全 文 ：7 1 8 齐鲁药事 Q il“ p h a r , a c e“ t ica l人加 isr 2 0 0夕的 1. 2 8 ,阶 . 1 2
t h
e
f l
o w r a t e w a s 1
.
o m L
·
m i n 一 ` ; D e t e e t i o n w a v e le n g t h w a s 2 7 o n m ; e o l u m n t e m p e r a t u r e w a s 2 0℃ . R E S U L sT T h e e a li b r a t io n
e u r v e s o f T
a n s
h i
n o n e 1
A w e r e li n e a r i n t h e r a n g e o f 0
.
1 1 5一 0 . 6 9 1拌g ( r = 1. 0 0 0 0 ) . T h e a v e r a g e r e e o v e r i e s w e r e 9 8 . 5 1% (邓 D
= 0
.
9 4% )
r e s p e e t iv e l y
.
C O N C L u S I O N T h
e m e t h o d w a s r a p记 , a e e u r a t e a n d r e li a b le ·
K E Y W O R D S
:
H P L C
;
T
a n s h in o n e l
A ;
H
u o x u e M
a id
o n g C
a p s u l e
活血脉动胶囊是由丹参 、人工牛 黄等精制加工而成的复
方制剂 , 具有活 血化痰和清热解毒之功效 , 临床上用 于治疗
栓塞性血管病 , 以及末梢血管痉挛引起的疼痛 。 丹参具有祛
癖止痛 、活血通经 、清心除烦的功效是该制剂的主要药物 , 为
进一步提高制剂质量 ,确保临床疗效 ,在原有标准的基础上 ,
依据生产工艺参数 ,建立了有效控制丹参质量的检测指标 。
对提取方法 、 色谱条件进行了筛选 ,优化了实验方法 , 并进行
了方法学验证 。 该方法可有效排除干扰物质 , 灵敏度高 , 操
作简便 , 结果准确可靠 。
l 仪器与试药
A g i le n t 1 1 0 0 高效液相色谱仪 ; A g il e n t D A D 检测器 ;
A g i l
e n t C h
e m s t a t io n 工作站 (美 国安捷伦科技公司 ) 。
对照 品 : 丹 参酮 n A (含 量测 定用 , 批 号 : 1 10 7 6 6 一
2 0 0 4 1 6) 由中国药品生物制品检定所提供 ;活 血脉动胶囊由
济宁市脉管炎医院提供 。 色谱纯甲醇 (天津市科密欧化学试
剂开发中心 ) ;其余试剂为分析纯 。
2 方法与结果
2
.
1色谱条件 选用 T be n 刀 0 B D S H Y I〕ES IL CI : ( 2 5 0 ll u l l X
4
.
6
~
,
5产m ) 色谱柱 , 以甲醇 一水 (7 8 , 2 )为流动相 , 流速为
1
.
Om L
· 而 n 一 ’ ,检测波长为 2 70 ln ,柱温 20 ℃ ,进样量 1如 L 。
2
.
2 检测波长 的选择 参考 《中国药典》 2 0 0 5 年版 (一部 ) , 考
虑到其它干扰因素 ,选择 2 7 o n m 为检测波长 。
2
.
3 专属性考察
2
.
3
.
1供试品溶液制备 : 样品 20 粒 ,精密称定内容物的重
量 ,研细 , 取样品约 1 . 0 9 ,精密称定 ,置具塞锥形瓶中 , 精密
加人 甲醇 50 m L , 密塞 , 称定重量 , 加热 回流 hl , 放冷 后 , 密
塞 ,称定重量 ,用甲醇补足减损的重量 ,摇匀 ,滤过 ,作为供试
品溶液 ,结果见图 l 。
2
.
3
.
3 阴性样品溶液的制备 : 按制剂的处方工艺 , 除去丹参
药材制成不含丹参的样品 ,并按供试品溶液制备方法 ,制备
阴性对照溶液 ,结果见图 3 。
m 人U l
乃30万约巧川50`
仍叨神伪朋印扔沁。
图 1 样品色谱图
2
.
3
.
