全 文 ：第 27卷 ,第 2期 光　谱　实　验　室 Vol . 2 7 , No . 2
2 0 1 0年 3月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory March , 2 0 1 0
荧光法研究山莓叶提取物
清除羟自由基的活性①
① 湖南省教育厅重点科技计划项目 ( 06A057)
② 联系人 ,电话: ( 0731) 88663578;手机: ( 0) 13574186720; E-mail: zhang min980110@ yahoo. com. cn
作者简介:张敏 ( 1969— ) ,女 ,湖南省张家界市人 ,副教授 ,硕士 ,主要从事教学科研工作。
收稿日期: 2009-08-11;接受日期: 2009-09-26
张 敏② a,b　胡文彬a　曹 庸 c　陈雪香 c
a (中南林业科技大学材料科学与工程学院　长沙市韶山南路 498号　 410000)
b(湖南农业大学生物科学技术学院　长沙市　 410000)
c(华南农业大学食品学院　广州市　 510642)
摘　要　在稀硫酸介质中 ,荧光染料亮绿 ( LGSF)在 312nm处产生荧光 , Fenton反应产生的· OH与
亮绿反应 ,使其荧光猝灭。根据此原理 ,荧光光度法测定山莓叶不同萃取物清除自由基活性存在很大差异。
同时 ,当提取物浓度达到 0. 40mg /mL时自由基清除率分别可达到 27. 34% , 38. 65% , 40. 22% , 41. 68% ,其
中 ,山莓叶正丁醇萃取物清除羟自由基活性最强。 本研究为山莓叶的合理开发利用提供理论依据。
关键词　山莓叶 ;羟自由基 ;清除 ;荧光光度法 ;亮绿
中图分类号: O657. 32　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1004-8138( 2010) 02-0413-05
1　引言
羟自由基 (· OH)是生命活动的氧化代谢过程中产生的一种具有代表性的自由基 ,是目前已知
的化学性质最活泼的一种活性氧分子 ,是造成组织、脂质过氧化 ,核酸断裂 ,蛋白质和多糖分解的活
性氧 ,与机体的衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关。因此 ,近年来有关自由基清除剂的研究受到
世界各国的重视 [1, 2 ]。 山莓为多年生的落叶灌木 ,具有抗菌消炎 ,抗腹泻的功效 ,是民间传统的中
药。研究发现其含有黄酮、氨基酸、萜类等等活性成分 ,这些物质可作为还原剂或自由基清除剂而终
止自由基反应 [3 ] ,研究山莓叶提取物对羟自由基 (· OH)的清除作用 ,为抗氧化药物的筛选提供依
据。
目前 ,对· OH测定方法主要有电子自旋共振法、高效液相色谱法、化学发光法 [4 , 5]。荧光法是
一种灵敏度高、选择性好、操作简便的分析方法 [6 ] ,本实验利用芬顿体系反应产生的· OH能使荧
光燃料亮绿的荧光强度猝灭的特点 [7 ] ,通过荧光光谱分析法研究了山莓叶提取物对羟自由基的清
除能力及量效关系 ,为开发利用山莓叶丰富的资源有着重要意义。
2　实验部分
2. 1　材料、试剂与仪器
2. 1. 1　实验材料
山莓叶于 2008年 9月采集于湖南张家界吉首大学后山 ,自然阴干 ,粉碎 ,备用。
2. 1. 2　主要试剂
1. 0mmol /L硫酸亚铁工作液 ; 2mmol /L抗坏血酸溶液 ; 4mmol /L双氧水溶液 ; 1mmol /L硫酸
溶液 ; 1mmol /L亮绿溶液 ;以上试剂均为分析纯。实验用水为二次亚沸蒸馏水。
2. 1. 3　实验仪器
AUY-220电子天平 (日本岛津公司 ) ; RE-52型旋转蒸发仪 (上海羌强仪器设备公司 ) ; SHZ-
DIII型循环式真空水泵 (郑州市斯泰仪器公司 ) ; FST-114型实验室用粉碎机 (上海金鹏分析仪器公
司 ) ; RF-5000荧光分光光度计 (日本岛津公司 )。
2. 2　实验方法
2. 2. 1　试样的制备
称取山莓叶粉碎样 5. 0g ,加 50mL 80%的乙醇浸泡 24h后 ,过滤 ,滤液浓缩 ,滤渣再浸提 2次 ,
合并滤液 ,浓缩至 50mL,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取 ,浓缩得到石油醚、氯仿、乙酸
乙酯、正丁醇浸膏 , 真空干燥。 分别称取石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物各 20mg ,用 10mL
