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翻白草黄酮对2型糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用及机制研究



全 文 :环球中医药 2016 年 2 月第 9 卷第 2 期 Global Traditional Chinese Medicine,February 2016,Vol. 9,No. 2 145
·论著·
作者单位:264199 烟台,山东中医药高等专科学校西医教学部[宿世震(硕士研究生)、孟繁伟],中药系(项
东宇、张钦德)
作者简介:宿世震(1979 - ) ,2015 级在读硕士研究生,讲师。研究方向:动物模型及解剖学研究。E-mail:
ssz169@ 126. com
翻白草黄酮对 2 型糖尿病大鼠胰岛细胞的
保护作用及机制研究
宿世震 项东宇 孟繁伟 张钦德
【摘要】 目的 研究翻白草黄酮对 2 型糖尿病大鼠胰岛细胞的保护作用及机制。方法 采用
高脂高糖饲料喂养大鼠 6 周后,腹腔注射链脲佐菌素复制 2 型糖尿病大鼠模型。成模大鼠随机分为
模型组、阳性药物对照组(罗格列酮,4 mg /kg)、翻白草黄酮低剂量组(3 g /kg)、翻白草黄酮高剂量组
(6 g /kg) ,同批次健康大鼠作为实验的正常对照组,每组 10 只。药物干预 4 周后,微量血糖仪检测
空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、放免法测定空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)并计算胰岛素敏
感性指数(insulin sensitivity index,ISI)、ELISA法测定肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)
及白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平;部分胰腺组织匀浆后黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化
酶(superoxide dismutase,SOD)水平、硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;取部
分胰腺制作病理切片,光镜下观察胰腺组织形态变化。结果 翻白草黄酮可降低大鼠的 FBG、
FINS、TNF-α、IL-6 水平及改善胰岛素抵抗,明显提高大鼠胰腺组织中的 SOD 水平、降低 MDA 含量。
病理切片显示胰岛细胞损伤明显减轻,翻白草黄酮高剂量组(6. 0 g /kg)作用明显。结论 翻白草黄
酮对 2 型糖尿病大鼠胰岛细胞具有保护作用,其保护作用可能是通过减轻胰腺组织内的氧化应激
水平及降低全身炎症反应而实现的。
【关键词】 翻白草; 黄酮; 2 型糖尿病; 大鼠; 保护作用
【中图分类号】 R285. 5 【文献标识码】 A doi:10. 3969 / j. issn. 1674-1749. 2016. 02. 005
Flavonoids from Potentilla discolor Bunge playing a protective and mechanical role for the type 2 di-
abetic rats islet cell XU Shi-zhen,XIANG Dong-yu,MENG Fan-wei,et al. Shandong college of tradi-
tional Chinese medicine,Yantai 264199,China
【Abstract】 Objective This article aims to study the protective mechanism of Flavonoids from Po-
tentilla Discolor Bunge (PDB)to the type 2 Diabetic rats islet cell. Methods Using high fat-high sucrose
diet to feed rats for 6 weeks,then the researchers copy the type 2 diabetic rats model with Streptozotocin
(STZ). Model rats are randomly divided into the model group,the positive drug control group (rosiglita-
zone hydrochloride,4 mg /kg) ,the low dose of flavone group (3 g /kg) ,and the high dose of flavone group
(6 g /kg). At the same time,healthy rats are used as the experimental rats of normal group with 10 rats in
each group. They are intervened by drug for 4 weeks. Then,trace blood sugar appearance tests fasting
blood-glucose,radio immunity measures fasting insulin (FINS)and calculates insulin sensitivity index
(ISI)and ELISA measures the level of tumor necrosis factor (TNF-α)and Interleukin-6(IL-6). Mean-
while,part of the pancreas tissue homogenate after xanthine oxidase method measures the level of SOD,
and TBA measures the content of malondialdehyde (MDA). Take part of the pancreas pathological slices,
and then observe the shape variation of the pancreas. Results Flavone from Potentilla Discolor Bunge
(PDB)can reduce FBG,FINS,TNF alpha,and IL-6 levels and can improve insulin resistance. In addi-
tion,it is clear that it improves the level of SOD in the pancreatic tissue of rats and decreases MDA con-
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tent. Pathological section shows an apparent reduction of the damage to islet cell,which is obvious in the
high dose of flavonoids (6 g /kg). Conclusion Flavonoids from Potentilla Discolor Bunge (PDB)plays a
protective role for type 2 Diabetic rats islet cell. In addition,the mechanism of its protective effect may
through reducing the oxidative stress level in the pancreatic tissue and reducing the systemic inflammatory
response.
