全 文 ：北方园艺２０１５（２０）：９５～９８ ·生物技术·
第一作者简介：孟凡娟（１９７５－），女，黑龙江兰西人，博士，副教授，
现主要从事植物资源等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｆｊ１９７５１＠１６３．ｃｏｍ．
责任作者：李荣钦（１９６８－），女，四川成都人，硕士，副教授，现主要
从事植物资源等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｆｊ１９７５１＠１２６．ｃｏｍ．
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１１６０３８６）。
收稿日期：２０１５－０７－２２
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１５２００２３
光核桃ＩＳＳＲ扩增体系的优化
孟 凡 娟１，邢 春１，徐 福 玲１，王 中 奎２，李 荣 钦２
（１．东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨１５００４０；２．西藏大学 农牧学院，西藏 林芝８６００００）
摘 要：为确保光核桃ＩＳＳＲ反应条件的稳定性，以改良的ＣＴＡＢ法提取光核桃基因组
ＤＮＡ，对模板ＤＮＡ浓度、ＭｇＣｌ２浓度、ｄＮＴＰｓ浓度、Ｔａｑ酶用量、引物浓度等因素进行了优化，确
立了光核桃ＩＳＳＲ反应体系。结果表明：最佳反应体系为模板浓度４０ｎｇ／μＬ、引物浓度
０．４μｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ
２＋的浓度２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、酶浓度０．５Ｕ、ｄＮＴＰｓ浓度０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，为光核桃这一优
质的种质资源的遗传多样性研究奠定了理论基础。
关键词：光核桃；ＩＳＳＲ；体系优化
中图分类号：Ｓ ６６４．１０３．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１５）２０－００９５－０４
ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ）技术是１９９４年
ＺＩＥＴＫＥＩＷＩＴＣＺ等人继ＳＳＲ技术开发以后发展起来的
一种显性分子标记方法，是在ＳＳＲ序列的３′或５′末端加
上２－４个核苷酸（通常是随机选择且是简并的），对ＳＳＲ
之间的序列（非ＳＳＲ本身）进行扩增［１－３］。与ＳＳＲ分子标
记技术相比，它不需要预先获知基因组序列，可以在不
同物种间通用，是一种非特异性的标记方法，同时它操
作简单方便、多态性丰富、费用低［４］。特别适用于大批
量的材料研究［５］，所以已被广泛应用于植物进化、品种
鉴定、基因定位、遗传作图、分子生态学以及遗传多样性
研究中［６－９］。
光核桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｉｒａ ｋｏｅｈｎｅ Ｋｏｖ ｅｔ．Ｋｐｓｔ）属蔷薇科
桃属植物，又名西藏桃，是极其珍贵的野生桃种质资源，
具有适应性强、耐旱、抗病、长寿、结果力强、更新容易等
优良特性，具有较高的生态价值，同时其果实中富含糖、
维生素Ｃ和其它营养成分，具有较高的经济价值，因此
光核桃是集生态价值和经济价值为一体的优良树种。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
采集幼嫩的光核桃叶片，经液氮冷冻处理２０ｍｉｎ，
迅速放入－８０℃冰箱里冻藏。利用改良的ＣＴＡＢ法提
取样品基因组总ＤＮＡ。
１．２ 试验方法
１．２．１ ＤＮＡ纯度测定 采用紫外分光光度计测定ＤＮＡ
在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的ＯＤ值，并通过计算ＯＤ２６０／ＯＤ２８０
值，测定ＤＮＡ纯度。
１．２．２ ＩＳＳＲ体系优化 为了确保ＩＳＳＲ反应体系的扩
增效果，优化反应体系，通过设置单因素梯度确定模板、引
物、ｄＮＴＰｓ、酶、Ｍｇ２＋的浓度。试验中，反应体系为２５μＬ，
固定其它因素，仅设置１个变量。模板浓度梯度分别设
置为２０、３０、４０、５０、６０ｎｇ／μＬ，引物浓度梯度分别设置为
０．１、０．２、０．３、０．４、０．５μｍｏｌ／Ｌ，Ｍｇ２＋浓度梯度分别设置为
１．０、２．０、２．５、３．０、３．５ｍｍｏｌ／Ｌ，酶浓度梯度分别设置为
０．５、１．０、１．５、２．０、２．５Ｕ，ｄＮＴＰｓ浓度梯度分别设置为
０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ。
２ 结果与分析
注：Ｍ为Ｍａｒｋｅｒ ２ ０００；１～５为所提取的植物ＤＮＡ。
Ｎｏｔｅ：Ｍ ｉｓ Ｍａｒｋｅｒ ２ ０００；１－５ｉｓ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ．
