全 文 ：果 树 学 报 2012，29（4）: 589~592
Journal of Fruit Science
欧李离体叶片再生体系的建立
姚 婷，张开春 *，闫国华，王 晶，张晓明
（北京市农林科学院林业果树研究所，北京 100093）
摘 要: 【目的】以欧李试管苗叶片为外植体进行不定芽再生研究，以期为核果类果树的品种改良、基因遗传转化和
功能验证等生物技术育种奠定一定的基础，【方法】 使用不同的基本培养基和激素组合促进其不定芽再生并建立再
生体系。 【结果】结果表明，欧李幼芽增殖对基本培养基类型较敏感，改良 MS 培养基优于 MS、F14 和 WPM。在 MS（改
良）+NAA 0.1 mg·L-1+BA 0.2 mg·L-1培养基上，增殖系数为 5.6，增殖效果较好。 离体叶片不定芽再生的最适植物生长
调节剂组合为 MS（改良）+TDZ 4.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1，再生率达到 63.1%，平均每外植体再生芽数为 4.9。 暗培养
10 d 可以提高不定芽再生率。 再生不定芽 1/2 MS（改良）+IBA3.0 mg·L-1培养基上生根率最高，生根率达 93.3%。 【结
论】在改良 MS 培养基上 TDZ 与 IBA 组合诱导不定芽再生的效果最好。
关键词: 欧李； 不定芽； 再生
中图分类号：S662．3 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2012)04－0589－04
Adventitious shoot regeneration from leaf in vitro of Prunus humilis
YAO Ting， ZHANG Kai-chun*， YAN Guo-hua，WANG Jing， ZHANG Xiao-ming
（Institute of Forestry and Pomology， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science，Beijing 100093 China）
Abstract： 【Objective】 In order to lay the foundation for cultivar improvement of stone fruits， genetic
transformation and functional verification of biotechnology breeding，we studied adventitious shoot regen-
eration system of Prunus humilis Bge. using leaf explants． 【Method】 Different basic media and growth reg-
ulator combinations were tested for the adventitious shoot regeneration system． 【Result】 The results
showed that shoot proliferation was sensitive to basic media，and medium MS (modified) was better than
MS， F14 and WPM. For multiplication culture，the multiplication coefficient was 5.6 in MS （modified）+
NAA0.1 mg·L-1+BA 0.2 mg·L-1．The optimum plant growth regulators for adventitious shoot regeneration
were MS (modified) + TDZ 4.0 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1 with regeneration rate of 63.10% ．The average
amount of regenerated buds for each explant was 4.9． TDZ was more effective than BA and ZT in inducing
adventitious shoot regeneration． Dark treatment for 10 days could increase the rate of shoot regeneration．
The best medium for rooting was 1/2MS (modified) + IBA3.0 mg·L-1 with the rooting rate of 93.3%． 【Con-
clusion】 The best regeneration efficiency was obtained with TDZ plus IBA in MS（modified）medium．
Key words： Prunus humilis Bge.； Adventitious buds； Regeneration
欧李（Prunus humilis Bge. ）别名钙果，蔷薇科樱
桃属[1]，是我国特有的一种极矮的落叶小灌木果树，
主要分布在我国的北部地区， 欧李的生物类群和果
实类型繁多，是宝贵的育种材料。欧李生产发展速度
较快，成为核果类研究中的热点。但是核果类果树离
体再生普遍较为困难， 而核果类的很多特有基因功
能并不能在拟南芥、烟草等模式植物上验证。欧李具
有开花早、结果早、根系发达、抗盐碱和干旱等一系
列优点， 是一种非常适合深入研究核果类果树的模
式树种。樱桃属中，再生体系成熟的有对樱桃不定根
再生[2]，以杂种樱桃砧木 colt 根为外植体诱导再生不
定芽[3]，以樱桃砧木 Prunus subhirtella 无菌苗叶柄为
收稿日期： 2011－10－08 接受日期: 2012－03－19
基金项目： 北京市科技新星计划（2007B042）；北京市科技新星计划（2010B025）；公益性行业（农业）科研专项经费（200903019）；北京市农
林科学院科技创新能力建设专项（KJCX201102003）；北京市农林科学院一般项目（编号 2010A005）
作者简介： 姚婷，女，硕士。 Tel: 010-62595564，E-mail: yaoting_324@yahoo.com.cn