【Key Words】 Potentilla discolor; Flavonoids; Type 2 diabetes; Rat; Protective effect
糖尿病是以慢性血糖升高为特征的代谢紊乱
性疾病,发病率逐年上升,目前认为,氧化应激、炎
症因子与糖尿病的关系密切,二者均可导致胰岛
β细胞损伤[1-2]。翻白草 Potentilla discolor Bung. 属
蔷薇科委陵菜属,又名鸡腿根、天青地白等,其味
甘、微苦,性平,无毒,全草及根入药,主要含有萜
类、黄酮类、多酚类等成分,具有抗菌、利尿、降糖、
调脂等作用[3]。研究显示,翻白草具有改善糖尿病
大鼠胰岛素抵抗的作用[4],而黄酮类是翻白草的主
要活性部位,故通过动物实验的方法,探讨翻白草
黄酮对大鼠胰岛细胞的保护作用及机制。
1 材料和方法
1. 1 动物
健康Wister大鼠,SPF级,雄性,由山东大学实验
动物中心提供,医学实验动物合格证号:SCXK(鲁)
20090001,体质量 195 ~ 206 g,饮水及摄食自由。
1. 2 实验药物
翻白草黄酮:翻白草,经山东中医药高等专科
学校鉴定教研室张钦德教授鉴定为中药翻白草 Po-
tentilla discolor Bung. 的全草,烘干粉碎,90%乙醇,
料液比 1∶ 8,提取 3 次,合并提取液,减压浓缩、萃
取,减压回收后真空干燥、粉碎过筛,冷藏备用。提
取物中黄酮含量为 70. 5%,1 g 提取物相当于生药
83 g,使用前,现配溶液浓度为 72 mg /mL(相当于生
药 6 g /mL)、复温至 25 ~ 30℃后进行灌胃治疗。罗
格列 酮 片 (成 都 恒 瑞 制 药 有 限 公 司,批 号:
201400319)。
1. 3 试剂与仪器
链脲佐菌素(streptozocin,STZ) (美国 Sigma 公
司,批号:S0130)。血清胰岛素(fasting insulin,
FINS) ,批号:20140326;白细胞介素-6(interleukins,
IL-6) ,批号:20140314;肿瘤坏死因子-α(tumor nec-
rosis factor,TNF-α) ,批号:20140306;超氧化物歧化
酶(superoxide dismutase,SOD) ,批号 20140319;考马
斯亮兰蛋白,批号:20140318;丙二醛(malondialde-
hyde,MDA)试剂盒,批号:20140318;以上试剂盒均
购于南京建成生物工程研究所。
微量血糖仪及配套试纸(德国罗氏诊断公司) ;
680酶标仪(美国 Bio-rad 公司) ;SN-695 B 型智能放
免 r 测量仪(上海原子核研究所日环仪器一厂) ;
CX21BIM-SET6光学显微镜(日本奥林巴斯有限公
司)。
1. 4 模型制备、分组及给药
60 只大鼠,适应性喂养 1 周后,按体质量分层
随机数字表法取 10 只作为正常对照组,普通饲料喂
养;余 50 只高脂高糖饲料(饲料配方:猪油 18%、蔗
糖 20%、蛋黄 3%、基础饲料 59%)喂养,4 周后,禁
食 12 小时,1% STZ 按 40 mg /kg 腹腔注射,1 周后
测糖负荷 2 小时血糖值,≥11. 1 mmol /L 为初选指
标,稳定 1 周后分组[5],最终成模 42 只。成模大鼠
随机数字表法分为四组,每组 10 只,即模型组、阳性
药物对照组(罗格列酮,4 mg /kg)、翻白草黄酮低、
高剂量组(以生药计,6 g /kg,12 g /kg)。正常对照
组及模型组每次等体积的蒸馏水。灌胃给药,每天
1 次,连续 28 天。
1. 5 指标检测
实验结束后(禁食 8 小时) ,剪尾取血,微量血
糖仪检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)。
3%戊巴比妥麻醉后,腹主动脉取血,分离血清,
- 20℃保存待测。放射免疫法测定空腹胰岛素
(fasting insulin,FINS) ,酶联免疫法测定血清TNF-α、