2 对照品溶液制备 :分别精密称取经减压干燥 2 4 h 后 的
丹参酮 1 、 对照品 12 . o m g , 置 的 m L 棕色量瓶中 , 加甲醇使
溶解并稀释至 刻度 ,摇匀 ,作为对照品储备液 。 精密吸取
3 m L
,置 25 m L 棕色量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 , 摇匀 , 作为
对照品溶液 , 结果见图 2 。
人_ _ _ _ _ _
5 f o f s 口0 乃
图 2 对照品色谱图 (丹参酮 n )^
图 3 阴性对照色谱图
按上述色谱条件进行测定 ,结果阴性样品对丹参酮 l A
的含量测定无干扰 。
2
.
4 线性关系考察 取丹参酮 n A 对 照 品溶液 , 分别进样
4
·
o
,
8
·
0
,
1 2
·
0
,
1 6
·
o
,
2 0
·
o
,
2 4
.
0拌L , 按色谱条件测定峰面积
值 。 以进样量如g )为横坐标 ( X ) ,峰面积值为纵坐 标 ( Y ) ,
绘制标准曲线 ,并进行线性 回归 ,结果见表 1 。
表 1 对照品线性关系的考察
对照品 进样盆 X (哪 ) 峰面积 ( Y ) 标准曲线 线性范围(阳 )
0
.
1152 600 834
丹参酮 n ^ 0 . 2 3 0 4 11 7 6 . 9 2 9
0
.
3 4 5 6 1 7 7 7
.
5 3 4 Y 二 5 1 2 2 . 2 X + 6 . 5 4 0 . 11 5~ 0 . 6 9 1
0
.
4 6 0 8 2369
.
588 r 二 1. 0 0 0 0
0 576 2966
.
94 5
0 69 12 35 38
.
922
2
.
5 精密度试验 精密 吸取对照品 (0 . 0 4 8 8 2m g · m L 一 ` )溶
液 1即 L ,连续进样 5 次 ,测定丹参酮 n A 峰面积 ,其 Rs D 为
0
.
2 6%
, 表明精密度符合要求 , 结果见表 2 。
裹 2 精密度试验结果
样品 1 2 3 4 5 平均值 咫 D ( % )
峰面积 2 5 0 5 . 3 9 2 5 2 0 . 7 8 2 5 0 3 . 5 1 2 5 1 1 . 1 0 2 5 1 1 1 0 2 5 1 0 . 3 8 0 . 2 6
2
.
6 稳定性考察 取样品溶液 , 分别在 0 , 2 , 4 , 6 , s h 测定丹
参酮 n A 峰面积 ,结果在 s h 内其 R S D 为 。 . 46 % 。 表明样品
溶液在 s h 内是稳定的 ,结果见表 3 。
表 3 稳定性考察结果
时间 ( h ) o h z h 峨h ` h 吕h 平均值 五万口 (沁 )
峰面积 2892 . 953 2975 . 47 2984 . 72` 2893. 992 289名, 039 2283 . 534 0 . 30
2
.
7 重复性试验 取同一批样品 5 份 , 分别测定含量 , 结果
丹参酮 1 ^ 的含量 ( m g · g 一 ’ )分别为 2 . 814 、 2 . 7 5 7 、 2 . 5 2 2 、
2
.
8 14
、
2
.
8 0 5
,平均含量 2 . 8 1 ( 尺S D = 1 . 2 8 % ) , 表明样品重
复性很好 。
2
.
8 加样 回 收率考察 取 已知含量的样 品 6 份 , 每份约
。 . 5 9 ,精密称定 , 置具塞锥形瓶中 ,精密加人丹参酮 n A 对照
品 1. 4 2m g ,分别上述条件进行测定 ,结果见表 4 。
即钓加o劝动菊。
7 2 0
ō哪洲0lot
1 1 0 7 0 9一 2 0 0 3 0 4) 购自中国药 品生物制品检定所 ;提取物样
品 : 单位自制 ;其他试剂均为分析纯 , 水为二次蒸馏水 .
2 方法
2
.
1 总黄酮含量测定
2
.
1
.