图１ 改良ＣＴＡＢ法提取的基因组ＤＮＡ的电泳结果
Ｆｉｇ．１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ
２．１ ＤＮＡ的提取
采用改良的ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ产物ＯＤ２６０／ＯＤ２８０
值在１．８～２．０之间，证明所提ＤＮＡ杂质蛋白及酚类
少，纯度较好；经０．８％琼脂糖凝胶电泳检测，ＤＮＡ条带
较为整齐且明亮清晰（图１）。所以确定改良ＣＴＡＢ法为
提取材料基因组ＤＮＡ的方法。
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·生物技术· 北方园艺２０１５（２０）：９５～９８
２．２ 最佳模板浓度的确定
扩增结果受模板浓度的直接影响，模板浓度过低则
扩增条带不完全，过高则条带出现弥散现象。由图２
可以看出，第３泳道条带的扩增效果最好。因此选用
４０ｎｇ／μＬ作为扩增模板的浓度。
注：Ｍ：ＤＬ２ ０００Ｍａｒｋｅｒ；泳道１：模板浓度２０ｎｇ／μＬ；泳道２：模板浓度３０ｎｇ／μＬ；泳道３：模板浓度４０ｎｇ／μＬ；泳道４：模板浓度５０ｎｇ／μＬ；泳道５：模板
浓度６０ｎｇ／μＬ。
Ｎｏｔｅ：Ｍ，ＤＬ２ ０００Ｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ １，２０ｎｇ／μＬ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ２，３０ｎｇ／μＬ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ３，４０ｎｇ／μＬ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；
Ｌａｎｅ ４，５０ｎｇ／μＬ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ５，６０ｎｇ／μＬ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
图２ 不同模板ＤＮＡ浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
２．３ 最佳引物浓度的确定
不同浓度的引物会直接影响扩增条带的清晰程度，
由图３（Ａ）可以看出，第２泳道条带最清晰，即引物浓度
为０．４μｍｏｌ／Ｌ时扩增效果最好。
注：Ａ，Ｍ：ＤＬ ２ ０００Ｍａｒｋｅｒ；泳道１：引物浓度０．５μｍｏｌ／Ｌ；泳道２：引物浓度０．４μｍｏｌ／Ｌ；泳道３：引物浓度０．３μｍｏｌ／Ｌ；泳道４：引物浓度０．２μｍｏｌ／Ｌ；
泳道５：引物浓度０．１μｍｏｌ／Ｌ。Ｂ，Ｍ：ＤＬ ２ ０００Ｍａｒｋｅｒ；泳道１：Ｍｇ２＋浓度３．５ｍｍｏｌ／Ｌ；泳道２：Ｍｇ２＋浓度３．０ｍｍｏｌ／Ｌ；泳道３：Ｍｇ２＋浓度２．５ｍｍｏｌ／Ｌ；泳
道４：Ｍｇ２＋浓度２．０ｍｍｏｌ／Ｌ；泳道５：Ｍｇ２＋浓度１．０ｍｍｏｌ／Ｌ。
Ｎｏｔｅ：Ｉｎ Ａ，Ｍ，ＤＬ ２ ０００Ｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ １，０．５μｍｏｌ／Ｌ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ２，０．４μｍｏｌ／Ｌ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ３，０．３μｍｏｌ／Ｌ ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ４，０．２μｍｏｌ／Ｌ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ５，０．１μｍｏｌ／Ｌ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ Ｂ，Ｍ，ＤＬ ２ ０００Ｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ １，３．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ２，３．０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ３，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ４，２．０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ５，１．０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
图３ 不同引物浓度（Ａ）和不同Ｍｇ２＋（Ｂ）浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（Ａ）ａｎｄ Ｍｇ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（Ｂ）ｏｎ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
