全 文 ：芜青花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的
建立及对 7个株系抗原决定簇的分析 *
刘栩平 路文长 刘元凯
(黑龙江省农业科学院园艺研究所 , 哈尔滨 1 5 0 0 6 , )
宋淑敏 张成 良 王 翠 花
(农业部植物检疫实验所 , 北京 1。 。。 2 6 ) (山东省农业科学院蔬菜研究所 , 济南 2 , 0 10。 )
关徽词 T u M V 株系 、单克隆抗体 、 抗原决定簇 、 株系起源
从 50 年代起 , 国内外对芜青花叶病毒 ( T u M v ) 的株系分化进行过许多研究 ,但大多是就
局 部地区的分离物进行鉴定 , 且是依据以鉴别寄主为主的生物学方法而确定株系的 lt 一 3] . 李彦
勇 曾用 E L sI A 方法对来自不 同国家和地区的 T u M v 分离物 (包括中国的 2 个 ) 的血清学关
系做了比较 t’1 . 国家蔬菜抗病育种攻关协作组在国内十个省市的+ 字花科蔬菜上采病样 7 9 8 2
份 ,经常规系统鉴定确定为 T u M v 的有 , 7 3 9份 , 并从中筛选出主流分离物 19 个 . 作者研究
了国内外前人划分 T u M V 株系的方法不 易区分这些分离物 〔` ,’l ,故从 94 个蔬菜品种中新筛选
出 6 种十字花科蔬菜鉴别寄主 ; 把 19 个主流分离物鉴定划分出 7个株 系群 7[J (以 下 简 称 株
系 ) . 为了验证其准确性和提高识别株系的水平 , 首先对 7 个株系的血清学关系做了比较研
究 , 发现它们既有同源性 ,又存在着明显差异 (另报道 ) . 但是多克隆抗血清含有与多种抗原决
定簇相对应的抗体 ,表达特异性不强 , 因而开展了此项研究 . 并对 T u M V 7 个株系的抗原决
定簇进行了分析 ,为 T u M v 株系划分提 洪分子生物学依据 .
一 、 材 料 和 方法
1
. 抗原 T u M v 7 个株系阅 的代表分离物是 : T u l (普通株系 )的秦 1 、 T u Z (小白菜
株系 )的沪 1 、 T u 3 (海洋白株系 ) 的辽 1 、 T u 4 (大陆白株系 ) 的黑 1 、 T u s (甘蓝株系 ) 的渝
6
、
T u 6 (花椰菜株系 ) 的黑 3 和 T u 7 (芜青株系 ) 的京 2 等分离物 . 在隔离条件下分别接种
于感病的结球白菜品种二牛心上 ;系统显症后 ,分别采收病叶 , 经 P E G 沉淀 、 差速离心获得纯
化的病毒制剂 , 作为免疫动物和检测用抗原 . 交叉反应用的抗原有农业部植物检疫实验所提
供的线状马铃 薯 Y 病毒 ( P V Y ) 、 杆状烟草花叶病毒 ( T M v ) 、 首信花叶病毒 ( A M v ) 、 球状
黄瓜花叶病毒 ( CM v ) 、 烟草脆裂病毒 ( T R v ) 和南方菜豆花叶病毒 ( s B M v ) 等 6 种 .
2
. 多克隆抗血清及鼠腹水抗体 将 7个株系的代表分离物病毒纯化制 剂 分 别 免 疫 家
兔 , 得到 7 个株系的多克隆抗体 ; E IL S A 间接法侧定其滴度分别为 10 一 5 、 10 一 , 、 10一 ` 、 10一 “ 、
本文 19 9 1 年 斗月 l 日收到 .
. 在本试验中 , 得到黑龙江省农业科学院副院长张增敏副研究 员 , 农业部植物检座实验所胡伟贞 、 张作芳副研究员 , 陈
京 、 赵瑞生 、 田雪娟 、 相宁 、徐亮等同志及黑龙江省农业科学院园艺研究所林宝祥 、 鲁瑞芳等同志的大力帮助 , 谨此致
谢 .