1 对照品溶液制备 :精密称取经五氧化二磷干燥至恒重
的芦丁对照品 9 . 19 m g , 加甲醇溶解并稀释至 25m L , 配成
.0 3 6 6 4 m g
·
m L 一 ’ 的对照品溶液 。
2
.
1
.
2 醇提取物的制备 : 取翻白草药材 90 9 ,加人 80 % 乙醇
溶液 8 0 m L ,加热回流提取两次 , 每次 1. s h , 合并乙醇提取
液 ,加 1 %澄清剂 ,放置 48 h , 滤过 ,滤液减压回收乙醇至尽得
稠膏 , 5 ℃ 以下真空 干燥 ,粉碎 ,得提取物药粉 。
2
.
1
.
3 供试品溶液制备 : 精密称取提取物药粉 50 m g ,加水
20 m L
,超声 s m in ,上聚酞胺柱吸附 , 50 % 乙醇洗脱 ,定容于
2 5 m L 量瓶中 , 即得 。
2
.
1
.
4 波长选择 :取对照 品溶液 、 供试品溶液 、 水 ,其他操作
同 2 . 1 . 5 项下 ,在 40 ~ 7 0 0 h m 处进行扫描 ,对照品 溶液与
供试品溶液在 5 1 o n m 处 ,有相同的最大吸收波长 。
2
.
1
.
5 测定法 :精密量取对照品溶液 3 . Om L 、 4 . o m L , 供试品
溶液 Z m L , 加水 至 s m L , 分置 25 m L 量瓶 中 , 其他操作 同
2
.
1
.
6 项下 ,在 5 10 ~ 处测定吸光度值 ,计算 , 得总黄酮含
量 。
2
.
1
.
6 标准曲线的绘制 : 分别精密量取对照 品溶液 1 . 0 、 2 . 0 、
3
.
0
、
4
.
0
、
5
.
o m L
,加水至 s m L , 各加 5 % 亚硝酸钠溶液 l m L ,
摇匀后放置 6 m in ,加人 10 %硝酸铝溶液 l m L , 摇匀后放置
6 m in
,加氢氧化钠试液 3 . 3m L ,加水至刻度 ,放置 巧 m in , 以
水加其他显色剂为空白 , 在 s lo n m 处测定吸光度 : 0 . 16 3 3 、
0
.
3 0 9 2
、
0
.
4 7 5 7
、
0
.
6 21 0
、
0
.
7 7 4 5
, 以对照品的浓度为横坐标 ,
吸光 度 为 纵 坐 标 , 绘 制 标 准 曲线 , 回 归 方 程 为 : Y ~
0
.
4 18 7 22 7 X + 5
.
4 8 ( r = 0
.
9 9 9 5 )
,在 0 . 3 6 6 4~ 1 . 8 32 m g 浓
度范围内 ,呈良好的线性关系 。
2
.
1
.
7精密度试验 : 取对照 品溶液 , 连续测定 6 次 : 0 . 3 0 85 、
0
.
30 9 2
、
0
.
3 0 8 8
、
0
.
3 0 84
、
0
.
3 0 80
、
0
.
3 0 8 7 其 吸 光度均值 为
0
.
30 86
,
R S D 为 0 . 15 % , 表明仪器精密度良好 。
2
.
1
.
8 稳定性试验 : 取同一供试品溶液 , 分别在 。 、 15 、 30 m in
测定其 吸收 度 , 结果其 吸光度 均 值为 0 . 4 8 9 8 , 邢D 为
。 . 75 % ,说明供试品溶液在 30 m in 内基本稳定 。
2
.
1
.
9 重复性试脸 :精密称取提取物药粉 50 m g ,按 2 . 1 . 3 平
行操作 6 份 ,按上述方法测定其吸光度 ,计算其含量均值为
31 .5 Z m g
·
g一 ’ , SR D 值为 。 . 48 万 ,表明该方法的重复性较
好 。
2
.
1
.
1。 加样 回 收率试 验 : 精密 称 取 已 知含 量的 提取物
( 3 1 5
.
