全 文 ：蛇莓 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
姚旭丽 , 李钧敏 , 谢亚琴 , 施　英 , 李　其 , 应晓露
(台州学院生命科学学院 ,浙江临海 317000)
　　摘要:采用单因素试验对蛇莓 ISSR-PCR反应体系中的 6种主要反应因子(模板 DNA、Mg2+、TaqDNA聚合酶 、
BSA、dNTP及引物)进行优化筛选 ,确立了适合蛇莓 ISSR分析的最佳 PCR扩增反应体系 , 即 10 μlPCR反应体积中
含:1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10 mmol/LTris· HCl, pH值 9.0;50 mmol/LKCl;0.1% TritonX-100 ), 1.75
mmol/LMg2+, 2 mg/mlBSA, 0.2 mmol/L4×dNTP, 10ng模板 DNA, 18pmol引物 , 0.5UTaqDNA聚合酶。
　　关键词:蛇莓;ISSR;反应体系;优化
　　中图分类号:S58　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2009)02-0055-02
收稿日期:2008-10-13
基金项目:浙江省自然科学基金项目(编号:Y505331)。
作者简介:姚旭丽(1987—),女 ,浙江丽水人,主要从事植物生态学研究。
通讯作者:李钧敏。 Tel:(0576)85137067;E-mail:lijm@tzc.edu.
cn。
　　蛇莓(Duchesneaindica)是蔷薇科(Rosaceae)蛇莓属(Du-
chesnea)多年生草本植物 。蛇莓适应性很强 ,常形成大片强势
群落 ,是一种优良的地被植物 [ 1] 。蛇莓全草入药 ,具有清热 、
凉血 、消肿、解毒的功效 。蛇莓果实含有丰富的糖类 、蛋白质 、
单宁 、木栓酮 、羽扇豆醇 、β香树脂素 、β谷田醇 、维生素 E和
丰富的红色素 。蛇莓种子中占油脂含量 53%的成分是营养
保健价值很高的亚油酸 ,是一种开发前途十分广阔的植物资
源 [ 2 ] 。但对于蛇莓遗传变异的研究还未见报道 。
简单序列重复区间(inter-simplesequencerepeat, ISSR)
是由 Zietkiewicz等 [ 3]在 1994年创建的一种基于微卫星序列
的多态性分子标记 。其原理是根据真核生物基因组中广泛存
在的简单重复序列(simplesequencerepeat, SSR)设计出各种
能与 SSR序列结合的单一引物 ,对 2个相距较近 、方向相反
的 SSR序列之间的 DNA区段进行扩增 。 ISSR标记通常为显
性标记 ,呈孟德尔式遗传 ,具有很好的稳定性和多态性 [4 ] ,现
已广泛用于植物品种鉴定 、遗传作图 、基因定位及遗传多样性
等方面的研究 [ 5] 。但 ISSR是基于 PCR的一种分子标记技
术 ,易受多种因素的干扰 ,为了获得重现性 、可靠性较高的结
果 ,应先对影响 PCR反应的各因子进行优化筛选 ,建立一个
合适的 PCR反应体系 。本研究以蛇莓基因组 DNA为模板 ,
采用单因素试验对 ISSR反应体系进行优化 ,为进一步开展蛇
莓资源遗传多样性的研究奠定技术基础 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
供试蛇莓于 2008年 6月采自浙江省临海市 。叶片用硅
胶干燥 ,密封贮存 ,带回实验室后备用 。
1.2　DNA提取和定量
采用改进的 SDS法 [ 6]进行蛇莓基因组 DNA的提取 。
DNA经 0.8%琼脂糖凝胶电泳分析 ,于上海天能 GIS凝胶成
像分析系统拍照定量 。将 DNA稀释成 20ng/μl,贮存于 -20
℃冰箱中备用 。
1.3　ISSR扩增
ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学提供的序列(SetNo.