1 4 1嘴 科 学 通 报 1 9 9 t 年
1 。一 , 、 l 。一` 和 1 0一 ` . 用提纯的 7 个代表分离物的混合抗原免疫普通小白鼠 , 再注人 5 180 小鼠
腹水癌细胞 , 获多克隆鼠腹水抗体 , 滴度为 1 0一气
.3 免痊小砚 用提纯的 7 个代表分离物等量混合做抗原 , 免疫 6 周龄 B A L B / c 小鼠 ,第
一次注射尾静脉以后每周做腹腔注射一次 ,共 7 次 ;融合前 3天 ,加强免疫一次 .
4
. 鼠骨脸瘤细胞的培养 培养液为含 l m ol / L H eP e ; (声 7 .3 ) 的 R P M l l 6 4。 液 , 添
加小牛血清 2 0肠 、谷氨酸酸 ( 2 0 0 m m o l /m l ) l 多、 青链霉素 (各 10 0 0 0 单位 / rn 蓝) I多 、 碳酸氢
钠液 ( 7 . 5呱 ) 3铸 . 接种小鼠骨髓瘤细胞系 s P Z / 0一 A g 14 ; 在 37 ℃ 、 5书二氧化碳箱中培养 .
5
. 细胞融合 参照 K 6h l e rt 幻 和陈伯权 l9] 方法 ,取免疫小鼠脾细胞以 3 : 1的比例与骨髓
瘤细胞融合 . 用间接酶联法 ( E LI S A )筛选分泌 T u M V 抗体的杂交瘤 ; 以有限稀释法克隆 , 扩
大培养 ,收集培养上清液单克隆抗体 ; 并将其细胞注射 B A L B / C 白鼠 , 诱发生产单克隆抗体
腹水。
6
. 单克隆抗体 ( M c A b ) 坛 类及亚类的鉴定 用上海生物化学研究所生产的标准兔
抗鼠 Ig G 、 、 I g G : b 、 19岛 和 Ig M , 分别稀释 1 0 0 倍 , 包被酶联板 ,与 M e A b 做 E L I s A 测定 .
.7 杂交瘤细胞的染色体计数 按照陈京 l[ 0J 的方法制片 ,姬姆萨染色 ,镜检计数 .
二 、 结 果
1
. 杂交瘤细胞的筛选及克隆化 细胞融合共接种 2 4 个培养孔 , 3 天后出现融 合细胞 ,
最终有 2 14 孔出现融合细胞 , 融合率为 9 , . 5书 . E IL S A 检测有 72 个孔的融合细胞分泌出抗
T u M V 的抗体 ,阳性率为 3 . 6务 . 从中选择 , 个孔的能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞进行克隆 ,
筛选出各能分泌特异 M c A b 的杂交瘤细胞 16 株 . 经连续传代 2 个月以上 ,继续分泌抗体 . 间
接 ELI S A 法测得组织培养上清液 M c A b 的滴度为 l 。一 2一 1『 ` ,小鼠腹水滴度为 1 0一 `一 1 0一
孟 单克隆抗体的 坛 类及亚类鉴定 16 个 M c A b 杂交瘤细胞株 , 分别用 R P M I 16 4。
液 (不含牛血清 )培养三夭 , 用 E IL S A 侧定表明 (表 1 ) , 有 9 株 M c A b 为 I g G : 亚类 , 5 株为
I g zG b 亚类 , 2 株为 Ig M 类 .
表 1 16 株单克隆抗体的 磅 类型
单 克 隆 抗 体 (株 )
19 类 SP Z j oC K -
一 1一一 ~~ , , . . . . . 睁
. 十 ” 为阳性反应 , ` 一 ” 为阴性反应 , 以下类同 .