IL-6。计算胰岛素敏感性指数(insulin sensitivity in-
dex,ISI) ,ISI = 1 /FBG × FINS。取血后立即取胰腺
组织,部分用冷生理盐水漂洗,拭干称重、放入盛有
预冷匀浆介质的烧杯中,剪碎组织,倒入匀浆器中
研磨成组织匀浆,30000 rmp离心 10 分钟,吸取上清
液待测,黄嘌呤氧化酶法测定 SOD 水平、硫代巴比
妥酸法测定 MDA 水平。部分胰腺组织常规固定、
包埋制备石蜡切片后 HE染色。
1. 6 统计学处理
应用 SPSS 15. 0 进行统计学处理及分析,各组
数据以均数 ±标准差(x ± s)表示,采用方差分析,两两
比较采用 SNK-q法,ISI呈非正态分布,故分析时
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表 1 翻白草黄酮对糖尿病大鼠 FBG、FINS、ISI 的影响(x ± s,n = 10)
组别 剂量(g /kg) FBG(mmol /L) FINS(μIU /mL) ISI
正常对照组 - 4. 87 ± 0. 59 63. 17 ± 5. 27 - 5. 72 ± 0. 04
模型组 - 16. 71 ± 1. 99a 90. 50 ± 5. 11a - 7. 31 ± 0. 08a
罗格列酮组 0. 004 10. 40 ± 1. 54b 66. 13 ± 4. 10b - 6. 52 ± 0. 11b
翻白草黄酮低剂量组 3 13. 60 ± 1. 45b 78. 72 ± 3. 78b - 6. 98 ± 0. 12bc
翻白草黄酮高剂量组 6 11. 89 ± 1. 30b 71. 17 ± 5. 71b - 6. 71 ± 0. 05bc
注:与正常对照组比较,aP < 0. 01;与模型组比较,bP < 0. 01;与罗格列酮组比较,cP < 0. 01。
计算其自然对数,P < 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 翻白草黄酮对糖尿病大鼠一般状态的影响
实验过程中,正常对照组大鼠活泼、毛发整齐
光滑、反应灵敏;造模大鼠在高脂高糖饲料喂养结
束时形体肥胖、体质量增加明显,注射 STZ 后逐渐
呈现精神萎靡、懒动、多食、多尿,垫料潮湿臊臭,每
日需更换垫料 2 次,同时模型大鼠体质量较造模前
降低明显。给予药物干预 4 周后,与模型组比较,翻
白草黄酮低、高剂量组大鼠的状态明显好转,进食
量、饮水量改善,体质量有所增加,毛发较整齐、光
滑,且活动增加。
2. 2 翻白草黄酮对糖尿病大鼠 FBG、FINS、ISI 的
影响
模型组大鼠的 FBG、FINS 水平升高、ISI 降低,与
正常对照组比较差异显著(P < 0. 01) ,符合 2 型糖尿
病的特点,提示模型复制成功。干预 28 天后,翻白草
黄酮低、高剂量组的 FBG、FINS 水平下降,ISI 升高,
与模型组比较差异具有统计学意义(P < 0. 01) ,呈剂
量依懒性,但作用不及罗格列酮,见表 1。
2. 3 翻白草黄酮对糖尿病大鼠胰腺组织中 SOD、
MDA的影响
模型组大鼠胰腺组织中 SOD 水平下降、MDA
含量升高,与正常对照组比较,差异具有统计学意
义(P < 0. 01)。干预 28 天后,翻白草黄酮低、高剂
量组胰腺组织中的 SOD 水平升高、MDA 水平下降,
与模型组比较,差异具有统计学意义(P < 0. 01) ,作
用优于罗格列酮组(P < 0. 01) ,翻白草黄酮高剂量
组作用明显,见表 2。
2. 4 翻白草黄酮对糖尿病大鼠血清炎症因子的
影响
模型组大鼠 TNF-α、IL-6 水平呈现升高,与正常
对照组比较,差异具有统计学意义(P < 0. 01) ;干预
28 天后,翻白草低、高剂量组大鼠的 TNF-α、IL-6 水
平均不同程度降低,与模型组比较,差异具有统计
学意义(P < 0. 01)。高剂量组作用明显,见表 3。
表 2 翻白草黄酮对糖尿病大鼠胰腺组织中 SOD、
MDA的影响(x ± s,n = 10)
组别