Zm g
·
g 一 ’ )之s m g ,按 2 . 1. 3 和 2 . 1 . 5 项下进行操作 ,加
人芦丁对照 品溶液 l( . 90 9 8m g · m L 一 ` )4 m L ,进行试验 ,结果
见表 1 。
表 l 总黄酮含量侧定加样回收率试验结果
试验结果表明 ,该方法 回收率良好 。
2
.
l
.
n 总黄酮测定 :依据上述含量测定方法 ,对 2 批翻白草
醇提取物进行测定 , 计算含量 , 总黄酮含量分别为 : 31 5 . Zm g
·
g 一 1 , 33 0
.
7m g
·
g 一 l 。
2
.
2 总三菇含量测定
2
.
2
.
1 对照品溶液制备 :精密称取五氧化二磷中干燥至恒重
的齐墩果酸对照品 12 . Zm g ,置 25 m L 量瓶中 ,加甲醇溶解并
稀释至刻度 ,摇匀 , 即得 ( 0 . 4 88 m g · m L 一 ’ ) .
2
.
2
.
2 供试品溶液制备 : 精密称取提取物药粉 。 . 19 , 加水
10 m L
,超声 s ha n , 加乙醚萃取三次 ,每次 10 m L , 合并 乙醚
液 ,水浴挥干 ,残留物加甲醇溶解转移至 s m L 容量瓶中 ,摇
匀 ,即得 。
2
.
2
.
3最大吸收波长的选择 : 分别取供试品溶液 、 对照品溶
液各 0 . l m L 置具塞试管中 , 水浴挥干溶剂 , 冷却 , 其他按
2
.
2
.
4项下操作 ,在 4 0 ~ 7 0 0 n m 处扫描 ,对照品溶液与供试
品溶液在 5 4 8 n m 处均有最大吸收 (见下 图 1 、 2 ) 。
4伪 .的
图 1
5佩阅 以幻 .阅 了佣 `附
提取物总黄酮 、芦丁对照品
分光光度法扫描图
、 . ,史
_
`
4伪 .阅 5的 .叻 日刀 .加 7的 . 0样品 样品芦丁 添加芦丁对
( m g ) 含里 ( m g ) 照品盆 ( m g )
侧 出芦丁 回收率 平均回收率 只 S D含量 ( m g ) (肠 ) (% ) (写 )
25
.
0 2
25
.
11
2 5
.
0 5
2 5
.
0 8
2 5 1 4
2 5
.
20
7
.
8 86 3
7
.
9 14 7
7
.
8 95 7
7
.
9 0 5 2
7
.
9 24 1
7
.
9 43 0
7
.
6 39 2
7
.
6 39 2
7
.
6 39 2
7
.
6 39 2
7
.
6 39 2
7
.
6 3 9 2
15
.
4 3 5 4
15
.
54 4 0
1 5
.
64 9 5
1 5 4 6 5 0
15 5 8 62
1 5
.
8 0 3 7
9 8
.
82
9 9
.
8 7
1 0 1
.
5
9 8
.
9 7
1 0 0
。
3
1 0 2
.
9
1 0 0
.
3 9
图 2 提取物总三菇 、齐墩果酸
对照品分光光度法扫描图
2
.
2
.
4 测定法 :精密量取对照品溶液 0 . l m L 、 0 . Zm L ,供试品
溶液 。 . l m L 置试管中 ,水浴挥干溶剂 ,其他操作同 2 . 2 . 5 项
下 ,在 5 4 8 n m 处测定吸光度值 ,计算得总三菇含量 。
2
.
2
.
5 标准 曲线绘 制 : 精密量取 对 照 品 溶 液 。 . 05 , 。. 1 ,
齐鲁药事 · Q I I: , hP a r二 a r e , ` t ica l 人加 i sr 2 0 0 9 为 1 2 8 , 两 . 1 2 7 2 1
0
.
12 5
, 。 . 15 、 。 . Zm L , 分别置具塞试管中 ,水浴挥干溶剂 ,冷
却 ,精密加人 5% 香草醛一冰醋酸溶液 0 . Zm L 和高氯酸 0 . 8
n 1
L
,混匀 , 密塞 。 置 60 ℃ 水浴中加热 15 m in , 取出 , 冷却 , 加
人冰醋酸 s m L ,摇匀后放置室温 。 按分光光度法川 , 以冰醋
酸为 空 白 , 在 5 4 8 n m 处 测 定 吸 光 度 : 0 . 1 7 2 0 , 0 . 3 4 2 2 ,
0
.