２．４ 最佳Ｍｇ２＋浓度的确定
由图３（Ｂ）可以看出，当 Ｍｇ２＋浓度为１．０ｍｍｏｌ／Ｌ
和２．０ｍｍｏｌ／Ｌ时，扩增条带不清晰，当 Ｍｇ２＋浓度为
３．０ｍｍｏｌ／Ｌ和３．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，条带较亮，但随着浓
度的增加出现弥散现象，所以确定 Ｍｇ２＋最适浓度为
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ。
２．５ 最佳酶浓度的确定
酶浓度是影响扩增结果的关键因素之一，浓度过低
则无法扩增出清晰完整条带，过高则条带出现弥散。由
图４（Ａ）可以看出，第１泳道即酶浓度为０．５Ｕ时，扩增
效果最好。
２．６ ｄＮＴＰｓ浓度的确定
不同的扩增需要不同浓度，因为扩增片段的大小
决定ｄＮＴＰｓ的最适浓度，由图４（Ｂ）可以看出，当
ｄＮＴＰｓ浓度为０．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，能扩增出较为清晰的
条带。
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北方园艺２０１５（２０）：９５～９８ ·生物技术·
注：Ａ，Ｍ，ＤＬ ２ ０００Ｍａｒｋｅｒ；泳道１，酶浓度０．５Ｕ；泳道２，酶浓度１．０Ｕ；泳道３，酶浓度１．５Ｕ；泳道４，酶浓度２．０Ｕ；泳道５，酶浓度２．５Ｕ。Ｂ，Ｍ，ＤＬ
２ ０００Ｍａｒｋｅｒ；泳道１，ｄＮＴＰｓ浓度０．１ｍｍｏｌ／Ｌ；泳道２，ｄＮＴＰｓ浓度０．２ｍｍｏｌ／Ｌ；泳道３，ｄＮＴＰｓ浓度０．３ｍｍｏｌ／Ｌ；泳道４，ｄＮＴＰｓ浓度０．４ｍｍｏｌ／Ｌ；泳道
５，ｄＮＴＰｓ浓度０．５ｍｍｏｌ／Ｌ。
Ｎｏｔｅ：Ｉｎ Ａ，Ｍ，ＤＬ ２ ０００Ｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ１，０．５Ｕｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ２，１．０Ｕｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ３，１．５Ｕｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ４，
２．０Ｕｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ５，２．５Ｕｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ Ｂ，Ｍ，ＤＬ ２ ０００Ｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ １，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ２，０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ３，０．３ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ４，０．４ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌａｎｅ ５，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
图４ 不同酶浓度（Ａ）和不同浓度ｄＮＴＰｓ（Ｂ）对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ Ｔａｇ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａ）ａｎｄ ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｂ）ｏｎ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
３ 讨论
不同模板材料所要求的ＩＳＳＲ反应体系不同，该研
究对５个反应参数加以优化，确定最佳反应体系。模板
浓度低于一定范围会导致分子碰撞几率降低，使得扩增
产物不稳定；若模板浓度高于一定范围又会使得非特异
性增强，从而使扩增条带弥散［１０］。试验结果也证明了这
一点，当模板浓度为２０ｎｇ／μＬ和３０ｎｇ／μＬ时，扩增条带
微弱，几乎看不清，当模板浓度为５０ｎｇ／μＬ和６０ｎｇ／μＬ
时，扩增条带出现弥散。
引物浓度过低则与模板接触不完全，不能有效地扩
增条带；而浓度过高会产生引物二聚体，出现非特异性
扩增条带，此外，还会影响靶序列的产量［１１］。同时Ｍｇ２＋
是反应体系中的重要因素，影响产物的特异性、引物与
模板的结合效率等，从而影响试验结果。此外，酶是价
格比较高的试剂，浓度过高不仅导致试验结果不理想还
会造成经济浪费；用量过低则会使反应不完全，导致产
物量减少［１２］。所以在该试验反应体系中，选用０．５Ｕ最
为合适。