觹 通讯作者 Author for correspondence． Tel: 010-62595564，E-mail: zkc365@gmail.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.04.019
果 树 学 报 29 卷
表 1 不同基本培养基对欧李生长的影响
Table 1 Effects of different medium on proliferation of
Prunus humili
基本培养基
Basic medium
外植体（芽）状态
Growth of explant
MS
MS（改良 Modify）
F14
WPM
无生长变化
No growth
有生长无增殖
Growth and non-proliferation
黄化、生长点枯死
Yellowing and death of growing point
无生长且黄化
No growth and yellowing
外植体进行不定芽再生研究[4]，欧李的快繁体系建立
也有报道[5-7]。建立欧李离体叶片再生体系，以期为核
果类果树的品种改良、 基因遗传转化和功能验证等
生物技术育种奠定一定的基础。
1 材料和方法
1.1 材料
试验用欧李材料取自北京农林科学院林业果树
研究所。 2010年 4月将从田间剪取的幼嫩上部枝或
基生枝去叶留茎经过 75%酒精、0.1%升汞消毒后，
切取 0.5 mm 左右的茎尖做初代培养，培养基为 MS+
BA0.5 mg·L-1。
当芽萌发至 1.0～2.0 cm 时以单芽接入 MS、改良
MS（钙盐、铁盐含量各增加 1/4）、F14 和 WPM 培养
基，30 d 后观察结果以筛选出继代最适的基本培养
基。 在此基础上接种于 NAA0～0.2 mg·L-1、 BA0.1～
0.4 mg·L-1，筛选出增殖继代最适的植物生长调节剂
组合培养基。 培养温度为（25±1） ℃，光照强度 2.0
klx，光照时间 16 h/d。 每个处理接 20个单芽，重复 3
次。 40 d统计增殖率。
1.2 离体叶片不定芽再生
取 20～30 d 叶龄的增殖继代组培苗上幼嫩、平
展的叶片，形状色泽基本一致，使外植体在生理状态
上基本保持一致，剪去叶边缘，剪成 0.25 cm2大小的
叶块。 （1）接种于不同浓度的 BA、TDZ、NAA 和 IBA
的培养基， 研究不同浓度激素配比对欧李不定芽再
生的情况，筛选出不定芽诱导的最适培养基。 （2）将
外植体分别接种于分化培养基上暗培养 0、5、10、15
d，研究暗培养时间对不定芽再生的影响。（3）将叶片
以正、反 2种放置方式接种于再生培养基上，研究外
植体不同放置方式对不定芽再生的影响。
每个处理接 30个外植体，重复 3次。 以上培养
基均以 MS（改良）为基本培养基，附加蔗糖 30 g·L-1、
琼脂 6.0 g·L-1，pH 为 5.8。 培养温度为（25±1）℃，光
照强度 2.0 klx，光照时间 16 h/d。
不定芽再生率和平均每外植体再生芽数根据以
下公式计算:
不定芽再生率 （%）=（再生不定芽外植体总数/
接种外植体总数）×100
平均每外植体再生芽数（%）=（外植体再生不定
芽总数/再生不定芽外植体数）
1.3 再生不定芽的伸长与生根
将再生不定芽接种于 MS（改良）+BA0.2 mg·L-1
培养基中进行芽伸长培养，待芽长至 2～3 cm 时从基
部切下，转至生根培养。 以 1/2 MS（改良）为基本培
养基，附加不同浓度的 NAA和 IBA。 每个处理接 30
个外植体，重复 3次。 30 d后统计生根情况，生根率
（%）=生根株数/诱导株数×100。 光照强度为 1.5 klx，
光照时间为 14 h/d。
2 结果与分析
2.1 不同基本培养基对欧李生长的影响
不同培养基 MS、MS （改良）、F14 和 WPM 对欧
李茎尖萌发芽生长的影响见表 1，MS 培养基中所接
入的芽状态基本没有变化，MS（改良）培养基中芽约
生长了 0.5～1.0 cm 高没有明显增殖现象。 F14 和
WPM 培养基中均出现严重黄化现象，1 周后从嫩叶
叶尖开始退绿， 并逐渐发展到整个植株， 叶尖呈钩
状， 叶边缘发枯，F14 培养基中芽的生长点最终枯
死。 本实验选用改良 MS 培养基为欧李组织培养的
基本培养基。
2.2 不同浓度激素配比对欧李增殖的影响
从表 2可知， 随着激素浓度增加欧李的增殖系
数也随之增加。当 NAA0.2 mg·L-1+BA0.6 mg·L-1时欧
李的增殖系数最大， 达到 10.5。 但是当 BA 浓度为
0.4、0.6 mg·L-1，欧李生长茎纤细、瘦弱，叶片也非常
细小且有部分玻璃化， 此种状态非常不利于后期的
离体叶片再生。 激素组合为 NAA0.1 mg·L-1+BA0.2
mg·L-1时，接种 3 周表现出生长迅速、增殖快，叶大
而绿，植株健壮。 最终确定 MS（改良）+NAA0.1mg·L-1+
BA0.2 mg·L-1为欧李的增殖继代培养基。
2.3 不同浓度激素配比对欧李不定芽再生的影响
外植体接入培养基 3 d 后， 大多数叶片开始膨
大卷曲，7～10 d切口边缘生成少量的愈伤组织，由白
色逐渐变成绿色， 随后这些组织中进一步分化成芽
或者由伤口处直接再生为不定芽（图版-A，B）。不定
芽有的呈单个分布，有的则连成芽丛。随着培养时间
590
4 期
表 6 不同浓度激素配比对欧李不定芽生根的影响
Table 6 Effect of different concentrations of hormones on
the rooting of Prunus humili
植物生长调节剂
Growth regulator/（mg·L-1）
生根率
Root regeneration
rate/%
根生长状态
Growth state of root
IBA NAA
0.5
1.0
2.0
3.0
0.5 0.25
0.50
1.00
2.00
0.0 e
3.7 e
18.2 d
93.3 a
29.0 c
53.8 b
83.3 a
100.0 a
+
+
+++
++++
+
+
+
++
注: 1. 以 1/2MS（改良）为基本培养基；2. +：根长势弱；++：根长势较
弱；+++：根长势较强；++++：根长势强。
Note: 1. 1/2MS（modify）is the basic medium； 2. + means the roots with
very weak growth vigour；++ means the roots with weak growth vigour；
+++ means the roots with strong growth vigour；++++ means the roots with
very strong growth vigour.