3
. 杂交痛细胞染色体计数 经测定 s P Z / 0 骨髓瘤细胞的 染 色 体 为 68 一 79 条 , 平 均
7 3 条 ;小鼠脾细胞的染色体为 40 条左右 ;分泌 M c A b 的杂交瘤细胞的染色体 8 一 1时 条 , 平
均 94 条 , 证明了后者为杂交瘤细胞 .
4
.
T u M V 单克隆抗体对其他植物病毒的交叉反应 用 6 种不同于 T u M V 的植物病
毒与 16 株 M c A b 做交叉反应 , 以 T u l 抗原做阳性对照 , 健康的普通烟粗计液和超离心的健
康大白菜液分别做阴性对照 . 结果 16 株 M c A b 只与 T u l 抗原呈阳性反应 , 不与同属于线
状病毒的 P V Y 、 属杆状病毒的 T M v 和 A M v 、 球状病毒的 C M V 、 T R V 、 S BM V 产生反应 。
第 18 期 科 学 通 报 1 4巧
5
.
T uMV 7 个株系的抗原决定簇分析 以 T uMv 7 个株系的代表分离物的提纯病毒
做抗原 ,均以 20 环 g Zm l 的浓度分别包被 E IL s A 板 , 与分别系列稀释的 16 株 M c A b 进行试
验 ,选择 M c A b 的适宜工作浓度 . 再以 16 株 M o A b 的适宜工作浓度分别与系列稀释的 7个
株系的抗原做 E LI S A 实验 . 结果表明 : 16 株 M c A b 在 T u M V 7个株系的代表分离物中识
别出 6个不同的抗原决定簇 (表 2) . T u l 只具抗原决定簇 A , T u 4 具抗原决定簇 A和 B,
T u 3具抗原决定簇 A、 B 和 C , T u Z 具抗原决定簇 A 、 B 和 D , T u 7 具抗原决定簇 A 、
B 、 C
、
D 和 E , T u s 具抗原决定簇 A 、 B 、 C 、 D 、 E 、 F .
表 2 T u M v 各株系抗原决定簇分析
,、 灸、 T u l T u 礴 T u 3 T u Z T u 7 T U S T u 6 健康白蕊城 菜对照秦 1 黑 1 辽 1 沪 l 京 2 渝 6 黑 3对 S P Z / 0 军 草 十 十 + 二 +照 多克隆抗休
单 l 、 十 十 + 十 + +
克 l 0 十 十 十 十 十
隆 l 2 十 十 十 十 十
抗 13 十 + 十 十 十
体 1 4 十 十 + 十 十
1 5 + 十 十 + +
9 十 + + + 十
4 十 十 + 十
5 + 十 十
l 十 十
2 十 十
3 + 十
6 + +
7 十 +
8 十 +
1 6 十
抗原决定簇 } A {一 { C D } E } F / l
三 、 讨 论
( l) 本试验获得的能稳定分泌 M c A b 的 16 株 T u M V 杂交瘤细胞株分泌的 M c A b 不
与 T u 6 中的黑 3 分离物发生反应 , 表明 T u6 与其他株系的血缘关系较远 , 较其他分离物具
有特殊的性质 , 若 M c A b 株数增多可能揭露出其独有之特性 , 有待进一步研究 .