42 94
、
0
.
5 17 6
,
0
.
68 65
。 以吸光度为纵坐标 ,对照品浓度为
横坐标绘制标准 曲线 , 回 归方程为 : Y ~ 了. 0 44 6 7一 X 一
1
.
8 5一 ` ( r = 0
.
9 9 9 9 7 )
,在 0 . 0 2 4 4~ 0 . o 9 7 6 m g 范围内 , 呈现
良好的线性关系 。
2
.
2
.
6 精 密度 试 验 : 取对 照 品 溶 液 ( 0 . 48 m g · m L 一 ’ )
0
.
l m L
, 连 续 测 定 6 次 : 0 . 3 4 7 3 , 0 . 3 4 7 5 , 0 . 3 4 56 , 0 . 346 2 ,
0
.
34 80
,
0
.
34 68
, 其吸光度均值为 0 . 3 4 6 9 , 尺S D 为 0 . 26 % ,
表明仪器精密度 良好 。
2
.
2
.
7 稳定性试验 : 供试品溶液 , 分别在 0 , 1 5 , 3 0 , e o m i n 内
测定吸光度值 , sR D 值为 1 . 13 % , 说明在 h1 内进行含量测
定试验基本稳定 。
2
.
2
.
8 重复性试验 :精密称取提取物 。 . 1 9 ,按 2 . 2 . 2 和 2 . 2 . 4
项下平行操作 6 份 ,测定吸光度 ,计算含量均值为 31 . 53 m g
·
g 一 ` , R S D 为 1 . 3 6% , 表明该方法的重复性较好 。
2
.
2
.
9 加样 回收率试验 : 精密称取 已知含量的提取物药粉
( 31
·
5 3 m g
·
g 一 ’ ) s o m g ,按 2 . 2 . 2 和 2 . 2 . 4 项下进行操作 ,在
“精密量取供试品溶液 。 . l m L ”处 , 加人齐墩果酸对照 品溶
液 (0 . 79 0 m g , m L 一 ` )2 m L , 进行试验 ,结果见表 2 。
裹 2 总三菇含量测定加样回收率试验结果
样品 样品齐墩果 添加齐墩果酸
(m g ) 酸含童 (m g ) 对照品盆(功 g )
测出齐墩果酸 平均回收率 拓 D
(% ) ( % )
5 0 14
5 0 0 8
5 0 1 5
5 0 2 0
5 0
,
1 6
5 0 2 9
1
.
6 20 6
l
。
5 7 9 0
1
。
5 8 1 2
1
.
5 82 8
1 5 81 5
1
.
585 6
1
.
5 8 0
1
.
5 8 0
1
.
5 8 0
1
.
5 8 0
1
.
5 8 0
1
.
5 8 0
含量 ( gm )
3
.
1 9 6 3
3
.
14 3 8
3
.
1 3 5 1
3
.
1 83 3
3
.
1 7 4 1
3
.
1 8 7 7
1 0 2
.
2 4
9 9 0 4
9 8
.
3 5
1 0 1
.
3
9 7
.
9 2
9 8
.
78
1 0 0
.
1 1 7 5
实验结果表明 , 该方法 回收率良好 。
2
.
2
.
10 总三掂测定 :依据上述含量测定方法 ,对 2 批翻白草
醇提取物进行测定 , 计算含量 , 总三菇含量分别为 : 31 . 3 m g
·
g 一 l , 3 3
.
7 6 m g
·
g 一 1 。
3 讨论
3
.
1 总黄酮测定的说明 总黄酮的供试品溶液制备采用上
聚酞胺柱 , 目的为富集 、纯化总黄酮 , 排除叶绿素 、 多糖等成
分对测定时的干扰 。
3
.
2 空 白溶剂的选择 总三菇含量测定 中 , 用冰醋酸和冰醋
酸加显色剂作 为空 白对照溶剂进行试验 , 测定的吸光度值非
常小 , 对含量几乎无影响 , 故选择冰酷酸作为空白对照溶剂 。
3
.