平均每外植
体再生芽数
No. of buds
per explantTDZ BA ZT NAA IBA
1.0
1.0
2.0
4.0
4.0
4.0
4.0
6.0
2.0
4.0
2.0
3.0
4.0
6.0
2.0
4.0
0.1
0.2
0.1
0.1
0.2
0.2
0.1
0.2
0.2
0.1
0.2
0.2
0.2
0.2
0.0
0.0
1.0
1.0
1.0
1.6
2.5
2.8
3.8
4.1
4.9
2.3
2.2
5.0
0.0
1.0
不定芽再生率
Shoot
regeneration
rate/%
0.0 d
0.0 d
0.5 d
0.6 d
1.1 d
2.5 d
2.7 d
3.4 d
16.5 c
38.9 b
63.1 a
36.8 c
11.4 d
67.4 a
0.0 d
0.9 d
0.5
1.0
生长调节剂
Growth regulator/（mg·L-1）
2，4-D
表 5 叶片不同放置方式对欧李不定芽再生的影响
Table 5 Effect of leaf placing manner on adventitious
shoot regeneration
每外植体再生数
No. of buds
per explant
4.9
5.1
叶片放置方式
Leaf placing manner
正放(远轴面向下)
Abaxial surface touch medium
反放(远轴面向上)
Inaxial surface touch medium
不定芽再生率
Shoot regeneration
rate/%
63.1 a
62.9 a
注: 培养基中都附加 TDZ 4.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1。
Note: Supplement TDZ 4.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1 to the medium.
表 4 暗培养时间对欧李不定芽再生的影响
Table 4 Effects of dark culture on adventitious shoot
regeneration
暗培养时间
Days of dark treatment/d
不定芽再生率
Shoot regeneration rate/%
0
5
10
15
43.5 b
44.7 b
63.1 a
62.1 a
表 2 不同浓度激素配比对欧李增殖的影响
Table 2 Effects of different hormone combinations on bud
proliferation of Prunus humili
表 3 不同浓度激素配比对欧李不定芽再生的影响
Table 3 Effects of different growth regulator combinations
on adventitious shoot regeneration of Prunus humili
增殖系数
Multiplication coefficient
2.4 c
5.6 b
8.2 a
10.5 a
NAA
/（mg·L-1）
0.0
0.1
0.2
0.2
BA
/（mg·L-1）
0.1
0.2
0.4
0.6
姚 婷等: 欧李离体叶片再生体系的建立
延长， 叶片再生频率和叶片再生不定芽数量开始增
加。 光照培养 40 d后，叶片再生频率不再增加，以后
仅不定芽伸长形成不定梢（图版-C）。
在改良 MS 培养基中附加不同浓度的 BA、
TDZ、ZT、IBA、NAA 和 2，4-D，结果表明，植物生长
调节剂对离体叶片不定芽再生影响很大（表 3）。 细
胞分裂素 BA、ZT 对叶片再生不定芽效果均不明显，
如 BA 加到 6.0 mg·L-1配合 IBA 0.2 mg·L-1叶片不定
芽再生率只有 2.5%。使用 TDZ可以显著提高叶片不
定芽再生率[8-11]，TDZ 4.0、6.0 mg·L-1和 IBA 0.2 mg·L-1
配合使用可以显著提高叶片不定芽再生率， 随着
TDZ浓度升高，不定芽玻璃化现象也随之严重，综合
考虑 TDZ浓度为 4.0 mg·L-1为最佳。
2.4 暗培养时间对欧李不定芽再生的影响
不定芽再生经过暗处理可显著提高再生率。但暗
处理时间不宜过长，最佳暗培养时间为 10 d（表 4）。
2.5 叶片不同放置方式对欧李不定芽再生的影响
通过对叶片不同放置方式的处理，结果表明，外
植体叶片分别以远轴面接触培养基（简称正放）与叶
片近轴面接触培养基（简称反放）两种方式放置，对
不定芽的再生影响不大， 但欧李叶片正放要比反放
再生效果稍好（表 5）。 考虑到不定芽多数从叶片近
轴面向上生长，叶片正放生长势好，同时叶片远轴面
气孔较多、组织疏松，与培养基接触容易吸收更多的
养分，所以接种时以叶片正放为宜。
2.6 不同浓度激素配比对欧李不定芽生根的影响
不同浓度激素配比对欧李不定根诱导效果不同
（表 6）。 1/2MS（改良）培养基附加 IBA 和 NAA 均可
注: 以 MS（改良）为基本培养基。 不同字母表示经 Duncan’s 测验，
P=0.05 水平差异显著。 下同。
Note: MS（modified）is the basic medium. Different letter shows signifi-
cance at P=0.05 by Duncan’s test. The same below.