ｄＮＴＰｓ是扩增反应中的原料，浓度过高会螯合大量
的Ｍｇ２＋，导致整个反应失败，而且也不经济［１３］；浓度过
低又会影响扩增效率，试验中设置５个梯度，当浓度为
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，条带较为清晰，且更为经济，确定为最适
反应浓度。
参考文献
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Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＳＳＲ ｏｎ Ｐｒｕｎｕｓ ｍｉｒａ ｋｏｅｈｎｅ Ｋｏｖ ｅｔ．Ｋｐｓｔ
ＭＥＮＧ Ｆａｎｊｕａｎ１，ＸＩＮＧ Ｃｈｕｎ１，ＸＵ Ｆｕｌｉｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｚｈｏｎｇｋｕｉ ２，ＬＩ Ｒｏｎｇｑｉｎ２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ １５００４０；２．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｔｉｂｅｔ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉｎｚｈｉ，Ｔｉｂｅｔ ８６００００）
７９
·生物技术· 北方园艺２０１５（２０）：９８～１０１
第一作者简介：谢丽雪（１９８１－），女，福建厦门人，硕士，助理研究员，
研究方向为果树遗传育种及病害。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓａｒａｈ６１４５１０＠１２６．ｃｏｍ．
责任作者：李韬（１９６９－），男，本科，副研究员，研究方向为果树遗传
育种及病害。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｅｅｔａｏ０６＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：福建省公益类科研院所专项资助项目（２０１５Ｒ１１０１０１８－
１３）；福建省种业创新与产业化工程资助项目（２０１４Ｓ１４７７－２２）；福州
市科技计划资助项目（２０１３－Ｎ－５４）；福建省农业科学院导师制基金
资助项目（２０１３ＤＱＢ－９）。
收稿日期：２０１５－０６－０４
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１５２００２４
蓝莓休克病毒的ＲＴ－ＰＣＲ快速检测方法建立
谢 丽 雪１，蔡 伟２，郑 姗１，张 立 杰１，张 小 艳１，李 韬１
（１．福建省农业科学院 果树研究所，福建 福州３５００１３；２．福清出入境检验检疫局，福建 福清３５０００１）
摘 要：以蓝莓叶片为试材，提取病毒ＲＮＡ，根据已报道的蓝莓休克病毒（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｓｈｏｃｋ
ｖｉｒｕｓ，ＢｌＳｈＶ）外壳蛋白基因序列设计特异性引物，建立ＲＴ－ＰＣＲ快速检测方法，并对采集的２０份
疑似病例进行检测。结果表明：建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法具有良好的特异性和较高的灵敏度。仅从
感染ＢｌＳｈＶ的样品中扩增出与预期大小相符的特异性目的片段，而从其它蓝莓病毒及健康样品
中未扩增到目的片段；该方法能检测到ＲＮＡ原液的１０－４倍稀释液，灵敏度较高。疑似病例检测
结果与ＥＬＩＳＡ验证结果完全相符。试验表明，建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法能够用于ＢｌＳｈＶ的现地
检测。
关键词：蓝莓休克病毒；ＲＴ－ＰＣＲ；快速检测
中图分类号：Ｓ ４３２．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１５）２０－００９８－０４
病毒病是蓝莓生产上的主要病害之一，目前已报道
的病毒主要包括蓝莓休克病毒（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｓｈｏｃｋ ｖｉｒｕｓ，
ＢｌＳｈＶ）、蓝莓焦枯病毒（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｓｃｏｒｃｈ ｖｉｒｕｓ，ＢＬＳｃＶ）、
蓝莓带化病毒（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｓｈｏｅｓｔｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ，ＢＳＳＶ）、蓝莓
叶斑驳病毒（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｌｅａｆ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ，ＢＬＭｏＶ）、蓝莓