3 总兰菇提取方法筛选 曾迭用甲醇 、 丙酮直接溶解提取
物 、 加水溶解提取物上 D 10 1 大孔树脂柱后收集洗脱液作为
供试品溶液 , 在 40 。一 7 0 0 n m 处扫描 , 各供试品溶液与对照
品溶液无相同最大吸收峰呈现 ;采用提取物加水超声 s m in ,
再用乙醚萃取 , 挥干溶剂制备的供试品溶液与对照品溶液进
行扫描 ,则有相同最大吸收峰呈现 。
3
.
4 显色剂说明 总三裕含测方法中的各显色剂 ,进行了加
人量筛选 ,确定方法中的用量 ;并且显色剂必须是准确加人 ,
否则影响含量测定 。
3
.
5 翻白草总黄酮 、 总三菇成分测定 ,采用分光光度法 , 目的
是在翻白草提取 、 纯化的研究过程中 ,控制有效部位的 总含
量 ;但在含量测定方法中的前处理部分 , 提高有效部位的纯
度非常必要 。
参考文献
〔l] 薛培风 , 尹婷 , 梁鸿 , 等 . 翻白草 化学成分的研究 . 中国药学杂
志 , 2 0 0 5 , 4 0 ( 1 4 ) : 1 0 5 2~ 10 54 .
〔2」沈德凤 ,杨 渡 ,付红伟 ,等 . 翻 白草中熊果酸的含量测定 . 中国野
生植物资源 , 2 0 0 2 , 2 1 ( 4 ) ; 5 5~ 5 6 .
〔3 〕孟令云 ,杨玲 ,王佳祥 ,等 . 翻白草 中黄酮类化合物的液相色谱分
析 . 中草药 , 2 0 0 5 , 3 5 ( 3 ) : 4 4 5一 4 4 6 .
【4」李瑞 , 沈鸿 . 翻白草多糖提取工艺研究 . 时珍 国医国药 , 2 0 06 , 1 7
( 1 2 )
:
2 5 2 5 ~ 2 5 2 6
.
[ 5」《中国药典 》 2 0 0 5 年版 (一部 ) . 北京 : 化学工业出版社 , 2 0 0 5 .
注射用丹参酚酸 A 的含量测定方法研究
王磊 ` ,2 ,于翠翠 3 , 刘军锋 3 ,刘 坷 “ , 丁黎 `
l(
. 中国药科大 学 , 江苏 南京 2 10 09 ; 2 . 烟 台市药品检验 所 , 山 东 烟 台 2 6 4 0 0 0
3
. 山 东靶点药物研究有限公 司 , 山 东 烟 台 26 4 0 0 0 )
摘要 : 目的 建立测定注射 用 丹参酚酸 A 高效液相 色谱法 。 方法 采用 iD a m on isl CI 。柱 ( 25 o m m X 4 . 6m m , 5产m ), 乙睛
一 0 . 2%磷酸水溶液 (3 o : 7 0) 为流动相 , 流速 : l m L · m in 一 ` ,检测波长 : 2 8 5n m , 柱 温 : 30 ℃ , 峰面 积外标 法定量 。 结 果 丹参酚
酸 A 在 .0 I n ~ 2 . 664 拜g 范围 内线性关 系良好 ( r 一 。 . 9 9” , n = 7) , 平均 回 收率为 9 8 . 1 9% , RS D 为 1 . 5绒 。 结 论 本 法 简
便 、 灵敏 、 重现性好 , 适合注射用 丹参酚酸 A 的含量测定和质量控 制 。
关键词 : 高效液相 色语法 注射 用丹参酚酸 A 含量测定
中图分类号 : R 92 7 . 2 文献标识码 : A 文章编号 : 1 67 2 一 77 38 (2 00 9 ) 12 一 072 1一 0 3
R e s e a r e h o f d e t e r m i n a t i o n o f s a l v i a n o i e a e i d A i n S a l v i a n o i e a e i d A fo
r l可 e c t i o n
W A N G L e i
` , 2 ,
Y U C u i
一 e u i 3
,
L I U J
u
-n f
e n g
, , L I U K e
3 ,
D I N G L i
`