甲醇溶解 ,萃取物含量为 2mg /mL,备用。
2. 2. 2　测定原理
Fenton反应是以 H2O2为氧化剂 ,以亚铁为催化剂的反应体系 ,产生羟自由基 ,与亮绿分子的
碳碳双键发生亲电加成反应 ,使亮绿的荧光强度猝灭 ,间接测定羟自由基的产生量。反应原理如下:
Fe
2+
+ H2O2 Fe
3+
+ · OH+ OH-
图 1　酸性条件下亮绿的荧光光谱
1—— 激发光谱 (Ex= 268nm) ;
2—— CLGSF= 0. 08mmol /L发射光谱 ;
3—— CLGSF= 0. 06mmol /L发射光谱 ;
4—— CLGSF= 0. 04mmol /L发射光谱。
2. 2. 3　羟自由基的测定
在 25mL的容量瓶中 ,依次加入 2mL 1mmol /L的亮
绿 LGSF 溶液、 2mL 1mmol /L 的 H2 SO4 溶 液、 2mL
1mmol /L的 FeSO4溶液和 1mL 4mmol /L的 H2O2溶液 ,
加水定容至刻度 ,摇匀 ,静置 60min,在波长 312nm处测定
荧光强度 F( Ex= 268nm)。未加芬顿试剂的体系荧光强度
为 F0 ,羟自由基产生的量用 ΔF= F0- F来表示 ,ΔF越大 ,
表示生成的羟自由基越多。
2. 2. 4　山莓叶提取物清除羟自由基作用的测定
在上述体系中加入一定量的山莓叶提取物 ,测定其荧
光强度为 F,未加入山莓叶提取物测定荧光强度为 Fs ,则
羟自由基清除率 D可按下式计算: D= [ ( F′- Fs ) / ( F0 -
F ) ]× 100%。
414 光谱实验室 第 27卷
3　结果与讨论
3. 1　亮绿 LGSF的发射光谱的确定
亮绿在水溶液中存在形式和颜色与溶液的 pH有关 ,在碱性溶液中无色 ,在接近中性和酸性溶
液中为绿色 ,实验取 1mmol /L的 H2 SO4 2. 0mL,加入不同体积的亮绿 ,随着浓度增大 ,荧光强度增
大 ,但发射峰位置不变 ,实验选定激发波长 Ex= 268nm ,发射波长为 Em= 312nm ,如图 1。
3. 2　H2SO4用量对荧光强度的影响
分别取 2mL LGSF,各自加入 0、 1、 2、 3、 4、 5mL的 1mmol /L的 H2 SO4 ,用水定容至 25mL,测定
荧光强度的变化 ,实验发现在一系列酸性条件下 ,随着硫酸浓度的增加 ,酸度对荧光强度的影响很
小 ,其结果见图 2。 故本实验选用 1mmol /L的 H2 SO4 2mL。
图 2　硫酸用量对亮绿荧光强度的影响
3. 3　 FeSO4对荧光强度的影响
固定其他条件不变 ,分别加入不同体积的 FeSO4
溶液 ,反应后测定荧光强度 ,结果表明当加入 FeSO4溶
液 2mL时 ,荧光强度趋于稳定 ,故选取 FeSO4的用量
为 2mL,如图 3。
3. 4　H2O2用量的影响
在 25mL容量瓶中依次加入 2mL 1mmol /L亮绿
溶液、 2mL 1mmol /L FeSO4、 2mL1mmol /L H2 SO4 ,以
及不同量的体积分数为 2%的 H2O2溶液 ,考察 H2O2用量对荧光强度的影响 ,结果表明 ,随着 H2O2
用量增加 ,荧光强度降低 ,考虑到该反应的灵敏度 ,采用 H2O2用量为 1mL,如图 4。
图 3　硫酸亚铁用量对荧光强度的影响 图 4　双氧水用量对荧光强度的影响
3. 5　反应时间的影响
按 2. 2. 1方法配制溶液后 ,立即测定其荧光强度值 ,以后每隔 30min检测一次 ,结果表明随着
反应时间增加 ,体系荧光强度值在室温下基本不变 ,可视为反应完全 ,本实验选用 60min为反应时
间 ,如图 5。
3. 6　抗氧化剂清除羟自由基
在上述最佳实验条件下 ,分别加入 0、 1、 2、 3、 4、 5mL的 1mmol /L抗坏血酸 ,测定其荧光强度的
变化 ,并计算抗坏血酸对羟自由基的清除率 ,如图 6所示 ,亮绿荧光检测抗坏血酸清除羟自由基的
作用具有良好的量效关系 ,表明该方法在测定清除羟自由基作用具有一定的应用价值。
415第 2期 张敏等:荧光法研究山莓叶提取物清除羟自由基的活性
图 5　反应时间对荧光强度的影响 图 6　抗坏血酸与羟自由基清除率的量效关系
3. 7　抗氧化作用的测定
本实验对山莓叶不同溶剂萃取物的抗氧化作用进行了测定。依次向 25mL容量瓶加入 2mL亮
绿、 2mL H2 SO4、 2mL FeSO4、 1mL H2O2以及山莓叶的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物 ,静置