红环斑病毒（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｒｅｄ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ，ＢＲＲＶ）、烟草
环斑病毒（Ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ，ＴＲＳＶ）、番茄环斑病毒
（Ｔｏｍａｔｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ，ＴｏＲＳＶ）等［１－７］。其中，蓝莓休克
病毒（ＢｌＳｈＶ）属雀麦花叶病毒科（Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）等轴不
稳环斑病毒属（Ｉｌａｒｖｉｒｕｓ）成员，最早于１９８７年在美国的
Ｈｉｇｈｂｕｓｈ ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ Ｌ．）上被发
现［１］。ＢｌＳｈＶ现主要分布于美国的加利福尼亚、宾夕法
尼亚州、纽约州、密歇根州和加拿大的新斯科舍省［８－９］，该
病毒基因组为＋ｓｓＲＮＡ，全长９ ６５０ｂｐ，病毒粒子呈等轴
对称球状，直径约２７ｎｍ。已报道的ＢｌＳｈＶ的自然寄主为
蓝莓，人工侵染寄主有本氏烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、克
利夫兰烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉ）、林烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌ－
ｖｅｓｔｒｉｓ）和普通烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）。ＢｌＳｈＶ侵染蓝
莓后引起的主要症状是开花期时花和叶片的突然完全
坏死，但之后除引起不结果外叶片仍会长出。受ＢｌＳｈＶ
侵染的蓝莓通常在１～４年内表现症状，随之逐渐恢复
并隐症。ＢｌＳｈＶ几乎侵染所有的蓝莓品种，并表现相似
的症状。据统计，ＢｌＳｈＶ侵染蓝莓造成的损失达３４％～
９０％，损失大小与症状严重程度直接相关，且不同年份
之间存在差异［９－１０］。ＢｌＳｈＶ可通过蜜蜂携带感染的花粉
传播，因此在田间扩散速度相对较快［１１］。
我国从１９８３年由吉林农业大学引种蓝莓栽培，至
２０００年建立基地开始蓝莓产业化种植［１２－１３］。由于我国
蓝莓产业处于起步阶段，蓝莓病虫害的相关报道较少，
仅辽宁、山东、上海等地已对蓝莓的病虫害做了相关的
调查［１４－１７］，但未见休克病的相关研究报道。课题组在
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｎｓｕｒｅ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＩＳＳＲ ｆｏｒ Ｐｒｕｎｕｓ ｍｉｒａ ｋｏｅｈｎｅ Ｋｏｖ ｅｔ．Ｋｐｓｔ，ｔｏｔａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ
ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭｇＣｌ２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，
Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｄｏｓｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＩＳＳＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ４０ｎｇ／μＬ，ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ０．４μｍｏｌ／Ｌ，Ｍｇ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，
ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ０．５Ｕ，ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｗｏｕｌｄ
ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｎ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｕｎｕｓ ｍｉｒａ ｋｏｅｈｎｅ Ｋｏｖ ｅｔ．Ｋｐｓｔ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｒｕｎｕｓ ｍｉｒａ ｋｏｅｈｎｅ Ｋｏｖ ｅｔ．Ｋｐｓｔ；ＩＳＳＲ；ｓｙｓｔｅｍ ｏｐｔｉｍａｚａｔｉｏｎ
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