剂量
(g /kg)
SOD
(U /mgprot)
MDA
(U /mgprot)
正常对照组 - 25. 97 ± 2. 14 1. 37 ± 0. 11
模型组 - 6. 62 ± 1. 07a 4. 94 ± 0. 19a
罗格列酮组 0. 004 10. 28 ± 1. 16b 4. 67 ± 0. 32c
翻白草黄酮低剂量组 3 16. 33 ± 1. 18bd 2. 36 ± 0. 30bd
翻白草黄酮高剂量组 6 20. 12 ± 1. 40bd 2. 02 ± 0. 23bd
注:与正常对照组比较,a P < 0. 01;与模型组比较,b P < 0. 01,
cP < 0. 05;与罗格列酮组比较,dP < 0. 01。
表 3 翻白草黄酮对糖尿病大鼠血清
炎症因子的影响(x ± s,n = 10)
组别
剂量
(g /kg)
TNF-α
(pg /L)
IL-6
(pg /L)
正常对照组 - 0. 76 ± 0. 10 89. 80 ± 2. 89
模型组 - 1. 86 ± 0. 13a 130. 56 ± 2. 76a
罗格列酮组 0. 004 1. 71 ± 0. 11c 124. 06 ± 3. 50b
翻白草黄酮低剂量组 3 1. 50 ± 0. 11bd 115. 37 ± 3. 81bd
翻白草黄酮高剂量组 6 1. 27 ± 0. 14bd 106. 46 ± 2. 63bd
注:与正常对照组比较,a P < 0. 01;与模型组比较,b P < 0. 01,
cP < 0. 05;与罗格列酮组比较,dP < 0. 01。
2. 5 翻白草黄酮对糖尿病大鼠胰腺形态的影响
每张切片观察 5 个视野(× 200) ,计算细胞总
数后取各张平均值进行比较。正常对照组大鼠胰
岛β细胞数较多,细胞核清楚,细胞界限清晰。模型
组大鼠胰岛体积缩小,β 细胞数减少。与模型组比
较,罗格列酮组及翻白草黄酮给药组胰岛体积增
加,β细胞数增多。表明翻白草黄酮对糖尿病大鼠
的胰岛具有保护作用,见图 1。
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图 1 翻白草黄酮对糖尿病大鼠胰腺形态的影响
(HE染色,× 200)
3 讨论
高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素腹腔注射
是近年来复制 2 型糖尿病大鼠模型较为常用的方
法,本实验中也采用了此方法,模型组大鼠出现了
多尿、多饮、体重下降等表现,同时 FBG、FINS 升高
及 ISI下降,提示大鼠出现高糖、胰岛素抵抗表现,
符合 2 型糖尿病模型特征。翻白草黄酮治疗后,
FBG 及 FINS 水平下降、ISI 提高,与文献报道一
致[4],翻白草具有改善 2 型糖尿病大鼠糖代谢紊乱
及胰岛素抵抗的作用。同时在实验中观察到,翻白
草黄酮可缓解糖尿病模型大鼠的“三多一少”症状
及精神状态。
“共同土壤”[6]学说的提出,让人们注意到了氧
化应激在糖尿病发生、发展中的作用。正常情况
下,体内在代谢过程中生成的活性氧簇(reactive ox-
ygen species,ROS)或活性氮簇,可被机体的抗氧化
系统及时清除,若产生过多,超过机体清除能力,可
导致组织、细胞的损伤,即为氧化应激。胰岛 β 细
胞内的抗氧化酶水平较低,对氧化应激敏感,所以
更容易受到 ROS的攻击而受损[7]。目前认为,氧化
应激可激活 c-Jun 氨基酸末端激酶,继而激活蛋白
转录因子的磷酸化,直接调控 β 细胞中凋亡相关基
因的表达而促进 β 细胞凋亡;增多的活性氧还可促
使生物膜脂质过氧化,致使细胞膜通透性增加,钙
内流增加,继而激活磷脂酶,促进膜磷脂分解,导致
β细胞损伤。而抗氧化剂可抑制 β 细胞凋亡[8],进
一步说明了氧化应激参与 β 细胞的损伤过程。在
评价氧化应激时多采用 SOD、MDA 的含量测定,
SOD是机体主要的抗氧化酶,可以清除自由基而减
轻氧化应激损伤,其水平可以反映机体的抗氧化能
力;MDA是生物膜脂质过氧化的产物,其水平可以