60min,测定 ΔF ,并计算羟自由基的清除率 ,见表 1。
表 1　山莓叶提取物对· OH的清除作用
用量 ( mg /mL)
清除率 (% ) 0. 08 0. 14 0. 24 0. 32 0. 40
石油醚提取物 16. 47 20. 34 23. 56 25. 27 27. 34
氯仿提取物 19. 93 24. 76 29. 78 36. 46 38. 65
乙酸乙酯提取物 16. 68 23. 02 30. 45 37. 89 40. 22
正丁醇提取物 29. 20 37. 32 40. 11 38. 92 41. 68
从表 1可知 ,山莓叶不同溶剂萃取物均有一定羟自由基清除的能力 ,当提取物浓度达到
0. 40mg /mL时自由基清除率分别可达到 27. 34% , 38. 65% , 40. 22% , 41. 68% ,其中 ,山莓叶正丁醇
萃取物清除羟自由基活性最强。
4　结论
山莓叶中含有多酚 ,萜类 ,黄酮等生物活性物质 ,这些物质可作为还原剂或自由基清除剂而终
止自由基反应 ,由此表现出对自由基的清除作用。对山莓叶不同溶剂萃取物清除羟自由基作用的测
定 ,为分离抗氧化活性物质提供研究基础 ,有效地推动山莓叶进一步走向中药现代化市场。
参考文献
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416 光谱实验室 第 27卷
Study on Scavenging Activity of Extracts from Rubus
Corchorifolius L. f. Leaves to Hydroxyl Free Radicals by Fluorimetry
ZHAN G Mina,b　 HU Wen-Bina　 CAO Yongc　 CHEN Xue-Xiangc
a(College of Material Science and Engineering ,Central South Forest and Technolog y University,Changsha 410000, P. R.China)
b(College of B ioscience and Technolog y, Hunan Agr icul tural University ,Chang sha 410000, P. R. China )
c(College o f Food Science, South China Agricul tural University ,Guangzhou 510642, P. R.China)
Abstract　 The f luorescence can be quenched by the hydroxyl radical produced by fenton
reaction. The f ree radical scavenging activity of Rubus corchorif ol ius L. f. was determinated by
mearsuring the change of f luorescence intensity of LGSF. The ex t racts scavenging ra tes are 27. 34% ,
38. 65% , 40. 22% , 41. 68% respectiv ely w hen ex tract s concentration is 0. 40mg /mL, and free radical
scavenging capacities of EtO AC extract is the best. A reference method was provided fo r reasonable
exploi tation and utili zation of Rubus corchorifolius L. f. leav es.
Key words　 Leaves of Rubus Corchorif ol ius L. f. ; Hydroxyl Radical; Scavenging; Fluo rimetry;
Light Green SF
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2010年
　①本来这期是准备走邮局寄送的 ,但碰上了邮局“盘点” ,宣布停业 3天 ,着急请去总局寄。无奈只好寻求其他邮寄方式。
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