( 2 ) 从对 T u M v 各株系的抗原决定簇分析结果与新筛鉴别寄主图相结合分析 ,可以看出
对多种寄主致病力强的株系的抗原决定簇也多 , 如 T u , 对甘蓝 、海洋性白菜 、 大陆性白菜和
花椰菜等 4种寄主的致病力强 , 它的抗原决定簇也最多 , 有 A 、 B 、 C 、 D 、 E 、 F 等 6个 . T u 7 对
3 种寄主致病力强 , 则比前者少了一个抗原决定簇 F . 对少数寄主致病力强的 T u Z 、 T u 3株
系的抗原决定簇也较少 , 只有 A 、 B 、 C 或 A 、 B 、 D 三个决定簇 . 对个别寄主致病力较强的
r u l 和 T u 4 株系 , 只有坑原决定簇 A 或 A 和 B . 上述结果看出病毒对寄主的强致病力范围与
1 4 1 6 科 学 通 报 1 9 9 1 乍
其抗原决定簇的多少成正相关 ,可以明确划分出 T u M v 的 6 个株系 , 并与新筛鉴别寄主鉴定
结果基本相符合 . 这表明用 M c A b 来划分 T u M v 株系是可能的 , 除提供分子水平的特征信
息外 , 还具有快速准确的优点 , 也说明了新筛鉴别寄主 m 是科学的 . 此为查明我国 T u M v 的
生态区系提供了可能 , 也是开拓生态农业研究的基础 。
( 3 ) 作者曾在寄主范围鉴定中发现 , T u M v 各个株系能侵染十字花科的各属 、 各种 蔬
菜 , 除 T u l 以外各株系都对特定寄主有特强的致病力 . T u l 只对海洋性白菜有较强的致病
力 , 而且也远不及其他株系 , 对大陆性大 白菜 、小白菜 、芜青 、甘蓝 、花椰菜等十字花科蔬菜的致
病力都很弱 ,特性不明显 ;依据对其采集地的原生态区系特征分析 , 初步认为它可能是 T u M v
中的一个原始株系 . 本实验表明 T lu 只具抗原决定簇 A , 则为原推论提供了实质性证据 . 这
个论点也符合其采集地的原生态区系特征 . T ul 采自陕西关中平原 . 大约在 5 0 0 0 年前 ,那里
是典型亚热带气候 l1[J ,有接近于当今所谓的海洋性气候的特点 , 是我国文明的发源地 ,是我国
栽培白菜最早的地区 , 自然应该有较为原始的 T u M v 类型 . 从各株系的致病力特性研究中还
发现 ,海洋性大白菜是十字花科蔬菜中对 T u M V 的抗性最低的种类 ,除 T u l 以外 ,其他 6 个
株系都对它有很强的致病力 ,可视为通性 . 除此以外 , 其他 6 个株系都各对特定的蔬菜种类有
很强的致病力 m . 以此再与其抗原决定簇相结合分析 ,似可探讨其他株系的起源 . T u 4 只有对
大陆性大白菜致病力强的特点 , 本实验证明它只具抗原决定簇 人和 B ; B 簇是其独有特性的标
志 , 人簇恰是它从 T u l 中分化出来的血缘标志 . 这又与关中平原的气候由亚热带气候逐渐
演变成今天的典型的大陆性气候和栽培着典型的大陆性大白菜相吻合 .
T u Z 具有抗原决定簇 A 、 B 和 C , C 簇是其独有特性的标志 , 因此它似乎是从 T u 4 中分
化出来的 ,但它只对小白菜有很强的致病力 , 所以它应是从仅具抗原决定簇 A 的 T u l 中分化
出来的 , 而不是从具有抗原决定簇 A 和 B 的 T u 4 中分化出来的 . 至于它所具抗原决定簇 B ,
可能与 T u M v 的共性和二者的寄主血缘相近有关网 .
按照同样的理由分析 T u 3 起源于 T u ;1 T u 7 起源于 T u Z ; T u , 有两种起源 , 其一是
它所含的渝 6 分离物起源于 T u l , 其二是所含的冀 1分离物起源于 T u .4
从以上分析看 , 了解株系的抗原决定簇的同时 , 还必须了解其寄主范围和致病力特性 , 才
能确切判断株系间的血缘关系 . 否则会受寄主间的血缘关系而干扰 . 只有用这两种方法分析
的结果互相佐证 ,才能较客观地说明株系间的血缘关系 .
( 4 )按以上方式进行反复研究 , 亦可以通过分析某种植物病毒的抗原决定簇及其致病力特
性来推论该植物的起源和当地的古代气候特点 . 这也许将是一个很有意义的开拓 .
今 考 文 献
[ 1 ]
[ Z J
[ 3 ]
[呼1
[ 5 1
[ 6 ]
[ 7 J
【8 1
[ 9 ]
〔1 0 ]
[1 1 ]
[ 12 ]
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