注: 培养基中附加 TDZ 4.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1.
Note: Supplement TDZ 4.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1 to the medium.
591
以诱导生根。 不同的是 NAA诱导生根较早，最初生
成大量愈伤组织，同时愈伤组织分化出根，但是生出
的根较细，长势弱，由于愈伤组织疏松，分化出来的
根很容易与母体分离断裂（图版-D）。 IBA诱导生根
稍晚 10 d 开始生根，15～20 d 为生根高峰期，根的长
势强，愈伤组织少且致密，大多从基部切口处直接生
根。 因此，1/2MS（改良）+IBA3.0 mg·L-1为最适生根
培养基。
3 讨 论
本研究表明， 欧李增殖培养对基本培养基类型
较敏感。 MS、MS（改良）基本培养基是高盐培养基，
无机盐浓度高，且有机成分全，含量丰富；WPM 基本
培养基是中等无机盐含量的培养基； 而 F14培养基
中铁盐含量较低。 这说明高无机盐和高有机含量的
基本培养基能满足欧李的生长需要， 而低无机盐量
和低有机含量的基本培养基上基本不能满足欧李的
生长需要。 其中，MS、MS （改良 ） 基本培养基中
NH4NO3含量较高，是 WPM 和 F14 培养基中的 4 倍
以上， 欧李在 F14 和 WPM 培养基上生长均有严重
的叶片黄化现象。 因此，NH4NO3是欧李正常生长的
一种关键无机盐。 同时，欧李在 MS、F14和 WPM 基
本培养基上均有不同程度的生长点和叶边缘枯死现
象，以在 F14培养基上最为严重，这与植物典型的缺
钙、铁症状表型相似。 MS（改良）培养基中钙、铁离子
浓度最高，且在此培养基上欧李生长健壮，说明欧李
对钙、铁离子的吸收比一般植物高。
欧李在改良 MS 基本培养基上能够继续缓慢的
生长且保持植株健壮，说明 NH4NO3、钙、铁离子对欧
李的生长尤为关键。
植物激素的种类和浓度是植物离体再生培养的
关键因素。 本研究发现细胞分裂素是欧李分化不定
芽所必需的， 特别是 TDZ 具有极高的细胞分裂活
性，与 IBA 配合使用能有效地诱导欧李不定芽的再
生，并能大量增殖丛生芽。 Thomas 等 [8]认为 TDZ 可
诱导细胞分裂素的生物合成， 并可抑制内源生长素
的降解，促进外植体分化。生长素类 NAA、IBA、2，4-
D等都对各自的外植体再生有不同的作用。 附加生
长素 NAA后，外植体较多生长结构疏松颜色发白的
愈伤组织。 而附加 IBA 则愈伤组织较少，且结构致
密颜色发绿，此种愈伤组织有利于不定芽的分化。另
外，与闫国华等 [2]研究的附加 2.0 mg·L-1 2，4-D 能提
高对樱桃的不定芽再生率不同， 本实验中附加 0.5、
1.0 mg·L-1的 2，4-D，随着质量浓度的增高，不定芽
的再生能力降低且再生率偏低。 说明植物基因型不
同，对植物生长调节剂的种类和浓度要求也不同。
暗培养也是建立欧李高效再生体系的一个重要
因素。 暗处理时间过长或过短对外植体再生都会产
生不利的影响， 时间过短则会造成脱分化没有顺利
完成，降低了不定芽的再生频率；时间过长离体外植
体往往会形成大量愈伤组织，且愈伤组织结构疏松，
颜色发白或粉红，形成的不定芽量也明显减少，再生
频率降低。 （本文图版见插 1）
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