反映体内的脂质过氧化程度。本研究结果显示,模
型组大鼠胰腺组织中的 SOD 水平降低、MDA 水平
升高,镜下观察胰岛萎缩、体积缩小、β 细胞减少,说
明糖尿病大鼠胰腺组织中存在氧化应激状态,其自
由基清除能力降低,抗氧化能力降低,β 细胞损伤。
翻白草黄酮治疗后,与模型组大鼠比较,胰腺组织
中的 SOD 水平升高、MDA 水平降低,镜下观察胰岛
体积增加、β细胞数增加,表明翻白草黄酮对胰岛 β
细胞具有修复作用,其机制可能与降低糖尿病大鼠
胰腺组织内的脂质过氧化、提高其抗氧化能力有关。
近年来提出,2 型糖尿病是一种自然免疫和低
度炎症性疾病,炎症因子与糖尿病及其并发症的关
系密切,体内的糖代谢紊乱可以刺激炎症因子(如
IL-6、TNF-α等)大量的生成,胰岛 β 细胞同样出现
炎症反应,继而功能障碍和凋亡[2,9]。IL-6 主要由
白细胞合成分泌,可加速胰岛素受体底物的降解,
抑制酪氨酸自身磷酸化及磷脂酸肌醇-3-激酶活性,
促进胰岛 β细胞的凋亡;高浓度的 IL-6 还可以诱导
胰腺 β细胞胞浆内不透明物质产生、自体吞噬的出
现和线粒体的变形等细胞超微机构的变化,这些变
化共同引起胰岛 β 细胞死亡[10]。TNF-α 主要由激
活的巨噬细胞释放,可以刺激 β 细胞内诱导型一氧
化氮合酶在胰岛细胞内的表达增加,促进 NO 的合
成,从而影响 β细胞的生长和增殖[11],NO又能激活
巨噬细胞释放促炎症因子,可激活核转录因子-кB,
通过 Fas途径引起 β细胞凋亡[12]。因此,炎症状态
可导致胰岛 β 细胞损伤,促进糖尿病的发生、发展。
本实验研究中,糖尿病模型组大鼠的 TNF-α、IL-6 水
平显著高于正常对照组,证实了 2 型糖尿病大鼠体
内存在炎症因子的过度表达。翻白草黄酮治疗后,
糖尿病大鼠的 TNF-α、IL-6 水平降低,表明翻白草黄
酮可降低糖尿病大鼠体内的炎症水平,从而保护胰
岛 β细胞。
(下转本期 216 页)
216 环球中医药 2016 年 2 月第 9 卷第 2 期 Global Traditional Chinese Medicine,February 2016,Vol. 9,No. 2
上制定。多数临床医家得到共识:肝络的功能与肝脏的生理
特点密不可分,肝络病的病变具有肝脏的病理特点。无论是
毒损、痰凝或正气亏虚,肝络病的病机特点最终都表现为气
血的异常。故治疗时当重视气血之间的关系,考虑脏腑间的
联系,在调整气血的基础上,或养阴活血柔肝,或利湿清肝,
或熄风镇肝,理气与活血并用,通补兼施[12]。
故肝络病的病变并非只在血络,而是气络病变与血络病
变并重。“气”与“血”的调控,气络与血络的相互作用是肝
络病不同于广泛络病的独特特点。
4 结语
肝络病是络病学说的重要内容。明确肝络病的内涵及
外延对于全面的认识疾病,理解肝络病的过程具有重要意
义。肝络的病变贯穿肝络病的始终,应用治络法是治疗肝络
病的基本法则。
目前,肝络病的体系并不完善,对肝络病的研究亦不深
入,在今后的研究中应予以重视。在基础研究中,应更注重
肝络病理论的探讨与补充,重视在传统理论基础上的创新;
在临床研究中,应更注重病机研究与治法归类,在此基础上,
灵活变通,在肝络病的不同病变阶段选择不同的通络法的同
时兼顾气血关系,把握气血与血络的相互作用,理论与临床
相结合,则对于肝络病的研究“思过半矣”。
参 考 文 献
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(收稿日期:2015-09-14)
(本文编辑:韩虹娟)
(上接本期 148 页)
综上所述,翻白草黄酮具有保护 β细胞作用,促
进 β细胞修复,其保护作用可能是通过减轻胰腺组
织内的氧化应激水平及降低全身炎症反应而实现
的。今后将继续深入研究,明确翻白草黄酮促进 β
细胞修复的具体分子学机制。
参 考 文 献
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(收稿日期:2015-08-12)
(本文编辑:董历华)