9 , No.801 ～ 900),由上海生工生物工程公司合成 。原初 ISSR
扩增的 10 μlPCR反应体积中含:1×Taq酶配套缓冲液(10
mmol/LTris· HCl, pH值 9.0;50 mmol/LKCl;0.1% TritonX
-100), 1.5 mmol/LMgCl2 , 0.15 mmol/L4 ×dNTP, 1 mg/ml
牛血清白蛋白(bovineserumalbumin, BSA), 10 ng模板 DNA,
6 pmol引物(上海捷瑞生物工程公司), 0.6UTaqDNA聚合
酶(北京鼎国生物工程公司)。反应在美国伯乐公司生产的
PTC-220PCR仪中进行 。采用降落式 PCR扩增程序:94℃
预变性 5 min, 94 ℃变性 1min, 56℃退火 1 min(每隔 1个循
环下降 0.5℃), 72 ℃延伸 1 min,共 10个循环;94 ℃变性 1
min, 50 ℃退火 1 min, 72℃延伸 1min,共 25个循环;72℃完
全延伸 5 min。
1.4　扩增产物的鉴定
扩增产物在 1.6%琼脂糖凝胶(0.5×TBE,含 0.5 μg/ml
溴化乙锭)上进行电泳分析 ,于上海天能 GIS凝胶成像分析
系统拍照保存 。
1.5　试验设计
ISSR-PCR扩增反应体系的优化按常规采用单因素试
验 ,共试验了 6个因素 ,每个因素各设置了 4个梯度 ,如表 1
所示 ,其余条件同 1.3。
表 1　蛇莓 ISSR-PCR体系优化的因素与水平
水平 Mg2+浓度(mmol/L)
dNTP浓度
(mmol/L)
Taq酶
用量(U)
模板 DNA
用量(ng)
BSA浓度
(mg/ml)
引物用量
(pmol)
1 1.5 0.1 0.5 5 0 6
2 1.75 0.15 1 10 2 12
3 2.0 0.2 1.5 15 4 18
4 2.25 0.25 2 20 6 24
2　结果与分析
2.1　Mg2 +浓度对 ISSR扩增的影响
Mg2 +浓度是制约 PCR扩增结果的一个重要因素 。在本
研究中 , Mg2+浓度对 ISSR带的数量和强弱影响较小 , Mg2 + 4
个不同浓度梯度处理中均有明显并清晰的扩增产物 ,带型变
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DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2009.02.080
化较小(图 1)。当浓度 Mg2+为 1.5 mmol/L时 ,小分子量的
条带不是很明显;随着 Mg2 +浓度的增加 ,模板与引物的匹配
程度下降 ,从而会导致 PCR扩增的准确性下降 。因此 ,我们
选择 1.75 mmol/L为该试验 Mg2 +的最适浓度 。
2.2　dNTP浓度对 ISSR扩增的影响
dNTP作为 PCR反应的原料参与新链 DNA的合成过程 ,
所以其浓度变化对 ISSR带的强弱有影响(图 1)。当 dNTP浓
度为 0.1 mmol/L时 ,条带较弱;当浓度增加到 0.15 mmol/L
时 ,条带变亮 ,清晰度增强;当浓度进一步增加时 ,带型变化不
大 ,但清晰度增加;而当浓度增加到 0.25 mmol/L时 ,有些条
带亮度减弱 。因此 ,确定 0.2mmol/L为最适 dNTP浓度 。
2.3　BSA浓度对 ISSR扩增的影响
BSA的添加可以屏蔽反应体系中的一些杂质 ,提高扩增的
效率 [ 7] 。 BSA浓度的变化对 ISSR带的数量和强弱的影响较大
(图 1),当不添加 BSA时 ,没有条带出现;当 BSA浓度增加到 2
mg/ml时 ,出现明显 、清晰的条带;但当 BSA浓度升高至 4
mg/ml以上时 ,虽然条带还是比较清晰 ,但大分子量的条带缺
失 。所以我们选择 2mg/mldNTP作为该试验的最适浓度 。
2.4　模板 DNA用量对 ISSR扩增的影响
适宜的模板 DNA浓度是保证特异性扩增的前提 ,不同的
扩增材料对模板 DNA浓度的需要也各不相同 。由图 1可知 ,
本试验中蛇莓基因组模板 DNA浓度对扩增结果影响不大 , 4
个浓度梯度模板 DNA均可扩增出清晰的条带 ,由于本试验采
用的 DNA为粗提物 ,未经后续纯化 ,因此采用的模板 DNA用
量为 10ng,以减少杂质的干扰 。
2.5　TaqDNA聚合酶用量对 ISSR扩增的影响
由图 1可知 , Taq酶浓度的变化对扩增结果影响不大 , 4个
梯度用量下均可扩增出清晰的条带 。由于 Taq酶用量的增多
会增加试验成本 ,而且容易产生非特异性扩增产物 ,因此 ,我们
选择 10μlPCR反应体系中 , Taq酶的最适用量为 0.5U。
2.6　引物浓度对 ISSR扩增的影响
引物浓度关系到扩增产物的质量 。浓度太低 ,它与 DNA
模板结合位点少 ,不能进行有效的扩增;浓度太高 ,则会促使
引物错误地引导非特异产物二聚体的生成 。从图 1可以看
出 ,当引物浓度为 18pmol时 ,条带明亮;当浓度增加时 ,条带
的清晰度下降;当浓度降为 6或 12 pmol时 ,条带的清晰度也
下降 。因此 ,我们选择 10 μlPCR反应体系中 ,最适引物浓度
为 18pmol。
3　结论
ISSR分子标记技术基于 PCR反应 , 其扩增条带虽较
RAPD标记稳定 ,但是也受到反应条件变化以及物种不同的
影响 。本试验结果表明 ,采用不同的反应体系会对 ISSR扩增
产生较大的影响 ,合适的 PCR参数是保证 ISSR扩增效果的
基本条件 。经过对反应体系的筛选优化 ,确立了可用于蛇莓
ISSR分析最适宜的扩增条件 ,即 10 μlPCR反应体积中含:1
×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10 mmol/LTris· HCl, pH值
9.0, 50 mmol/LKCl, 0.1% TritonX-100 ), 1.75 mmol/L
Mg2 + , 2mg/mlBSA, 0.2 mmol/L4×dNTP, 10 ng模板 DNA,
18 pmol引物 , 0.5 UTaqDNA聚合酶 。该反应体系的建立将
为后续试验和遗传分析奠定理论和技术基础 。
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—56— 江苏农业科学　2009年第 2期