而完整个生活周期［10，11］。
影响花色表现的因素很多，大体上可分为外部因素和内
部因素。其中外部因素包括光照、温度、植物激素及营养物质
等;内部因素主要是基因。光照对花色表现影响很大，光质和
光周期主要影响花器官中相关色素组分的生物合成，其中对
花色素苷的影响最为明显。温度和温周期主要影响植物生长
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图 2 MhDFR基因及编码区推测的氨基酸序列
* 阴影处是功能结构域;黑框表示保守域。
Fig. 2 Detial information of MhDFR sequence and deduced protein sequence
* The shaded part was gene functional domains，and the boxed part was gene conserved domains.
的生理状态，根据物种对温度喜好不同，适宜的温度及温周期
对花的发育及花的颜色形成极为有利［12］，并且将根据这些花
色将品种进行分类方法也非常成熟［13］。在内部因素方面，
PAL(苯丙氨酸解氨酶)、CHS(查耳酮合成酶)、CHI(查耳酮异
构酶)和 DFR(二氢黄酮醇 － 4 －还原酶)等是花色素形成的关
键酶，这些酶基因的表达对花色素成份的形成非常重要。研
究表明 DFR 属于脱氢酶类，这类酶的主要特点为至少含有 2
个结构域即辅酶结合位点和催化作用位点，第一个结构域通
常为辅酶的结合位点，第二个结构域为催化作用位点［14］。此
外还包括 NmrA区域，这个区域能够和其他作用因子结合，对
AreA功能的调控具有重要的作用，另外在差向酶和霍霍巴酰
基辅酶 A还原酶中也发现了相同的结构域，说明该结构与对
花色素苷的形成非常关键［15，16］，此结构域还显示了 DFR 进化
的保守性。在本实验所克隆的 MhDFR 中也发现了类似的结
构，所以推测 MhDFR 的功能可能和花色素物质合成相关，这
无疑对今后进一步研究垂丝海棠叶片和花朵中花色苷的形成
具有重要作用。
目前了解和阐明控制花色素合成的基因调控已成为园林
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生 物 技 术 2011 年 21(6)
图 3 不同植物 DFR的同源性性比对
* DFR保守的氨基酸残基为红色和绿色标注;而黑色标注部分为 DFR功能结构域。
GENBANK登录号:葡萄:VvDFR － AY780886. 1，山葡萄:VaDFR － FJ64576801，美国红树 RmDFR － GQ355943. 1，水蓼:PhDFR － AB070932. 1，草莓:
FaDFR － AY695812. 1，玫瑰:RhDFR － AB490072. 1，桃:PpDFR － AB095030. 1，山楂:CmDFR － AY786995. 1，观赏海棠“王族”:McDFR －
FJ817487. 1，苹果:MdDFR － AF117268. 1，西洋梨:PcDFR － AY227731。
Fig. 3 The comparison of MhDFR with Amino acid sequence in plant
* The shaded part with red or green colour represented dentical amino acid residues or conservation amino acid residues，and the shaded part with black colour
represented DFR functional domains
Accession No. in GeneBank:Vitis vinifera:VvDFR － AY780886. 1，Vitis amurensis:VaDFR － FJ6457680. 1，Rhizophora mangle:RmDFR － GQ355943. 1，Po-
lygonum hydropiper:PhDFR － AB070932. 1，Fragaria x ananassa:FaDFR － AY695812. 1，Rosa hybrid:RhDFR － AB490072. 1，Prunus persica:PpDFR －
AB095030. 1，Crataegus monogyna:CmDFR － AY786995. 1，Malus hybrid cultivar:McDFR － FJ817487. 1，Malus domestica:MdDFR － AF117268. 1，Pyrus
communis:PcDFR － AY227731. 1.
花卉植物基因工程和植物遗传育种研究的热点，花色素合成
调控基因的研究在花卉遗传改良、林木业、果蔬育种、食品工
业上显示出极大的应用价值［17］。在花色素苷合成过程中，
DFR的表达特点决定了它对植物尤其花卉植物器官色泽的形
成非常关键，目前国内外的研究主要集中在 DFR基因的克隆、
结构鉴定、表达及其相关功能分析等方面。本文利用同源克
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图 4 垂丝海棠 MhDFR与其他植物 DFR基因的分子进化树聚类分析
* GENBANK 登录号:葡萄:VvDFR － AY780886. 1，山葡萄:VaDFR －
FJ64576801，美 国 红 树:RmDFR － GQ355943. 1，水 蓼:PhDFR －
AB070932. 1，草 莓:FaDFR － AY695812. 1，玫 瑰:RhDFR －
AB490072. 1，桃:PpDFR － AB095030. 1，山楂:CmDFR － AY786995. 1，
观赏海棠“王族”:McDFR － FJ817487. 1，苹果:MdDFR － AF117268. 1，
西洋梨:PcDFR － AY227731. 1。
Fig. 4 A phylogenetic tree of MhDFR and other species DFR
* Accession No. in GeneBank:Vitis vinifera:VvDFR － AY780886. 1，Vitis
amurensis:VaDFR － FJ64576801，Rhizophora mangle:RmDFR －
GQ355943. 1，Polygonum hydropiper:PhDFR － AB070932. 1，Fragaria x
ananassa:FaDFR － AY695812. 1，Rosa hybrid:RhDFR － AB490072. 1，
Prunus persica:PpDFR － AB095030. 1，Crataegus monogyna:CmDFR －
AY786995. 1，Malus hybrid cultivar:McDFR － FJ817487. 1，Malus domesti-
ca:MdDFR － AF117268. 1，Pyrus communis:PcDFR － AY227731. 1.
隆技术，从垂丝海棠叶片中克隆到了 MhDFR 的基因片断，利
用生物信息学的方法对其编码的蛋白进行了分析，结果显示
MhDFR与不同植物的 DFR氨基酸序列有较高的同源性，具有
典型的 DFR 蛋白功能结构域。其碱基序列与观赏海棠“王
族”的 McDFR 同源性最高，为 98%，由此推测垂丝海棠
MhDFR基因具有典型的 DFR的生物学功能，和花瓣、叶片、果
皮等着色密切相关，能够影响垂丝海棠器官的色泽。MhDFR
基因的获得为今后继续研究 MhDFR的功能提供了基础。
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红曲霉丙酮酸脱羧酶基因克隆及酶学性质分析
朱碧云，高蓝，李浩明*
(广东药学院 生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)
摘要:目的:研究生物乙醇发酵关键酶丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase，PDC)的性质和功能。方法:从 SMART技术构建
的红曲霉(Monascus anka CICC 5031)cDNA文库中筛选 pdc基因，亚克隆到表达载体 pET － 21b(+) ，原核表达、亲和层析纯化重
组 PDC。分析重组 PDC和野生型 PDC的酶学性质。结果:pdc基因的开放阅读框长 1 713bp，编码一个 570 个氨基酸残基的蛋白
质。重组 PDC在 E. coli BL21(DE3)中的表达量为菌体总蛋白的 32. 7%。重组 PDC 与野生型 PDC 比活分别为 20. 2U /mg 和
30. 1U /mg。二者的最适反应条件均为 pH6. 0、30℃。重组 PDC 和野生型 PDC 的 Km 值分别为 2. 6mmol /L 和 0. 56mmol /L。结
论:红曲霉 pdc基因可在大肠杆菌中高效表达，重组 PDC稳定性较好，可用作生物乙醇生产的候选资源。
关键词:红曲霉;丙酮酸脱羧酶;酶学性质;生物乙醇
中图分类号:Q939. 97 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 06． 140
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